3例極早發(fā)炎癥性腸病患兒及其父母IL-10RA基因序列分析

張伯瑋,李揚(yáng),任靜,王鑫

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052

炎癥性腸病(IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)和未分型結(jié)腸炎，以腹痛、腹瀉、便血和營(yíng)養(yǎng)吸收障礙為主要特征，也有不典型癥狀的報(bào)道如新生兒期小腸廣泛壞死[1]。極早發(fā)IBD主要發(fā)生于6歲以前，且發(fā)病率逐漸增加，占兒童IBD的4%～10%[2～4]。極早發(fā)IBD以單基因異常為主，我國(guó)則以IL-10、IL-10RA及IL-10RB基因缺陷為主[5]。極早發(fā)IBD可因癥狀不典型而誤診、漏診，從而影響預(yù)后甚至危及生命。本研究中，我們檢測(cè)了3例極早發(fā)IBD患兒及其父母IL-10RA基因序列，并對(duì)其進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年9月～2019年6月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心收治3例極早發(fā)IBD患兒，其中男2例、女1例，分別于生后7～11 d發(fā)病，其中1例(例1)于1月齡死亡，患兒父母于本院行遺傳咨詢；另2例于2～8個(gè)月因“腹瀉伴體質(zhì)量不增、排黏液血便、擬行遺傳咨詢”就診于本院。3例患兒分別來自3個(gè)無親緣關(guān)系的家庭，父母健康，均非近親結(jié)婚。2例患兒(例1，2)為足月兒并經(jīng)自然分娩，1例(例3)因羊水過少于38周剖腹產(chǎn)娩出，3例患兒家庭均無陽(yáng)性家族史。

3例患兒分別于生后7～11 d以腹瀉及黏液血便起病，每日腹瀉十余次，均伴發(fā)熱；患兒炎性指標(biāo)(C反應(yīng)蛋白及血沉)均增高；患兒血培養(yǎng)、TORCH、便培養(yǎng)及大便輪狀病毒檢查等病原學(xué)檢查陰性；經(jīng)抗感染治療患兒腹瀉未有顯著好轉(zhuǎn)；1例于生后7 d起病，伴高熱，抗感染治療后緩解不明顯，外院予“新生兒肺炎，非感染性腹瀉”診斷，予抗炎、利尿、強(qiáng)心及支持治療，逐漸出現(xiàn)口腔潰瘍、皮疹、肛周膿腫、重度貧血及重度營(yíng)養(yǎng)不良，于1月齡因“新生兒肺炎，壞死性小腸結(jié)腸炎？”死亡。另外兩例分別于生后10 d及11 d起病，均存在口腔潰瘍及營(yíng)養(yǎng)不良，均有糞鈣衛(wèi)蛋白水平增高，其中1例有貧血及肛周膿腫。2例患兒分別行內(nèi)鏡檢查，以結(jié)腸多發(fā)小潰瘍?yōu)橹鳎±硪越Y(jié)腸炎癥、隱窩炎及隱窩膿腫為主要表現(xiàn)，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予“IBD”診斷。

1.2 IBD患兒及其父母基因序列分析 在知情同意的情況下，留取患兒及其父母靜脈血各2 mL，例1血樣為患兒父母于患兒死亡前留取并-20 ℃保存。使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)DP318-03，離心柱型)提取患兒及父母外周血白細(xì)胞DNA。由NCBI網(wǎng)站下載IL-10、IL-10RA及IL-10RB基因DNA全序列(NM_000572、NM_001558、NM_000628)。采用Primer5軟件設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增。膠回收以及純化后，采用雙向測(cè)序法進(jìn)行基因序列分析，然后與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

檢索千人基因組計(jì)劃資料庫(kù)(www.1000genomes.org)，對(duì)照患兒突變，濾過不致病的多態(tài)性位點(diǎn)。利用NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和Bioedit軟件進(jìn)行人類和不同物種IL-10RA蛋白同源性比較，并運(yùn)用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及MutaitonTaster(http://www.mutationtaster.org)軟件進(jìn)行突變的致病性預(yù)測(cè)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的125例經(jīng)IL-10RA基因確診的我國(guó)極早發(fā)IBD患兒基因突變位點(diǎn)。結(jié)合本研究中的患兒基因突變位點(diǎn)制作我國(guó)IL-10RA基因突變譜。

