1株新疆胡楊林昆蟲病原線蟲鑒定及生物學特性

詹發(fā)強, 侯 敏, 楊 蓉, 王 寧, 包慧芳, 侯新強, 崔衛(wèi)東, 龍宣杞

(新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室 ，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】 昆蟲病原線蟲是一種專性寄生昆蟲并且體內攜帶有共生細菌的體型微小的線蟲[1-2]。昆蟲病原線蟲作為1種新型生物殺蟲劑，在國內外農林害蟲生物防治領域日益受到重視，國內外在分類鑒定，以及園藝、蔬菜、經濟作物等各類作物上開展了以昆蟲病原線蟲為主的生物防治害蟲研究和應用，目前為止已有許多利用昆蟲病原線蟲防治地下害蟲成功的報道[3-14]。昆蟲病原線蟲具有較強的地域性，分類收集該地區(qū)昆蟲病原線蟲并能夠應用可規(guī)避潛在生物風險及提高防控效率。世界上的胡楊絕大部分生長在中國，而中國90%以上的胡楊又生長在新疆塔里木河流域，胡楊生長的地域環(huán)境相對惡劣，甚至極端惡劣，在這樣環(huán)境中蘊藏的昆蟲病原線蟲資源必定有其獨特的分布類群和適應機制，對于胡楊林蟲害的生態(tài)動態(tài)控制具有重要作用。 研究分離篩選新疆巴楚胡楊林中的昆蟲病原線蟲及其共生細菌為應用于天然胡楊林中害蟲的生物防治提供依據?！厩叭搜芯窟M展】目前我國在黑龍江、甘肅、云南、河北、廣東等已報道的昆蟲病原線蟲斯氏線蟲科和異小桿線蟲科的線蟲共計40 多個品系，200 多種[15]。Steinernemalitorale昆蟲病原線蟲是2004年在日本[16]發(fā)現(xiàn)并被鑒定為新種，截至目前在巴基斯坦[17]發(fā)現(xiàn)(Steinernemalitoralestrain Pak.P.s.7)并描述了這個種，中國河南、山西和遼寧等地區(qū)也有分布[18-19]。隨后，針對不同地域分離的Steinernemalitorale開展了殺蟲、共生細菌分離鑒定、耐冷等生物學特性分析研究，其中研究發(fā)現(xiàn)，海濱斯氏線蟲具有侵染力強和耐干燥力特性[20]，哈爾濱當地海濱斯氏線蟲經低溫馴化能顯著提高其適低溫特性，并能用于后期長期貯存[21]?！颈狙芯壳腥朦c】但至今關于這個種的線蟲的研究工作還比較有限，由于分離獲得的品系還較少，開展系統(tǒng)分類鑒定和生學學特性分析的相關研究更少。研究1株新疆胡楊林昆蟲病原線蟲鑒定及生物學特性?！緮M解決的關鍵問題】在我國新疆巴楚天然胡楊林土壤中分離獲得1株昆蟲病原線蟲，研究和驗證其種屬分類關系，測試其殺蟲活力，為開展其系統(tǒng)生物學特性，以及新疆天然胡楊林昆蟲病原線蟲分布特征和其對胡楊林害蟲的生物防治研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品及誘導蟲來源

分離昆蟲病原線蟲的土樣來自新疆喀什地區(qū)巴楚縣夏馬勒林場天然胡楊林，采集時間為4月下旬，采集土壤樣品時，清理開胡楊葉層后，隨機取10～15 cm 深的5個點為1個土樣，在近2 km2的范圍內共采集土樣共24份，采集土樣每份樣品單獨消洗采樣器，采集的土樣裝在密封袋內且不高于20℃條件下保存，運回實驗室后第1時間進行后續(xù)誘導處理；大蠟螟幼蟲為誘導蟲，其由實驗室傳代培養(yǎng)及擴繁獲得；黃粉蟲幼蟲(Tenebriomolitor)購自新疆明珠花卉市場。

