常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性家系的臨床表型和致病突變基因位點(diǎn)鑒定

李菁蒴　湯蘇珍　劉雅寧　陳鵬

[摘要]目的分析一個(gè)中國北方視網(wǎng)膜色素變性（RP）家系病人的臨床表型及致病基因突變，尋找致病基因突變位點(diǎn)，探討表型與基因型之間的關(guān)系。

方法收集中國北方地區(qū)的一個(gè)RP家系的臨床資料，共有11例家庭成員參與研究，其中包括5例病人和6例正常成員。完善該家系內(nèi)所有參與研究成員的眼科檢查，提取該家系中全部成員的外周血基因組DNA，選取先證者進(jìn)行視覺系統(tǒng)相關(guān)目標(biāo)區(qū)域全外顯子組測(cè)序，最終通過家系內(nèi)共分離驗(yàn)證致病突變，進(jìn)一步分析該突變與病人表型間的關(guān)系。

結(jié)果臨床檢查顯示該家系內(nèi)5例病人均符合典型的RP表型，目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序顯示核受體亞科2第E組第3個(gè)成員（[STBX]NR2E3）基因c.166G>A突變，該突變導(dǎo)致了[STBX]NR2E3基因所編碼蛋白第56號(hào)氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼幔╬.56，G>R）;保守性分析顯示該突變?cè)诟魑锓N中高度保守，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明該突變具有較高的致病性。

結(jié)論該家系內(nèi)符合典型RP表型病人目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了[STBX]NR2E3基因上一個(gè)已知的突變（c.166G>A，p.56，G>R），該突變?cè)诩蚁祪?nèi)共分離。

[關(guān)鍵詞]視網(wǎng)膜變性;色素細(xì)胞;點(diǎn)突變;高通量核苷酸序列分析;[STBX]NR2E3基因

[中圖分類號(hào)]R774.13;R394

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2096-5532（2020）01-0030-05

視網(wǎng)膜色素變性（RP）是以早期夜盲，隨后出現(xiàn)漸進(jìn)性視野缺損、視網(wǎng)膜色素沉著、視盤蠟黃色、視網(wǎng)膜電圖呈熄滅型以及中心視力下降等為主要臨床特征的常見致盲性遺傳眼病[1]。在世界范圍內(nèi)RP的發(fā)病率為1/3800～1/3500，在我國其發(fā)病率約為1/3784，全世界至少有100萬病人[2]。此組疾病是導(dǎo)致人類視力障礙最主要的疾病之一。近年來，由于其致盲率有所上升，以及人類基因圖譜的成功建立，RP日益受到眼科學(xué)者的關(guān)注。已知的RP致病基因或位點(diǎn)多達(dá)100個(gè)，目前已經(jīng)克隆50多個(gè)基因并闡述了其功能。至2015年，已被定位克隆的常染色體顯性遺傳RP的致病基因有25個(gè)[3]。至今已知基因?qū)е鲁Ｈ旧w顯性RP（ADRP）約占60%，仍有40%的ADRP病人尚未確定致病基因[4-6]。因此，對(duì)ADRP致病基因的定位和克隆仍需進(jìn)行深入的研究[7]。

本文研究對(duì)1個(gè)中國北方ADRP家系進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域外顯子測(cè)序，以期找到該病的致病基因和突變位點(diǎn)，并探討該病的臨床表型與基因型的關(guān)系，旨在為ADRP的病人治療帶來福音?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集山東省臨沂市1個(gè)ADRP家系，該家系共有3代11人，其中RP病人5例，均經(jīng)詳細(xì)全面的眼科檢查如視力、視野、眼底等明確診斷為ADRP。參與本研究的共有11例家系成員，包括5例病人，6例表型正常者。本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言，

血液標(biāo)本的采集和病人的臨床檢查均征得家系成員同意后進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1提取外周血基因組DNA采集所有家系成員的外周靜脈血2～5mL，注入EDTA抗凝管內(nèi)，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?采用全血DNA小量抽提試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）進(jìn)行外周血DNA提取。

1.2.2目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序取該家系中先證者的基因組DNA，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)捕獲人類視覺系統(tǒng)異常相關(guān)單基因遺傳病的523個(gè)基因的外顯子區(qū)域，然后對(duì)富集的外顯子文庫進(jìn)行高通量測(cè)序。將突變的基因通過4個(gè)正常人的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行過濾：包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫（ftp：//ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/）、千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫（ftp：//ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/）、Hapmap8數(shù)據(jù)庫（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）及炎黃數(shù)據(jù)庫（http：//yh.genomics.org.cn/）。

1.2.3PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序?qū)⒔?jīng)過分析篩選得到的獲選變異位點(diǎn)分別利用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。PCR反應(yīng)條件：94℃、3min;94℃、40s，53℃、40s，72℃、60s，35個(gè)循環(huán);72℃10min。然后，應(yīng)用Sanger測(cè)序法分別對(duì)每例家系成員的基因組DNA模板與核受體亞科2第E組第3個(gè)成員（NR2E3）引物的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物測(cè)序。