2 結(jié)果

3例患兒于IL-10及IL-10RB基因未見明顯致病性突變。在IL-10RA基因中檢出3種突變，其中已知突變2種[c.299T>G(p.V100G)[6]、c.301C>T(p.R101W)[7]]，未經(jīng)報(bào)道的新突變1種[c.326C>A(p.S109Y)]，于HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中未檢出?；純焊改妇鶠橥蛔兊腎L-10RA基因攜帶者。上述突變均導(dǎo)致IL-10-RA蛋白氨基酸序列改變，見表1、圖1。

經(jīng)Polyphen-2、MutationTaster軟件預(yù)測(cè)及多物種同源性分析，3種突變位點(diǎn)(p.V100，p.R101及p.S109)高度保守，均很可能致病，見表2。中國(guó)極早發(fā)IBD患兒IL-10RA基因突變譜，見圖2、表3。

表1 3例極早發(fā)IBD患兒IL-10RA基因突變情況

3 討論

在我國(guó)極早發(fā)IBD中，IL-10軸，即IL-10、IL-10RA及IL-10RB基因缺陷較為常見[6, 7]。IL-10基因編碼IL-10，是一種免疫抑制因子，目前認(rèn)為IL-10軸缺陷屬于自身免疫性疾病的一種，上述基因在維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中具有重要意義。正常生理?xiàng)l件下，IL-10由多種骨髓來源的細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞等分泌，被激活后可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞的促炎活性，其中樹突細(xì)胞是表達(dá)IL-10R水平最高的細(xì)胞。IL-10R是一種由2條不同的鏈組成的四聚體，即由IL-10RA基因編碼的IL-10受體A(IL-10RA)及由IL-10RB基因編碼的IL-10受體B(IL-10RB)[8]。IL-10與IL-10R的結(jié)合進(jìn)一步激活Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸蛋白質(zhì)激酶2(TYK2)，繼而導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)磷酸化。活化的STAT3在胞質(zhì)內(nèi)形成二聚體后入核，啟動(dòng)核內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄及后續(xù)抗炎的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)抗炎基因的表達(dá)升高[9,10]。

注：例1存在c.301C>T(p.R101W)純合突變；例2存在c.301C>T(p.R101W)及c.326C>A(p.S109Y)復(fù)合雜合突變；例3存在c.301C>T(p.R101W)及c.299T>G(p.V100G)復(fù)合雜合突變。

圖1 3例患兒IL-10RA基因桑格爾測(cè)序結(jié)果

表2 IL-10RA蛋白物種間同源序列

表3 中國(guó)極早發(fā)IBD患兒IL-10RA基因熱點(diǎn)突變譜

注：共有22個(gè)突變被發(fā)現(xiàn)，分布于第2～6外顯子中；3，4外顯子為熱點(diǎn)突變區(qū)域；p.R101W及p.T179T是我國(guó)人群的熱點(diǎn)突變，p.V100G、p.R117H及p.R165X突變也較為常見。

注：ECD：細(xì)胞外區(qū)域；ICD：細(xì)胞內(nèi)區(qū)域；TM：跨膜區(qū)域；SP：信號(hào)肽。

圖2 中國(guó)極早發(fā)IBD患兒IL-10RA基因突變譜

IL-10軸基因缺陷患兒發(fā)病極早。有報(bào)道對(duì)40例極早發(fā)IBD患兒進(jìn)行遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)半數(shù)l歲以內(nèi)起病的患兒中存在IL-10RA基因缺陷[11]。我國(guó)報(bào)道的極早發(fā)IBD患兒多為新生兒期起病的IL-10軸缺陷患兒[1]，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道較為一致。極早發(fā)型IBD常以遷延性腹瀉及結(jié)腸炎為主要表型，可伴隨腹痛、腹脹、黏液血便，生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，貧血、脫水、口角/口腔潰瘍及肛周病變等。肛周病變以腸皮膚瘺、直腸陰道瘺等瘺管形成及肛周膿腫為主[1, 4, 12]。極早發(fā)IBD的全身并發(fā)癥主要因營(yíng)養(yǎng)障礙引發(fā)生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，炎癥引發(fā)反復(fù)感染，毛囊炎、皮疹及B細(xì)胞淋巴瘤可能與免疫異常相關(guān)，也有極早發(fā)IBD合并聽力損傷喪失的報(bào)道[13]。IL-10軸相關(guān)極早發(fā)IBD中，IL-10RB基因缺陷患者的手術(shù)率及B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生率相對(duì)較高[5]。極早發(fā)IBD易于誤診，如誤診為“細(xì)菌性腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎”等[7]。本研究中，3例患兒癥狀典型，以腹瀉起病，C反應(yīng)蛋白及血沉等炎性指標(biāo)異常，經(jīng)抗感染、補(bǔ)液等支持治療后腹瀉緩解不明顯，1例未行腸鏡檢查，于外院考慮因“壞死性小腸結(jié)腸炎”死亡；例2及例3糞鈣衛(wèi)蛋白水平增高，結(jié)合腸鏡及病理檢查結(jié)果，外院予“IBD”診斷，后于我院經(jīng)遺傳學(xué)檢測(cè)確診。

