鼠胚胎培養(yǎng)在輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究

趙利，姚鵬

（黃河三門峽醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，河南 三門峽 472000）

生殖是人類生命延續(xù)的自然過程，由于人類生存環(huán)境的污染及各種物理化學(xué)因素的作用，導(dǎo)致卵子、精子的質(zhì)量下降，影響了人類的正常生殖活動(dòng)［1］。為延續(xù)生命過程，輔助生育技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生，其中以體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）為主的輔助生殖技術(shù)已廣泛應(yīng)用于不孕癥的治療中，但受孕率卻不盡如人意［2］。研究［3-5］表明，胚胎質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)成功與否的關(guān)鍵因素，而影響其生存、發(fā)育的因素較多，如促超排卵方案的應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)中采卵及采精的過程以及其他還未意識(shí)到的因素，因此質(zhì)量控制是輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中較為重要的內(nèi)容就是檢測各種器皿及試劑對(duì)胚胎是否存在有害的內(nèi)毒素。小鼠培養(yǎng)是監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境的重要指標(biāo)，因此本研究以小鼠體內(nèi)外受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性昆明白鼠，4～6 周齡，體重（20.35±2.03）g；雄性昆明白鼠，8 周齡以上，體重（30.25±3.11）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2012-0002。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫20℃～25℃，12 h 晝夜交替。

1.1.2 言要試劑 注射用孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）、絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG）（杭州動(dòng)物藥品廠），以10 mL 0.9%生理鹽水將其溶解，于-20℃分裝保存；卵裂液（CSC）、人輸卵管液（human tubal fluid, HTF）、HEPES 緩沖的人輸卵管液（modified human tubal fluid, mHTF）、合成血清蛋白（SSS）（歐文公司產(chǎn)品）、胚胎處理液、洗精受精液、卵裂胚培養(yǎng)液G1、囊胚培養(yǎng)液G2、人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）（瑞典Vitrolife 公司）等。

1.1.3 言要儀器 恒溫超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)皿、二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（德國）、解剖顯微鏡、倒置顯微鏡（日本）、三氣培養(yǎng)箱（丹麥）、CO2濃度檢測儀（德國）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠超排卵 選取雌鼠于實(shí)驗(yàn)前4 d 的16∶00 時(shí)腹腔內(nèi)注射 PMSG 10 IU/只（0.1 mL），48 h后于腹腔內(nèi)注射hCG 10 IU/只（0.1 mL）。

1.2.2 體內(nèi)外受精實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)將小鼠分為體內(nèi)受精與體外受精組。體內(nèi)受精組：在注射hCG 后將雌雄按照1∶2 的比例進(jìn)行合籠，次日早上觀察雌鼠有無陰栓。對(duì)于有陰栓的雌鼠以頸椎脫臼法處死，在無菌條件下取其輸卵管，洗滌3 次后，用針頭套在輸卵管傘上，收集2 期胚胎，于37℃下，在6%的CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄40 h、46 h、64 h 胚胎發(fā)育情況。體外受精組：在注射hCG 15～16 h 后，以頸椎脫臼法處死雌鼠，于無菌環(huán)境下取出輸卵管，沖洗3 次后，在體視鏡下，用注射針套刺破輸卵管膨大部位，使其卵子團(tuán)釋放出來，并將其收集至G-IVF 受精液中，于37℃下，在6%的CO2濃度培養(yǎng)箱中等待受精。以同樣的方法處死雄鼠，無菌環(huán)境下取出附睪尾，沖洗3次后用鑷子輕輕取出精子，收集精子懸液于含有G-IVF 液的試管中，獲能后，取適量精子懸液加入到含有卵子團(tuán)的G-IVF 液中，移于37℃下、6%的CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。而后在受精4 h 將卵子移入另一個(gè)含有G-IVF 液的受精皿中培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，兩組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體外受精結(jié)果

