云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落多樣性分析

樊帆, 李正濤, 李世鈺,2, 山云輝, 黃家雄,呂玉蘭, 何飛飛, 秦世雯*

(1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 昆明 650550; 2.云南省瑞麗市農(nóng)場(chǎng)管理委員會(huì), 云南 瑞麗 678600; 3.德宏后谷咖啡有限公司, 云南 德宏 678400; 4.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所, 云南 保山 678000)

咖啡是全球主要飲料作物之一，具有重要的商業(yè)價(jià)值。云南熱區(qū)具有咖啡種植的最佳海拔高度和氣候條件，種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)咖啡的98%以上[1]。目前，云南咖啡產(chǎn)區(qū)主要集中在云南保山、德宏、臨滄、普洱等地[2]。隨著云南咖啡產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，提高咖啡品質(zhì)、解決栽培技術(shù)落后和加工滯后等問(wèn)題對(duì)發(fā)展云南高原特色農(nóng)業(yè)具有重要意義。

咖啡優(yōu)良品質(zhì)的形成與咖啡的生產(chǎn)量、施肥、耕作方式和自然環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡息息相關(guān)[3-4]。土壤微生物是指示種植生態(tài)系統(tǒng)的重要指標(biāo)，在種植土壤發(fā)育、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、生態(tài)系統(tǒng)平衡、土壤環(huán)境凈化、生物修復(fù)等方面起著不可替代的作用，并且土壤微生物對(duì)植物生長(zhǎng)和抗逆性具有促進(jìn)作用。細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最大的一個(gè)類群，可決定土壤微生物總量的分布、有機(jī)物的分解和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[5-7]。如落葉松人工防護(hù)林土壤微生物中細(xì)菌數(shù)量直接影響土壤微生物總量的變化趨勢(shì)[8]；鎘耐性促生細(xì)菌明顯改善了鎘污染土壤微生物環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[9]。并且土壤中微生物生物量一定程度上代表該生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)能力和支持植被生長(zhǎng)發(fā)育的能力[10]。然而云南咖啡熱區(qū)土壤研究主要集中在肥力評(píng)價(jià)，對(duì)土壤微生物的研究還較少[11-13]。

本研究以云南咖啡主產(chǎn)區(qū)保山市潞江壩(干熱區(qū))和德宏芒市(濕熱區(qū))不同年限的咖啡種植地紅壤為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、細(xì)菌種群豐度和多樣性的變化，深入了解云南咖啡種植地紅壤的細(xì)菌生態(tài)環(huán)境，為維持云南熱區(qū)咖啡土壤質(zhì)量和健康、培育優(yōu)質(zhì)的咖啡提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

云南熱區(qū)是熱帶北緣與南亞熱帶地區(qū)的統(tǒng)稱，熱量條件≥10 ℃年積溫6 000 ℃上，年平均氣溫>18 ℃，最冷月平均氣溫>10 ℃，年降雨量600～2 700 mm，干濕季分明，5—10月為雨季，降雨量占全年的86%，11月至翌年4月為干季，降雨量?jī)H占全年的14%，年日可照時(shí)數(shù)1 750～2 250 h。云南熱區(qū)總面積8.1萬(wàn) km2左右，占云南省土地總面積的21%，主要分布在瀾滄江、金沙江、怒江、紅河、南盤江以及伊洛瓦底江的支流大盈江、龍江流域海拔1 400 m以下的低熱河谷。熱區(qū)是云南自然地理系統(tǒng)的低熱層，是云南巨大的山地系統(tǒng)的組成部分。熱區(qū)濕潤(rùn)-半濕潤(rùn)區(qū)的土壤類型主要是磚紅壤和赤紅壤，半干旱區(qū)的土壤類型主要是燥紅壤和褐紅壤，pH范圍為4.1～6.5。

本研究區(qū)域位于云南咖啡主產(chǎn)地保山市潞江壩和德宏景頗族自治州芒市。德宏芒市屬于濕潤(rùn)-半濕潤(rùn)區(qū)，保山潞江壩屬于半干旱區(qū)?？偟臍夂蛱攸c(diǎn)為光熱充足，水分缺乏，干濕分明，太陽(yáng)輻射較強(qiáng)。

1.2 樣品采集

供試土壤采自云南省保山市隆陽(yáng)區(qū)潞江壩和德宏傣族景頗族自治州芒市不同種植年限咖啡園。2017年咖啡采摘結(jié)束后，按S形取樣法取10個(gè)點(diǎn)作為1個(gè)混合樣，每塊樣地重復(fù)采集3次，采集深度0～20 cm耕層土壤。土樣磨細(xì)過(guò)2 mm篩后，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。供試土壤基本情況見(jiàn)表1。

表1 云南咖啡種植紅壤樣品基本情況Table 1 Summary of the red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