1.1.2 主要儀器、試劑與培養(yǎng)基

MSSPX-250 型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺，eppendorf 5418R 離心機，PCR 儀 Eppendorf No:5345，電泳儀 Bio-Rad Mode 200/2.0，凝膠成像儀 United-Bio，GK-330C plus，Olympus CX41 相差顯微鏡，奧林巴斯 SZ61 體式顯微鏡， PCR 預混液(TaKaRa Biotechnology)。

細菌基因組提取試劑盒，其余試劑均為分析純。試劑有硫柳汞鈉，溴百里酚藍，氯化三苯四唑，PCR 預混液(TaKaRa Biotechnology) 等，其余試劑均為分析純。

NBTA培養(yǎng)基[22]， NA固體與NB液體培養(yǎng)基成品購買自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 方 法

1.2.1 昆蟲病原線蟲的分離及形態(tài)學鑒定

昆蟲病原線蟲的誘導采用White-trap 法。昆蟲病原線蟲永久性樣本的制備參考Khuong B. Nguyen[23]《昆蟲病原線蟲系統(tǒng)學與共生細菌系統(tǒng)發(fā)育》書中關于形態(tài)學鑒定的流程和步驟；用OLympus CX41相差顯微鏡進行形態(tài)特征測量。

1.2.2 昆蟲病原線蟲共生菌的分離

用收集到的侵染期線蟲以每頭大蠟螟幼蟲約100條劑量自然侵染，于9 cm培養(yǎng)皿內鋪雙層濾紙，加入1.5 mL的線蟲懸浮液，再放入7頭大蠟螟幼蟲，置于25℃避光培養(yǎng)，待大蠟螟幼蟲死亡后及時開始分離共生細菌[22]。

1.2.3 昆蟲病原線蟲18S rDNA及共生細菌16S rDNA擴增鑒定

DNA 提取及序列擴增[22]：線蟲總 DNA 提取及18S rDNA擴增：18S：5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’ ，26S：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’，PCR反應體系為50 μL，含有24 μL premixTaq，引物各1 μL，模板2 μL，無菌水22 μL。擴增條件：94℃，4 min；94℃，1 min；53℃，45 s；72℃，90 s；30X；72℃，7 min。共生細菌總 DNA 提取及16S rDNA擴增：27F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′； 1492R：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。PCR擴增反應體系為50 μL，含有24 μL premixTaq，引物各11 μL，模板2 μL，無菌水22 μL。擴增條件： 94℃， 4 min， 94℃ ，55 s，53℃， 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 7 min。

1.2.4 序列測定及進化樹構建

PCR擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定后，PCR產物直接進行雙向測序，引物合成及序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。將測序得到的18S rDNA 和16S rDNA序列與GenBank數據庫中的核苷酸序列進行BLAST分析，從中獲取相近的18S rDNA和16S rDNA序列，用Clustal X軟件和MEGA 4.1中Neighbor-joining法構建其系統(tǒng)進化樹，初步確定其分類地位。

1.2.5 侵染力測定

侵染力測定采用不同劑量分別對2種幼蟲(大蠟螟幼蟲和黃粉蟲幼蟲)開展測試，實驗設7 個劑量處理：10、20、40、80、160和320和640 IJs/幼蟲；在9 cm 的培養(yǎng)皿墊2 層濾紙，放置10 條活潑健壯、大小基本一致的供試蟲，總加水量1.5 mL/皿；對照加等量清水，每處理和對照各3 次重復，封口膜封口，置于25℃、70% RH 的恒溫培養(yǎng)箱內，每12 h 觀察統(tǒng)計1次，直至某處理的死亡率達100%或對照組的死亡率達20%，計算校正死亡率。