IL-10軸相關(guān)極早發(fā)IBD內(nèi)鏡下可見嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥，以淺表及深部潰瘍?yōu)橹鳎?歲以下的極早發(fā)IBD患兒常因臨床及內(nèi)鏡下不典型癥狀而難以分型，可結(jié)合胃鏡檢查觀察上消化道是否受累從而進(jìn)行鑒別診斷[14]。本研究中，患兒腸鏡以結(jié)腸黏膜炎癥及潰瘍?yōu)橹鳎匆姺歉衫覙尤庋磕[，不除外UC可能。一般認(rèn)為極早發(fā)IBD患兒的自身抗體陽(yáng)性率較低，且尚未發(fā)現(xiàn)特異性自身抗體[15]。本研究中，1例存在輕度抗核抗體及中性粒細(xì)胞抗體水平增高，1例抗體譜未發(fā)現(xiàn)明顯異常，1例未行相關(guān)檢測(cè)，提示抗體譜異常可能無典型臨床意義。

據(jù)報(bào)道，目前已知約60種基因與極早發(fā)IBD直接相關(guān)，大多數(shù)基因與免疫缺陷有關(guān)[14, 16]，我國(guó)極早發(fā)IBD以IL-10軸缺陷為主。在一項(xiàng)對(duì)130例IL-10軸患兒的臨床及遺傳學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)東亞人種患兒IL-10RA基因突變比例極高，約為98.7%，遠(yuǎn)高于其他人種(47.6%)[5]。根據(jù)HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)，目前IL-10RA基因已報(bào)道45種致病突變。IL-10RA基因c.C301T(p.R101W)和c.G537A(p.T179T)為東亞人群的熱點(diǎn)突變，約占70.3%和44.6%，顯著高于其他人種，且28.4%的非親源性患兒均具有相同的基因型，即IL-10RA基因p.R101W / p.T179T復(fù)合雜合突變[5]。

本研究共檢出IL-10RA基因的3個(gè)突變，其中p.R101W突變占4/6等位基因，進(jìn)一步明確了該突變的高發(fā)。p.V100G也是中國(guó)極早發(fā)IBD患兒中較為常見的突變。p.S109Y是未曾報(bào)道的新突變，經(jīng)家系分析及功能預(yù)測(cè)，考慮該突變致病可能性大。另外，在遺傳分析時(shí)，需要注意的是該基因有同義突變致病的報(bào)道，如p.T179T變異[17]。迄今為止，已有125例經(jīng)IL-10RA基因確診的我國(guó)極早發(fā)IBD患兒被報(bào)道。結(jié)合本研究中的患兒，共報(bào)道23個(gè)突變。其中，p.R101W為最熱點(diǎn)突變(119/256等位基因)；p.T179T為次熱點(diǎn)突變(67/256等位基因)；另外，p.V100G、p.R117H、p.R165X在中國(guó)人群中也較為常見(分別占16/256、11/256及11/256等位基因)。

總之，本研究報(bào)道3例極早發(fā)IBD患兒，以遷延性腹瀉、黏液血便為主要表現(xiàn)，存在多種腸外并發(fā)癥。發(fā)現(xiàn)了3個(gè)IL-10RA基因突變，其中1個(gè)為新突變(p.S109Y)，且p.R101W突變?cè)诒狙芯康幕純褐姓?/6等位基因，符合既往文獻(xiàn)對(duì)熱點(diǎn)突變的研究?；純焊改妇鶠樯鲜鐾蛔僆L-10RA基因的攜帶者。對(duì)新生兒期起病的不明原因的腹瀉，尤其伴隨黏液血便、貧血、肛周病變、口腔及口腔潰瘍的患兒，要考慮極早發(fā)IBD的可能，及早進(jìn)行基因檢測(cè)。基因檢測(cè)在極早發(fā)IBD診斷及鑒別診斷中具有決定性作用。