2結(jié)果

2.1臨床特征

該家系為ADRP，共有11例家系成員（圖1），其中包括5例RP病人（Ⅰ1，Ⅱ1，Ⅱ5，Ⅲ1，Ⅲ3）和6例健康成員（Ⅰ2，Ⅱ2，Ⅱ3，Ⅱ4，Ⅱ6，Ⅲ2）。眼科檢查顯示，5例病人的臨床表型均符合典型的RP的臨床特征。該家系內(nèi)5例病人的臨床表現(xiàn)較為相似，均自幼夜盲，并在10歲左右出現(xiàn)明顯的視野縮窄及視力下降。先證者Ⅱ1目前雙眼最佳矯正視力均為0.1;其雙眼眼底表現(xiàn)符合典型的RP改變，包括視乳頭色蒼白、視網(wǎng)膜血管迂曲變細(xì)、視網(wǎng)膜萎縮及后極部大量骨細(xì)胞樣色素沉著等。見表1。

2.2目標(biāo)區(qū)域外顯子組基因測(cè)序

針對(duì)家系內(nèi)先證者（Ⅱ1）進(jìn)行的目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序所達(dá)到的覆蓋率為99.91%，平均測(cè)序深度為61.4X。目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序共捕獲到837個(gè)單核苷酸變異（SNVs）和82個(gè)插入/缺失變異（Indels）。經(jīng)過4個(gè)SNP數(shù)據(jù)庫對(duì)比過濾，鑒于常染色體顯性遺傳的RP較少見，只保留千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率小于0.05的突變，共篩選出8個(gè)可能與該家系發(fā)病相關(guān)的變異，這8個(gè)突變分別位于6個(gè)基因：NR2E3、BBS4、BBS9、PMM2、PDE6A、CIB2。見表2。

2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，該家系中5例病人均存在NR2E3基因的第2外顯子的突變，核苷酸改變?yōu)閏.166G>A，氨基酸改變?yōu)閜.56，G>R（圖2）;而家系中的6例正常人均不存在該突變。多次測(cè)序結(jié)果表明，該突變位點(diǎn)并不是因?yàn)閿U(kuò)增或測(cè)序錯(cuò)誤引進(jìn)的。應(yīng)用點(diǎn)突變預(yù)測(cè)程序SIFT和PolyPhen的預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示，該突變導(dǎo)致了NR2E3蛋白功能“deleterious”級(jí)的損壞，從而引起了病人RP的發(fā)生。該突變?yōu)橐阎蛔?，不是新突變?/p>

3討論

RP的遺傳方式較為復(fù)雜，目前已知有ADRP、常染色體隱性遺傳RP（ARRP）、X-連鎖遺傳RP（XLRP）[8]、雙基因型遺傳RP（digenicRP）和線粒體遺傳RP（mitochondrialRP）等5種。ADRP占RP的20%～25%，目前共克隆出了25個(gè)致病基因，由于ADRP危害較為嚴(yán)重，發(fā)病率較高，近年來已經(jīng)成為眼科遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)[9]。視紫紅質(zhì)（RHO）是最早被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致RP突變的致病基因[10]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種致病突變，90%以上的RHO突變是錯(cuò)義突變，另外一些是缺失或移碼突變[11]。在北美和歐洲人群中，RHO突變是導(dǎo)致ADRP最常見的原因，占20%～25%。在日本，RHO突變率卻較低，僅為2.5%[12]。

NR2E3基因突變占ADRP致病突變的2%～6%，定位15q23～q25，含有8個(gè)外顯子，編碼410種氨基酸的蛋白質(zhì)[13]。該蛋白質(zhì)也是配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，只在成人視網(wǎng)膜外核層表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)換、胚胎發(fā)育和功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。NR2E3突變的病人的臨床特征是后發(fā)性ARRP。最近有研究顯示，NR2E3突變與ADRP有明顯的關(guān)系[14]。NR2E3突變的ADRP病人除了具有典型的ADRP臨床表現(xiàn)外，還有眼底高熒光，很少或幾乎沒有視網(wǎng)膜下色素沉著[15]。

NR2E3由5個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域在所有核激素受體中都是進(jìn)化上保守的。N末端的結(jié)構(gòu)域1和2含有高度可變的A/B結(jié)構(gòu)域，其有助于通過激活因子（AF-1）結(jié)構(gòu)域的配體與非依賴性DNA結(jié)合;結(jié)構(gòu)域3是核受體最保守的區(qū)域，含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）。DNA結(jié)合區(qū)還含有P-盒以及D-盒，P-盒允許核受體結(jié)合獨(dú)特的DNA應(yīng)答元件位點(diǎn)并調(diào)節(jié)基因表達(dá)，D-盒被認(rèn)為參與蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)構(gòu)域4包含可變鉸鏈區(qū)并且通常是核受體中最獨(dú)特的序列。結(jié)構(gòu)域5位于C末端部分，包括幾個(gè)結(jié)構(gòu)域：LBD、同源和異源二聚化結(jié)構(gòu)域、核定位和配體依賴性激活因子（AF-2）結(jié)構(gòu)域。