1.3 數據處理

Excel 2007數據整理統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲的誘導和收集

在新疆巴楚縣夏馬勒林場天然胡楊林中采集的24份土壤樣品中，從6份土樣中分離獲得昆蟲病原線蟲，檢出率達到25%；研究表明，在干旱少雨的巴楚天然胡楊林土壤中有昆蟲病原線蟲存在，且檢出率較高。線蟲侵染大蠟螟后1～2 d致大蠟螟幼蟲行動遲緩，2～3 d致死，致死后大蠟螟蟲體變軟，蟲體上伴隨有細小的黑斑出現(xiàn)，體色逐漸變深，從致死大蠟螟幼蟲到大量侵染期幼蟲出現(xiàn)在收集盤內需要10～12 d，在室溫(約25℃)條件下侵染期線蟲在水中運動緩慢，且大多數侵染期線蟲處于靜止狀態(tài)，用挑針輕微撥動，隨即開始運動，一段時間后又恢復靜止狀態(tài)。所獲6個樣品的昆蟲病原線蟲對大蠟螟的侵染后的表型特征以及侵染期線蟲在水中的少數移動、多數靜止的模式基本一致。圖1

圖1 大蠟螟幼蟲被S.litorale-Bachu 侵染效果

Fig.1 The Gm larvae in different stages infected byS.litorale-Bachu

2.2 昆蟲病原線蟲及其共生細菌分子系統(tǒng)發(fā)育

將全部6個分離到的昆蟲病原線蟲提取基因組、18S rDNA擴增、測序和比對，6株線蟲18S rDNA序列完全一致，18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，在進化關系上與Steinernemalitoralestrain Pak.S.P.7 JF892546.1進化關系最近，相似度較高，與模式株SteinernemalitoraleAB243441.1處于同一分類大支；分離獲得的線蟲命名為SteinernemalitoralestrainPopluseuphratica-1 XJ Bachu簡寫為(S.litorale-Bachu )，通過序列提交至Genebank獲得基因登錄號 No: MK416208。S.litorale-Bachu 在新疆巴楚夏馬勒林場天然胡楊林土壤中是優(yōu)勢昆蟲病原線蟲種群。圖2

圖 2 S.litorale -Bachu 18S rDNA進化樹

Fig. 2 18S rDNA cladogram ofS.litorale-Bachu . Bar 0.5% sequence divergence

將全部6個樣品的昆蟲病原線蟲共生細菌分離和提取基因組，16S rDNA擴增、測序和比對后，6株共生細菌16S rDNA序列也完全一致，更進一步驗證了線蟲為同一類。進化樹分析表明，從被S.litorale- Bachu侵染大蠟螟后的血腔液中分離的共生細菌屬于Xenorhabdusbovienii種，與Xenorhabdusbovieniistrain Zakharovo 的進化距離最近，這也與前人關于這個種的昆蟲病原線蟲共生細菌描述一致[17]。圖3

圖 3S.litorale- Bachu 共生細菌16S rDNA進化樹

Fig. 3 16S rDNA cladogram of symbiotic bacteria ofS.litorale- Bachu . Bar 0.2% sequence divergence.

2.3 昆蟲病原線蟲形態(tài)學測量及對比

測量S.litorale-Bachu第1代雄蟲與侵染期幼蟲的形態(tài)學特征，其與已報道的斯氏線蟲屬線蟲Steinernemalitorale模式株在第1代雄蟲和雌蟲，以及侵染期幼蟲在形態(tài)特征值大部分吻合，但在第1代雄蟲形態(tài)特征對比上較模式株有以下不同：體長略長(1 461.01 μm)、排泄孔至頭部距離短(86.98 μm)、交合刺短(69.49 μm)、D%(60.45)與SW%158.21 值均小于模式株；侵染期幼蟲形態(tài)特征值有以下不同：體長(885.88 μm)和尾長(74.81 μm)短、E%(83.88)值大于模式株；第1代雌蟲形態(tài)特征值有以下不同：體長4 608.76 μm、排泄孔至頭部距離(99.44 μm)、尾長(55.36 μm)和D%(54.08 )值均大于模式株。通過測量對比分析，S.litorale-Bachu無論是第1代雄蟲和雌蟲，還是侵染期幼蟲各項特征指標均與Steinernemalitorale模式株較為相近，與steinernemafeltiae不同生長期線蟲的特征指標差異較大，從新疆巴楚縣胡楊林分離得到的線蟲屬于Steinernemalitorale種。表1，圖4，圖5

