流式細(xì)胞影像系統(tǒng)（Flow CAM）在海洋微型浮游生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用發(fā)展

韓留玉 陳綿潤

【摘 要】微型浮游生物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最基本的組成部分。近年來，海洋微型浮游生物群落在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用越來越得到人們的關(guān)注，這與微型浮游生物觀測技術(shù)的發(fā)展以及它們在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用有著密切的關(guān)系。流式細(xì)胞影像系統(tǒng)（Flow CAM）是近年來發(fā)展起來的浮游生物生態(tài)學(xué)研究方法，通過結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和顯微鏡技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)浮游生物的自動分類，提高微型浮游生物樣品的分析效率。

【關(guān)鍵詞】微型浮游生物;Flow CAM;自動分類

1海洋微型浮游生物的研究進(jìn)程

近年來，由于海洋顯微觀測技術(shù)的發(fā)展，使得生物學(xué)家能夠觀察到越來越小的海洋微型浮游生物，進(jìn)而對它們的分類、生理生態(tài)學(xué)、種群增長率、營養(yǎng)行為以及在微食物環(huán)中的作用研究越來越多。

目前國際上通常所說的海洋微型浮游生物包括微型真核自養(yǎng)生物、微型真核異養(yǎng)生物、微型原核自養(yǎng)生物和微型原核異養(yǎng)生物等單細(xì)胞生物以及浮游病毒等多個類群。近年來的研究表明，海洋微型浮游生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的作用尤其是生產(chǎn)力中的作用越來越重要，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生物地球化學(xué)循環(huán)和能量代謝中發(fā)揮著越來越重要的作用。

定量檢測微型浮游生物的種群動態(tài)變化，不僅有利于研究其種間營養(yǎng)關(guān)系，更有助于探索其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中所起的重要作用。傳統(tǒng)顯微計數(shù)方法雖然可以通過形態(tài)特征觀察不同類型的微生物來分別計數(shù)，但費(fèi)時費(fèi)力，人為誤差較大。流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）的應(yīng)用，使得這些問題迎刃而解。

2海洋微型浮游生物觀測技術(shù)的發(fā)展

（1）顯微鏡計數(shù)法

顯微鏡法是最傳統(tǒng)的細(xì)胞計數(shù)方法。通常用網(wǎng)具采集樣品并用固定劑固定后帶回實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下計數(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是計數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確，可以從物種水平對形態(tài)多樣性和不規(guī)則的浮游生物進(jìn)行鑒定。但耗時耗力，對操作人員的專業(yè)知識及能力要求比較嚴(yán)格，計數(shù)結(jié)果的人工主觀性誤差比較大。

（2）浮游生物光學(xué)計數(shù)器計數(shù)法

浮游生物光學(xué)計數(shù)器（OPC）簡便快捷、計數(shù)效率高，并且能通過遮擋相同數(shù)量光線的球的直徑來表示顆粒物的大小，因而得到廣泛使用。浮游生物激光計數(shù)器（LOPC）在OPC的基礎(chǔ)上進(jìn)行了技術(shù)上的改進(jìn)，將最小粒徑擴(kuò)展到100μm，在海洋生態(tài)系統(tǒng)研究中應(yīng)用比較廣泛。

（3）流式細(xì)胞儀計數(shù)法

流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了快速、大批量的分析，但不能得到浮游生物直觀圖像。對于粒徑小于50μm和大于100μm的顆粒難于操作，且數(shù)據(jù)重復(fù)性低，難以用于現(xiàn)場監(jiān)測。

（4）圖像拍攝技術(shù)分析法

最早的流體成像系統(tǒng)是利用感光膠片和計算機(jī)等控制圖像和閃存來實(shí)現(xiàn)的。隨著計算機(jī)和圖像獲取技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)逐漸向包含圖像、分析和顆粒技術(shù)的方向發(fā)展。浮游生物視頻記錄器（VPR）的出現(xiàn)使海洋顆粒物的現(xiàn)場檢測成為可能。

（5）流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）分析法

流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）綜合了顯微鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)。實(shí)現(xiàn)了浮游生物的快速檢測與自動分類，減少了人工操作，解決了大規(guī)模尺度研究下數(shù)據(jù)獲得相對滯后的問題。在快速檢測的同時得到浮游生物的直觀形態(tài)學(xué)圖像，測定顆粒粒徑范圍擴(kuò)展到了3-3000μm。既能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行樣品分析，又可以在野外進(jìn)行連續(xù)24小時實(shí)時監(jiān)測，分析樣品的數(shù)量和速度得到提升。