配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域由12個(gè)α-螺旋組成，其折疊可以產(chǎn)生配體結(jié)合的疏水口袋[16]。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DBD位于第39～130位密碼子之間，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的突變發(fā)生在第56位密碼子，其位點(diǎn)在NR2E3上的位置處于功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)[17]。

p.G56R突變位于NR2E3蛋白的DBD中，而DBD有助于核受體的同聚和異聚。該位點(diǎn)突變會(huì)影響

NR3E3同源二聚體的形成。在ADRP病人中，p.G56R突變體蛋白在CRX介導(dǎo)的光感受器特異性基因表達(dá)中起抑制作用，這就是其導(dǎo)致RP發(fā)生的原因。本文研究中5例病人的臨床表型均符合典型的RP臨床特征，主要包括視乳頭色蒼白、視網(wǎng)膜血管迂曲變細(xì)、視網(wǎng)膜萎縮及后極部大量骨細(xì)胞樣色素沉著等。目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序技術(shù)是一種新型的基因組分析技術(shù)，該技術(shù)使用一套核苷酸探針捕獲基因組上的目標(biāo)序列，然后使用通用引物對(duì)這些捕獲到的序列進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量生物信息學(xué)分析[18]。本研究通過目標(biāo)區(qū)域外顯子組測(cè)序及Sanger測(cè)序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析和變異過濾策略，成功地發(fā)現(xiàn)了RP致病基因NR2E3（c.166G>A，p.56，G>R）的突變位點(diǎn)。該突變導(dǎo)致了NR2E3基因所編碼蛋白第56位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榫彼幔╬.L51>P），該突變?cè)赗P家系內(nèi)共分離。

RP危害嚴(yán)重且目前尚無有效治愈方法，發(fā)現(xiàn)RP可能的致病基因和有害突變，并進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)防和基因治療顯得尤為重要[19]。目前已知基因?qū)е碌腁DRP約占60%，仍有40%的ADRP病人尚未確定其致病基因。因此，對(duì)ADRP致病基因的定位和克隆仍需進(jìn)行深入研究[20]。該病雖然是單基因遺傳病，但遺傳異質(zhì)性高，有1/3～1/2的病例有遺傳背景[21]。應(yīng)用傳統(tǒng)的診斷方法很難在分子水平做出正確的診斷。新一代測(cè)序技術(shù)能夠準(zhǔn)確地、全面地發(fā)現(xiàn)基因組中的各種DNA異常、遺傳重組突變和其他各種突變等[22]。

自新一代測(cè)序技術(shù)問世以來，我國在眼遺傳性疾病致病基因的研究中取得前所未有的成果[23-24]。

全外顯子測(cè)序是指將基因組中外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。全部外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子的交界區(qū)雖然只占全基因的1%，但是大多數(shù)與遺傳表型相關(guān)的功能性變異位于外顯子區(qū)，應(yīng)用該技術(shù)已經(jīng)找到了很多孟德爾遺傳疾病的致病基因。致病基因的確定不僅有助于早期診斷和早期采取預(yù)防措施，還可以診斷不同的致病基因從而采取不同的治療措施，如針對(duì)先天性黑矇致病基因RPE65的基因治療可明顯改善臨床病人的病情[25-27]。已有研究在RP、先天性青光眼和先天性白內(nèi)障等單基因遺傳性疾病中發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。還有研究應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了RP的致病基因SLC7M4[28]。另外，在近視、原發(fā)性青光眼和年齡相關(guān)性黃斑變性等復(fù)雜性基因遺傳性疾病中亦發(fā)現(xiàn)了新的相關(guān)性致病基因，如與原發(fā)性開角型青光眼相關(guān)的基因ABCAI和PMM2[29]。當(dāng)前遺傳學(xué)及基因組學(xué)研究上的新突破，使得我們能夠從基因?qū)用嬲J(rèn)識(shí)到遺傳性疾病的成因，從而使遺傳性眼科疾病的基因診斷和治療成為可能[30]。

綜上所述，本文對(duì)RP家系進(jìn)行的基因檢測(cè)顯示，NR2E3（c.166G>A，p.56，G>R）基因上的突變位點(diǎn)可能導(dǎo)致了RP的發(fā)病。本研究結(jié)果不僅豐富了RP致病基因NR2E3的圖譜，而且將為常染色體顯性遺傳性RP的基因治療、產(chǎn)前診斷和預(yù)防提供重要的參考。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）