注：a：全長；b：頭部；c：尾部

Note:a:Infective juveniles; b: Head; c: Tail

圖4S.litorale-Bachu 侵染期幼蟲不同部位顯微

Fig. 4 Micrograph of IJs different parts ofS.litorale-Bachu

注：a：全長；b：尾部和交合刺；c：頭部

Note:a: Male; b: Tail and Spicule; c: Head

圖5S.litorale-Bachu 雄蟲不同部位顯微圖

Fig. 5 Micrograph of Male different parts ofS.litorale-Bachu

表1S.litorale-Bachu與S.litorale、S.feltiae模式株形態(tài)特征比較，平均值(μm)±SD

Table 1 Comparison of Morphometric characters of threeSteinernemaspp. All Measurements are in microns and in the form: mean ±SD (range).

First generation Male第1代雄蟲Infective juveniles侵染期幼蟲First generation Female第1代雌蟲Character 特征S.litoraleS.feltiaeS.litorale-BachuCharacter S.litoraleS.feltiaeS.litorale -BachuCharacter S.litoraleS.feltiaeS.litorale -BachuN 數量202030n202030n202030L 體長1 360 ±84(1 230-1 514)1 612 ±88(1 414-1 817)1 461.01 ±124.62(1 180.8-1 666.7)L909 ±42(834-988)879 ±49(766-928)885.88±73.15(761.83-1063.61)L4 462±325(3 930-5 048)3380(3 095-3 774)4 608.76±637.82(3 269.50-5 942.42)Body diam體寬96 ±7.9(82-111)140 ±10(121-162)95.98 ±12.63(71.12-118.16)a29.5 ±0.8(27.2-30.9)30 ±1.9(27-34)29.44 ±1.71(26.52-33.74)a23±1.4(21-26)17(14-20)/EP 頭至排泄孔距離96 ±7.0(76.6-107)115 ±3.4(110-126)86.98 ±7.42(73.46-102.31)b7.3 ±0.3(6.7-7.9)6.4 ±0.3(5.8-6.8)6.83 ±0.36(6.16-7.45)b23±1.5(20-26)14(12-17)/NR 頭至神經環(huán)距離114 ±10.8(94-128)/108.17 ±6.47(96.59-122.62)c11.0 ±0.5(9.7-11.9)10 ±0.5(9.4-11)11.88 ±0.66(10.42-13.30)c117±21(78-157)65(49-88)/ES 頭至咽距離147 ±7.6(133-163)170 ±3.4(164-180)143.94 ±11.35(107.18-162.46)C/4.5 ±0.4(3.8-5.4)4.8 ±0.2(4.5-5.1)4.24 ±0.46(3.47-5.10)C/0.6±0.1(0.5-0.9)//Testis reflexion 精巢回折長度290 ±41(212-380)/347.57 ±45.88(235.54-432.80)Body diam31 ±1.4(28-33)29 ±1.9(26-32)30.12 ±2.29(25.83-35.53)Body diam.191±9.1(175-215)204(170-254)180.13 ±15.70(161.39-214.27)Tail length with sheath(T) 帶鞘尾長34 ±3.7(26-41)39 ±1.2(37-43)34.92 ±2.68(30.49-42.02)EP61 ±3.3(54-69)63 ±2.3(58-67)62.25 ±2.44(56.89-66.85)EP88±12(65-105)/99.44 ±6.51(86.61-111.71)Anal body diam(ABD) 肛門體直徑43 ±3(37-49)48 ±1.7(45-53)43.95 ±3.10(36.39-49.40)NR96 ±4.0(89-104)113 ±5.1(108-117)102.04 ±6.92(91.77-112.94)NR146±9.1(130-165)/130.20 ±12.23(115.98-162.01)Spicule length(SL) 交合刺75±4.8(67-89)66 ±1.5(62-68)69.49 ±4.51(61.42-75.92)ES125 ±4.6(114-133)136 ±3.5(130-143)129.78 ±8.45(118.08-145.95)ES196±8.2(185-213)237(197-304)184.65 ±12.64(164.81-217.53)Gubernaculums length (GL) 引帶53 ±4.0(44-64)52 ±1.9(48-56)50.60 ±4.98(38.91-56.97)Tail length with sheath(T)83 ±4.5(72-91)86 ±2.6(81-89)74.81 ±7.52(59.98-88.61)Testis reflexion///D%=EP/ES×100/68 ±3.1(64-72)60.45 ±2.28(50.57-85.71)Anal body diam.(ABD)19 ±1.5(16 -22)18 ±0.8(16-19)17.66 ±0.88(16.37-20.03)Tail length with sheath(T)39±7.6(25-60)52(39-70)55.36±8.23(43.22-73.19)SW%=SL/ABD×100174 ±13(154-200)140 ±10(130-150)158.21 ±3.03(135.26-179.94)D%=EP/ES×10048.5 ±2.9(44.0-56.0)46 ±1.4(44-50)48.12 ±3.02(42.82-54.56)Anal body diam.(ABD)62±4.7(55-75)52(47-62)56.45 ±6.85(46.02-68.31)GS%=GL/SL×10071 ±4(62-81)80 ±3(70-90)72.67 ±2.85(52.71-85.66)E%=EP/T×10073.0 ±5.0(63.0-84.0)74 ±4(67-81)83.88 ±7.42(69.67-97.13)D%=EP/ES×10045±6.5(33-57)/54.08 ±5.02(51.36-56.62)

