流式微球分析技術(shù)在區(qū)別活動性結(jié)核分枝桿菌與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者中的應(yīng)用

陶芃作

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，湖南 長沙；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，湖南 長沙）

0 引言

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是結(jié)核病的主要致病因子，是最具影響力的人類病原體之一，每年感染大約860萬人，導(dǎo)致130萬人死亡[1,2]。因此，確定潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染是必要的，以降低疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，而活動性結(jié)核病的診斷可以實(shí)現(xiàn)快速治療和疾病控制[3]。為此，需要能夠準(zhǔn)確指示疾病狀態(tài)的診斷生物標(biāo)志物。結(jié)核分枝桿菌感染會引起患者血清中細(xì)胞因子水平的變化[4]。然而，不同的研究選擇了不同的細(xì)胞因子來檢測活動性結(jié)核病，而對于所選細(xì)胞因子診斷活動性結(jié)核病的可靠性知之甚少[5,6]。因此，細(xì)胞因子反應(yīng)的臨床相關(guān)性仍有待闡明。流式微球分析技術(shù)（cytometric bead array, CBA）能夠同時(shí)測量樣品體積中的多種分析物，包括炎性介質(zhì)，趨化因子，免疫球蛋白同種型，細(xì)胞內(nèi)信號分子，凋亡介質(zhì)，粘附分子和抗體[7]?；诖耍狙芯恐荚趹?yīng)用流式微球分析技術(shù)區(qū)別活動性結(jié)核分枝桿菌與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者。

1 材料與方法

1.1 一般資料

納入2016年3月至2019年3月我院收治的活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者80例為活動組；其中，男41例，女39例；年齡18～72歲，平均年齡（33.95±14.29）歲。納入2016年3月至2019年3月我院收治的潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者80例為活動組；其中，男33例，女47例；年齡14～71歲，平均年齡（36.17±11.49）歲。80例活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與80例潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者均經(jīng)我院病理科確證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；②長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；③患有精神疾病者；④患有癌癥者。同時(shí)，納入2016年3月至2019年3月至我院體檢的健康體檢者80例為對照組；年齡19～70歲；平均年齡（35.19±12.13）歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可納入此次分析。受試者均簽署知情同意書。

1.2 流式微球分析技術(shù)

采取活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者80例、潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者80例和健康體檢者80例的肘前靜脈血6mL，使用美國BD公司的商業(yè)化流式微球分析技術(shù)（cytometric bead array）檢測患者血清中細(xì)胞因子EGF, GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-1RA,IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-17, MIP-1α, TNF-β, VEGF, IL-5, MIP-1β, Eotaxin, G-CSF,IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

PRISM 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分析Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1,TNF-α檢測活動性結(jié)核分枝桿菌與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者的臨床診斷價(jià)值。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受試人員的一般資料

對照組、潛伏組和活動組在年齡上無顯著差異（P＞0.05）。對照組、潛伏組和活動組男女比例分別為35/45、33/47、41/39，分別有41名（51.25%），71名（88.75%）和49名（61.25%）受試者中存在卡介苗。對于QFT-GIT測定，所有非結(jié)核桿菌感染對照的結(jié)果均為陰性; 在45名（56，25%）潛伏組受試者和80名（100.00%）活動組受試者中觀察到陽性結(jié)果。見表1。