3流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）的工作原理和流程

流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）包括主機(jī)和計算機(jī)工作平臺兩部分，由三個子系統(tǒng)構(gòu)成：流控系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和電學(xué)系統(tǒng)。流控系統(tǒng)是蠕動抽水泵將待分析的樣品導(dǎo)入流通池，通過調(diào)節(jié)蠕動抽水泵的速度調(diào)節(jié)樣品經(jīng)過流通池的速度，流通池根據(jù)浮游顆粒物的大小分為不同的規(guī)格，用以得到顆粒物的清晰圖像。光學(xué)系統(tǒng)包括閃頻LED光源、熒光探測器和其他一些光學(xué)部件。電學(xué)系統(tǒng)主要是控制整個設(shè)備的運(yùn)轉(zhuǎn)、獲取圖像信號以及數(shù)據(jù)處理等。

Flow CAM的基本工作流程包括：（1）物鏡及對應(yīng)流通池的安裝;（2）掃描樣品，獲得圖像及相應(yīng)的顆粒物信息;（3）建立浮游生物圖像數(shù)據(jù)庫;（4）利用Visual Spreadsheet軟件對已經(jīng)分析的樣品進(jìn)行自動識別和分類，獲得不同浮游生物類群的豐度。

4流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）在微型浮游生物分類鑒定工作中的應(yīng)用

流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）是近年來發(fā)展起來的一種先進(jìn)的檢測儀器，主要用于快速檢測海洋、湖泊、河流等各種水體中的有機(jī)和無機(jī)懸浮體。Flow CAM在國外海洋研究中的應(yīng)用較多，在我國只有個別學(xué)者利用Flow CAM檢測海洋浮游植物物種并建立圖譜庫。目前我國運(yùn)用流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)建立圖譜庫，來對海洋微型以及超微型浮游生物群落多樣性的研究以及它們在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的研究鮮有報道。入?？诤徒：呈俏覈喑钡母甙l(fā)區(qū)，而且是重要的漁業(yè)生產(chǎn)基地，微型浮游生物種群的變動間接影響著漁業(yè)資源的興衰和分布，部分赤潮種的爆發(fā)將會對漁業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生不可估量的危害，微型浮游生物種群多樣性的變化可以指示海域環(huán)境的改變情況，對入?？诤徒：澈Ｓ蛭⑿透∮紊镏饕惾航⒍鄥?shù)圖譜庫，不僅可以實(shí)現(xiàn)對沿海海域的微型浮游生物實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)控，從而通過種群的變動判斷被檢測海域環(huán)境的變化，而且對于漁業(yè)養(yǎng)殖海域赤潮種的快速檢測與預(yù)警，以及近海漁業(yè)資源的分布具有一定的指導(dǎo)意義。

5流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）應(yīng)用于海洋微型浮游生物分類工作中的局限性和展望

流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）在國外已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用，但在技術(shù)上仍存在一些不足，目前應(yīng)用于海洋浮游生物鑒定和分類工作方面仍存在很大的瓶頸。首先系統(tǒng)對參數(shù)的設(shè)計還不夠全面，尤其是多細(xì)胞不規(guī)則形態(tài)的類群，不能有效的展現(xiàn)所有類群細(xì)胞生物的形態(tài)特征，如何將多細(xì)胞群體分割成單一細(xì)胞，直接給出單個細(xì)胞的相關(guān)參數(shù)是需要解決的問題。其次，自動分類仍然需要人工操作的輔助，目前只達(dá)到了半自動分類，后續(xù)的鑒別工作還需要人工去完成，對時間的節(jié)約不是那么的顯著。再次，對細(xì)胞生理方面的特征信息的獲取還有待開發(fā)。相信隨著圖像分析技術(shù)的不斷完善，流式細(xì)胞攝像系統(tǒng)（Flow CAM）在技術(shù)方面會不斷的優(yōu)化和完善，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的研究也會越來越廣泛。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳敏藝，袁潔，陳月琴，屈良鵠.（2005）. 海洋超微型浮游植物遺傳多樣性的分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展. 自然科學(xué)進(jìn)展，9，1032-1041.

[2]陳紀(jì)新，黃邦欽，李少菁.（2006）. 海洋微型浮游植物分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2，32-39.

[3]劉昕，張俊彬，黃良民。流式細(xì)胞儀在海洋生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]。海洋科學(xué)，2007，31（1）：92-96.

基金項(xiàng)目：

國家海洋局南海分局海洋科學(xué)技術(shù)局長基金資助項(xiàng)目（1602）。

（作者單位：1.國家海洋局?？诤Ｑ蟓h(huán)境監(jiān)測中心站;2.國家海洋局南海規(guī)劃與環(huán)境研究院）