Note : EP=distance from anterior end to excretory pore; NR= distance from anterior end to nerve ring; ES= distance from anterior end to end of pharynx. L= body length, MBD= maximum body diameter, EP= distance from anterior end to excretory pore, NR =distance from anterior end to nerve ring, ES= pharynx length, T= tail length, a=L/MBD, b=L/ES, c=L/T, D%=EP/ES×100, E%=EP/T×100, ABD=anal body diameter, SL= spicule length, GL= gubernaculum length, SW%=spicule length/ABD×100, GS= guberculum/spicule×100; C’=T/ABD; MUC= mucron, A=absent; P= present; / =no data available

2.4 S. litorale-Bachu 殺蟲活性測試

研究表明,分離獲得的昆蟲病原線蟲在 24～48 h內為侵染致死大蠟螟幼蟲的主要時間，尤其是24～36 h為侵染關鍵時間段，除低劑量10和20 IJs/Gm 在36 h之內校正致死率低于50%，隨著劑量的增加其它試驗組對大蠟螟校正致死率超過70%以上， 高劑量160 IJs/Gm 及其以上處理組36 h之內校正致死率達到100%；到60 h，低劑量10 IJs/Gm對大蠟螟幼蟲校正死率達到49%，20 IJs/Gm校正致死率達到65%以上，其余處理組對大蠟螟校正致死率均達到100%。圖6

新疆巴楚胡楊林昆蟲病原線蟲對黃粉蟲幼蟲也具有較高的侵染致死能力，在整個試驗統(tǒng)計周期內劑量效應顯著，在60 h內40 IJs/Tm及其以上劑量試驗組對黃粉蟲幼蟲校正致死率均超過50%，其中160 IJs/Tm及以上試驗組校正致死率超過75%；在72 h內，只有320與640 IJs/Tm校正致死率達到80%以上，其中640 IJs/Tm對黃粉蟲幼蟲校正致死率達到87%。圖7

