核酸適體-膠體金體系檢測(cè)氯霉素的研究

鐘惠萍，黃巧娥，王 力

（集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021）

氯霉素（ChlorChloramphenicol，CAP）能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的形成，是有效對(duì)抗多種革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌和多種厭氧生物的抗生素，因而被廣泛用于人類和其他生物疾病的防治中.但研究表明其存在較嚴(yán)重的毒副作用，影響人的身體健康和畜水產(chǎn)品貿(mào)易，許多國家已嚴(yán)格禁止在食品動(dòng)物飼養(yǎng)過程中使用，同時(shí)實(shí)施愈來愈嚴(yán)格的監(jiān)控計(jì)劃［1］.但由于其消毒效果良好，價(jià)格便宜，導(dǎo)致有些養(yǎng)殖者還在繼續(xù)使用，因此，發(fā)展快速、靈敏檢測(cè)技術(shù)、降低檢出限成為氯霉素殘留檢測(cè)技術(shù)研究焦點(diǎn)［2］.核酸適體［3］是一種新型仿生生物識(shí)別元素，具有和抗體相媲美的親和力和選擇性，在食品安全領(lǐng)域，多種抗生素物質(zhì)的核酸適體已被成功篩選和應(yīng)用［4］.本研究利用可以特異性識(shí)別氯霉素分子的核酸適體作為識(shí)別元素，結(jié)合膠體金［5］團(tuán)聚后吸光性質(zhì)變化的現(xiàn)象對(duì)氯霉素進(jìn)行檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

氯霉素、氯霉素核酸適體、檸檬酸鈉、氯金酸、氯化鈉、Tris.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金溶液的制備

將100 mL 0.4 g·L-1氯金酸溶液倒入圓底燒瓶中，用封口膜及橡膠圈將瓶口封住，水浴加熱至沸騰，劇烈攪拌下快速加入10 mL10 g·L-1的檸檬酸三鈉溶液.待溶液顏色由深紫色變成酒紅色，繼續(xù)攪拌10 min.將制備好的膠體金溶液冷卻至室溫，裝于瓶中，用錫箔紙包裹，置于4 ℃冰箱中冷藏備用［6］.

1.2.2核酸適體溶液的配制

本實(shí)驗(yàn)所用氯霉素核酸適體堿基序列為：ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G［7］.配制方法如下：取裝有40 nmol氯霉素核酸適體的管子，開蓋前先在4000 rmp離心5min，慢慢打開管蓋，加入100 μL 的純化水，使其濃度為400 μmol·L-1，蓋上蓋后渦旋使之充分混勻，放入-20 ℃儲(chǔ)藏備用.

1.2.3 核酸適體包被膠體金制備

取1 mL上述合成的膠體金與1 μL氯霉素核酸適體溶液，室溫下置于震蕩器中混合1 h，在4 000 rmp離心20 min，取下層沉淀物分散于2 mL pH=7.4 的Tris-HCl 緩沖液中，得到氯霉素核酸適體包被的膠體金［8］.

1.2.4 氯霉素的檢測(cè)

取上述氯霉素核酸適體包被的膠體金溶液2 mL，加入250 μL一定濃度的氯霉素溶液，混合均勻后在震蕩器中反應(yīng)15 min.然后慢慢加入250 μL 1 mol·L-1的氯化鈉溶液，置于震蕩器中混合15 min，用酶標(biāo)儀掃描溶液在350-750 nm范圍內(nèi)的吸收光譜，比較520 nm以及620 nm處的吸光度變化值.

2 結(jié)果與討論

2.1 膠體金-核酸適體體系檢測(cè)氯霉素的有效性

圖1是不同體系下膠體金紫外可見光譜圖，從圖中可以看出，在膠體金溶液中加入氯化鈉時(shí)，膠體金團(tuán)聚，520 nm 處吸光度降低，620 nm 處有新的吸收峰；當(dāng)先加入核酸適體再加氯化鈉時(shí)，620 nm 無吸收峰，與膠體金本身吸收曲線基本相同，說明適體包被膠體金后對(duì)膠體金起穩(wěn)定分散作用［9］，使得膠體金在一定濃度氯化鈉下不發(fā)生團(tuán)聚；而當(dāng)在上述體系中加入氯霉素時(shí)，620 nm處吸收峰明顯加強(qiáng)，說明適體與氯霉素分子結(jié)合，膠體金失去保護(hù)，發(fā)生團(tuán)聚.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核酸適體包被的膠體金檢測(cè)方法可以用于氯霉素的檢測(cè)中.

2.2 氯霉素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

在氯霉素核酸適體包被的膠體金溶液中加入不同濃度的氯霉素溶液，圖2（a）顯示，隨著氯霉素濃度的增加，溶液在520 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，而620 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸升高；圖2（b）顯示，在氯霉素濃度為10～50 μmol·L-1范圍內(nèi)，膠體金A620nm/A520nm比值與氯霉素的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為：y=0.003x+0.279，相關(guān)系數(shù)R2=0.9904，檢出限為3.76 μmol·L-1（3 σ/k，n=9）.

2.3 檢測(cè)體系的選擇性

為了考察檢測(cè)體系的選擇性，選取了五種氯霉素結(jié)構(gòu)類似物及相關(guān)獸藥進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，分別是：呋喃西林（NF）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四環(huán)素（TC）.將每種樣品配制成50 μmol·L-1的溶液，按氯霉素（CAP）的檢測(cè)條件進(jìn)行測(cè)定，在350-750 nm范圍內(nèi)掃描紫外可見吸收光譜，計(jì)算A620nm/A520nm.每種樣品平行測(cè)定三次，表1結(jié)果分析顯示樣品測(cè)定值重復(fù)性較好，標(biāo)準(zhǔn)偏差均遠(yuǎn)小于平均值的10%.根據(jù)圖3 可知，加入氯霉素結(jié)構(gòu)類似物的吸光度比值A(chǔ)620nm/A520nm與空白值很接近，差值在0.03以內(nèi)；而加入氯霉素的A620nm/A520nm值與空白值差值達(dá)到0.16.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，這些結(jié)構(gòu)類似物與氯霉素核酸適體的親和力比較低，響應(yīng)較小，氯霉素核酸適體可以選擇性結(jié)合氯霉素分子，因此氯霉素核酸適體包被的膠體金檢測(cè)方法可以用于氯霉素的特異性檢測(cè)中.

表1 氯霉素及其結(jié)構(gòu)類似物吸光度比值A(chǔ)620 nm/A520 nmTab.1 Absorbance ratio A620 nm/A520nm of CAP and its analogues

3 結(jié)論

基于氯霉素核酸適體和膠體金建立了一種檢測(cè)氯霉素的方法，方法具有高靈敏度和高選擇性.該法簡便易行，滿足樣品現(xiàn)場(chǎng)、快速的檢測(cè)需求.