表1 3組受試人員的一般資料

2.2 3組受試人員血清中細(xì)胞因子的表達(dá)量

在流式微球分析技術(shù)檢測的27種細(xì)胞因子中，EGF(P=0.0530, F=2.973), GM-CSF(P=0.1136, F=2.195), IL-1α(P=0.0617, F=2.818), IL-1β(P=0.5837, F=0.5397), IL-1RA(P=0.6576, F=0.4199), IL-2(P=0.0948, F=2.38), IL-3(P=0.5414, F=0.6151), IL-4(P=0.2407, F=1.433), IL-7(P=0.0749,F=2.62), IL-10(P=0.8843, F=0.123), IL-12p40(P=0.5781,F=0.5492), IL-12p70(P=0.7985, F=0.2252), IL-13(P=0.1683,F=1.796), IL-15(P=0.6286, F=0.4651), IL-17(P=0.4597,F=0.7798), MIP-1α(P=0.5714, F=0.561), TNF-β(P=0.3029,F=1.2), VEGF(P=0.7584, F=0.2768)在健康體檢者、活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者中無明顯差異，IL-5(P＜0.0001, t=6.589)和MIP-1β(P=0.0090, t=2.634)在 健 康體檢者與結(jié)核桿菌感染患者中有顯著差異，但是IL-5(P=0.1217,t=1.556)和MIP-1β(P=0.7383, t=0.3347)在活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者中無明顯差異，Eotaxin(P＜0.0001, F=993.4), G-CSF(P＜0.0001, F=5397), IL-6(P＜0.0001, F=154.2), IL-8(P＜0.0001, F=64), IP-10(P＜0.0001,F=25.29), MCP-1(P＜0.0001, F=12.27), TNF-α(P＜0.0001,F=73.33)在健康體檢者、活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者中均存在明顯差異，見表2。

表3 活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者血清中Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的AUC、靈敏度、特異度和約登指數(shù)

表2 3組受試人員血清中細(xì)胞因子的表達(dá)量

2.3 流式微球分析技術(shù)檢測活動性結(jié)核分枝桿菌

感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者血清中Eotaxin,G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的ROC曲 線、AUC、靈敏度、特異度和約登指數(shù)Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10,MCP-1, TNF-α的ROC曲線下面積分別為0.81±0.04（95%CI 0.7484～0.8894）、0.84±0.03（95%CI 0.7829～0.9131）、0.90±0.02（95%CI 0.7699～0.9023）、0.88±0.02（95%CI 0.8312～0.9457）、0.87±0.03（95%CI 0.819～0.9388）、0.77±0.03（95%CI 0.7032～0.8468）、0.92±0.02（95%CI 0.8732 to 0.9718），其 陽 性 臨界值分別為309.6(pg/mL)、500.8(pg/mL)、279.2(pg/mL)、3490(pg/mL)、4048(pg/mL)、4724 (pg/mL)、159.7(pg/mL)，其診斷靈敏度和特異度分別為為82%和84%、83%和86%、83%和86%、85%和84%、90%和90%、89%和88%、81%和63%、93%和92%。見圖1和表3。

圖1 活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者血清中Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的ROC

3 討論

結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率很高[8,9]。盡管大多數(shù)感染結(jié)核分枝桿菌的人仍然健康，但這種狀態(tài)被稱為潛伏性結(jié)核感染。其中約占10%的個體最終會發(fā)展為活動性結(jié)核病[10-12]?？焖僭\斷檢測的開發(fā)，可以區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染或活動性結(jié)核病和非活動性結(jié)核病對于結(jié)核病控制非常重要。結(jié)核分枝桿菌感染的診斷沒有金標(biāo)準(zhǔn)，直到最近，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（TST）才是檢測潛伏性結(jié)核感染的唯一工具[13]。然而，TST本質(zhì)上無法區(qū)分活動性結(jié)核分枝桿菌和潛伏性結(jié)核分枝桿菌[14]。為了解決這些局限性，本研究引入流式微球分析技術(shù)來區(qū)別活動性結(jié)核分枝桿菌與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者。

本研究采用美國BD公司的流式微球分析技術(shù)檢測患者血清中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，比較其在健康體檢者、活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者的差異后，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α的的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.81、0.84、0.83、0.88、0.87、0.77、0.92。相比于傳統(tǒng)的測量患者血清中蛋白質(zhì)水平的技術(shù)，流式微球分析技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)[15]：（1）允許以定量方式同時(shí)測量多種分析物; （2）減少用于測量多種分析物的樣品量; （3）最大限度地減少生成數(shù)據(jù)所花費(fèi)的時(shí)間。因此，本研究所發(fā)現(xiàn)的活動性結(jié)核分枝桿菌感染患者與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染患者血清中表達(dá)差異細(xì)胞因子Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α可以通過流式微球分析技術(shù)一次同時(shí)測定，并且能夠快速得到數(shù)據(jù)，這為Eotaxin, G-CSF, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, TNF-α中的一種或多種聯(lián)合診斷活動性結(jié)核分枝桿菌感染與潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染提供了技術(shù)基礎(chǔ)。