圖6 不同劑量S.litorale-Bachu對大蠟螟的侵染力

Fig. 6 The infectivlity ofS.litorale-Bachu toG.mellonellaat different dosages

圖7 不同劑量S.litorale-Bachu對黃粉蟲的侵染力

Fig. 7 The infectivity ofS.litorale-Bachu toT.molitorat different dosages

3 討 論

研究表明，在新疆尼勒克[22]、和田地區(qū)紅棗綠豆間作田[24]等不同生境也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有昆蟲病原線蟲的分布，但在新疆胡楊林中是否存在，存在哪些種屬還都未知。研究在新疆巴楚縣夏馬勒林場胡楊林土樣中分離到海濱斯氏線蟲為采樣地存在的優(yōu)勢種；經過分子生物學、形態(tài)學鑒定與日本報道的屬于同一屬種，這是新疆發(fā)現(xiàn)海濱斯氏線蟲的存在，也是首在新疆胡楊林中發(fā)現(xiàn)有昆蟲病原線蟲分布；并且其對大蠟螟幼蟲和黃粉蟲幼蟲具有較高的侵染活性，具有潛在的害蟲生防應用價值。與劉瑞等[20]的殺蟲活性研究結果比較，相同劑量和時間下侵染大蠟螟幼蟲活性較為一致，致死率均較高；而在同劑量和時間下對于黃粉蟲侵染活性略低于文獻報道，可能是由于不同研究中所使用的的黃粉蟲幼蟲的齡期或者不同品系侵染特性具有差異。

土壤樣品采樣地點巴楚縣位于新疆南疆盆地特克拉瑪干沙漠邊緣，采集地天然胡楊林生長在塔河流域外圍，常年干旱少雨且溫度較高，夏季炎熱，冬季寒冷，降水量少、蒸發(fā)量大，環(huán)境相對惡劣，此類線蟲的發(fā)現(xiàn)一是證實在這種生態(tài)條件下昆蟲病原線蟲的分布和存在；同時也間接說明其對環(huán)境的適應性較強，具有較強的抗逆性。呂洋和韓嵐嵐等[25]研究證實海濱斯氏線蟲S.litorale當地品種更適合應用于當地的寒冷氣候，張旭霞和韓嵐嵐等[21]研究證明海濱斯氏線蟲具有低溫貯存性優(yōu)異的特點，劉瑞和劉奇志[20]研究發(fā)現(xiàn)海濱斯氏線蟲具有侵染力強和耐干燥力的特性，而研究中的線蟲其相關特性有待進一步研究驗證。在采集地的胡楊林中存在著大量的春尺蠖，而此次分離到的這種昆蟲病原線蟲能夠存在于胡楊林土壤中，且呈優(yōu)勢存在，推測與春尺蠖有著密切的聯(lián)系，春尺蠖可作為其維系繁育的蟲源之一，這還需要進一步的研究和驗證。在新疆天然胡楊林面積廣大，新疆天然胡楊林重點分布在塔里木河沿岸，塔里木河流域胡楊林資源面積達100×104hm2(1 500多萬畝)，占全國胡楊林面積90%以上，是我國天然胡楊林分布最集中的地區(qū)。廣闊且生態(tài)多樣的塔河流域胡楊林，其中可能蘊藏著許多不同屬種、特性優(yōu)異的昆蟲病原線蟲，后續(xù)研究將可開展大范圍、大空間尺度塔河流域胡楊林昆蟲病原線蟲分離和收集，進一步系統(tǒng)研究存在于新疆塔河流域原始胡楊林中的昆蟲病原線蟲種群及其分布特征。

4 結 論

在新疆天然胡楊林中有EPNs的分布，分離到的此株線蟲形態(tài)學分析其與Steinernemalitorale模式株大部分特征值基本吻合，主要區(qū)別為：第1代雄蟲：體長略長(1 461.01 μm)、排泄孔至頭部距離短(86.98 μm)、交合刺短(69.49 μm)、D%(60.45)與SW%158.21 值小于模式株；侵染期幼蟲：體長(885.88 μm)和尾長(74.81μm)短、E%(83.88 )值大，18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析其在進化關系上與Steinernemalitoralestrain Pak.S.P.7 進化關系最近，鑒定為Steinernemalitorale的新疆亞種；16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹表明其共生細菌是Xenorhabdusbovienii。S.litorale-Bachu 對黃粉蟲和大蠟螟幼蟲均具有較高的侵染及致死力，在160 IJs/Gm 及其以上試驗組36 h之內大蠟螟校正致死率達到100%，60 h內黃粉蟲校正致死率超過75%。在新疆天然胡楊林中發(fā)現(xiàn)有EPNs的分布，Steinernemalitorale在采集地是優(yōu)勢種，同時其具有較強的殺蟲能力。