本研究進(jìn)行了3 個(gè)批次共21 個(gè)周期的小鼠體外受精實(shí)驗(yàn)，共獲卵968 枚，其中原核受精卵765 枚，受精率 79.03%，2-細(xì)胞數(shù) 704 枚，卵裂率92.03%，2-細(xì)胞形成囊胚552 個(gè)，囊胚形成率為78.41%，見表1。

2.2 小鼠體內(nèi)受精結(jié)果

本研究進(jìn)行了13 個(gè)周期的體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)，共獲卵472 個(gè)，其中原核受精胚367 個(gè)，受精率為77.75%，2-細(xì)胞數(shù)351 枚，卵裂率95.64%，2-細(xì)胞形成囊胚286 個(gè)，囊胚形成率為81.48%，見表2。

表1 小鼠體外受精結(jié)果

表2 小鼠體內(nèi)受精結(jié)果

2.3 小鼠胚胎體內(nèi)外受精結(jié)果比較

體內(nèi)外受精組的受精率分別為（77.64±5.38）% 、（79.01±1.24）% ， 卵 裂 率 分 別 為（95.48±1.06）%、（92.04±1.01）%，囊胚形成率分別為（81.42±1.13）%、（78.15±0.98）%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

隨著人類輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，IVF-ET技術(shù)已成為當(dāng)前治療不孕癥的主要手段，但在輔助生殖的過程中有很多環(huán)節(jié)會(huì)影響胚胎質(zhì)量，導(dǎo)致患者的平均妊娠率較低。其中實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)環(huán)境是較為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，因此需要在該過程中有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制系統(tǒng)及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室操作程序，以盡可能地降低各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)胚胎潛在的危害，保證胚胎質(zhì)量［6-7］。1985 年 ACKERMAN 等首次嘗試用2-細(xì)胞鼠胚作為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的方法，由于鼠胚與人胚有著近乎相同的發(fā)育歷程，因此鼠胚是監(jiān)測人早期胚胎體外發(fā)育環(huán)境的最好模式，可用來監(jiān)測人類輔助生殖技術(shù)的幾乎所有程序［8-9］。通過對(duì)IVF 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制，并提高相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員的操作水平，從而保證IVF 技術(shù)操作的準(zhǔn)確性及可靠性。

研究［10］顯示，鼠胚胎的體外受精較體內(nèi)受精對(duì)胚胎發(fā)育的影響因素更加敏感，因而更有利于監(jiān)測出對(duì)胚胎發(fā)育不利的因素。由于實(shí)驗(yàn)室是體外孕育胚胎的唯一場所，而受精卵與早期胚胎對(duì)微環(huán)境的要求較高，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的變化十分敏感，因此在實(shí)驗(yàn)需在無菌、無毒及無污染的環(huán)境中進(jìn)行［11-13］。本研究通過對(duì)體內(nèi)外受精兩組方法的對(duì)比，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行了全面的質(zhì)量評(píng)估，結(jié)果顯示，兩組在受精率、卵裂率、囊胚形成率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各項(xiàng)指標(biāo)均符合人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。筆者在實(shí)驗(yàn)過程存在一些問題：溫度設(shè)置欠佳時(shí)，會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)生不可逆的損傷，需要借助加溫裝置，使溫度維持在37℃，以提高受精率與懷孕率；光照時(shí)間延長會(huì)影響早期胚胎發(fā)育；若技術(shù)人員操作不夠熟練，導(dǎo)致操作時(shí)間過長，也會(huì)影響胚胎的后續(xù)發(fā)育；此外選擇周齡較長的雌鼠，會(huì)使排卵效果降低，導(dǎo)致配子的質(zhì)量下降。

綜上，鼠胚實(shí)驗(yàn)過程中的較多因素會(huì)影響受精率、囊胚形成率等，因此需盡可能地控制影響胚胎發(fā)育的可控因素，同時(shí)還需提高實(shí)驗(yàn)人員的操作技能等。因而在輔助生殖實(shí)驗(yàn)中，利用鼠胚實(shí)驗(yàn)可建立一套健全、完整的質(zhì)量控制體系以確保培養(yǎng)環(huán)境及系統(tǒng)的可靠性，能為臨床診治提供依據(jù)。