1.3 土壤微生物總DNA提取

采用磁珠法土壤微生物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取樣本的微生物基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 8 000, USA)檢測(cè)DNA的純度和濃度。隨后取適量的DNA樣品稀釋至1 ng·μL-1。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

利用引物515F/806R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的V4區(qū)域[14]。PCR反應(yīng)體系30 μL：2×Phusion Master Mix 15 μL，引物3 μL， gDNA 10 μL(5～10 ng)，H2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物質(zhì)量和濃度通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。隨后PCR產(chǎn)物等質(zhì)量混樣，充分混勻后利用2%的瓊脂糖膠電泳和GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific，USA)進(jìn)行純化回收。最后，樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行土壤微生物高通量測(cè)序(基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái))。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Cutadapt(V1.9.1)[15]對(duì)reads進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切和初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)(raw reads)，去除嵌合體[16-17]后最終獲得Clean reads。利用Uparse 軟件(v7.0.1001)[18]對(duì)所有樣品的全部 Clean reads 進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋和分類學(xué)信息，并分別在各分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計(jì)各土樣細(xì)菌群落組成[19-20]。對(duì)各土樣數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，最后進(jìn)行α多樣性和β多樣性分析。α多樣性指數(shù)組間差異分析和β多樣性指數(shù)組間差異分析分別進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)和wilcox檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

云南省保山市潞江壩和德宏州芒市不同咖啡種植年限的紅壤細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果如表2所示，五個(gè)咖啡種植土樣Clean reads數(shù)平均為80 167，Clean reads的平均長(zhǎng)度為252 bp，90%以上的堿基質(zhì)量達(dá)到Q20水平，表明測(cè)序質(zhì)量良好。

表2 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果 Table 2 Sequencing quality of 16S rDNA of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

2.2 細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)分析

2.2.1不同咖啡種植區(qū)域紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征 為研究云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落的多樣性，對(duì)所有樣品的Clean reads進(jìn)行聚類和注釋，五個(gè)咖啡種植地紅壤細(xì)菌在界、門、綱、目、科、屬、種分類水平下OTUs數(shù)目如表3所示。細(xì)菌分類學(xué)分析結(jié)果表明，五個(gè)咖啡種植地土樣中共檢測(cè)出細(xì)菌39門、109綱、145目、276科、458屬。所有土樣中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(相對(duì)豐度>1%)為：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門(Firmicutes)(表4)。

表3 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌在各分類水平下的OTUs數(shù)目Table 3 Number of OTUs of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan at the different classification levels

表4 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度前10菌門的相對(duì)豐度Table 4 Relative abundance of the top 10 phylum of red soil bacterial community in coffee-growing regions of tropical Yunnan

另外，5個(gè)咖啡種植地土樣的相對(duì)豐度前35的菌屬中均存在氨氧化微生物(Ammonia-oxidizingarchaea, AOA)Group I.1 a-associated(CandidatusNitrosotalea)，并且在潞江壩地區(qū)豐度較高(0.43%～0.67%)，說(shuō)明氨氧化古菌(AOA)可能是云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤的主要氨氧化微生物(圖1)。

注：不同顏色塊代表相對(duì)物種豐度值，由藍(lán)到紅，相對(duì)豐度逐漸升高，只顯示豐度最高的前35個(gè)屬。Note：Different color represents the relative species abundance value, and the relative abundance gradually increases from blue to red. Only top 35 genera with the highest abundance are shown.圖1 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤在屬水平上的細(xì)菌群落的物種豐度聚類Fig.1 Clustering of bacterial community structures of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan at level of genus

潞江壩與芒市咖啡種植區(qū)紅壤細(xì)菌在群落組成和豐度上均存在明顯差異(圖1和表4)。相對(duì)于芒市，潞江壩咖啡種植土樣中的變形菌門(潞江壩平均為37.02%，芒市平均為24.90%)、芽單胞菌門(潞江壩平均為7.06%，芒市為3.09%)、擬桿菌門(潞江壩平均為5.96%，芒市平均為2.37%)，以及厚壁菌門(潞江壩平均為2.69%，芒市平均為1.17%)相對(duì)豐度顯著較高，而酸桿菌門(潞江壩平均為13.83%，芒市平均為20.17%)、綠彎菌門(潞江壩平均為2.90%，芒市平均為16.56%)和裝甲菌門(潞江壩平均為0.47%，芒市平均為1.03%)相對(duì)豐度顯著較低(表4)。

另外，潞江壩與芒市咖啡種植地紅壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬(相對(duì)豐度>1%)也明顯不同。B5a細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬共9個(gè)，分別為Mizugakiibacter(8.54%)、Rhizomicrobium(2.34%)、Gemmatimonas(2.7%)、Rhodococcus(1.89%)、Bryobacter(1.67%)、RB41(1.40%)、Nocardioides(1.00%)、Sphingomonas(3.32%)、unidentified_Mitochondria(1.11%)；B8a細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬共8個(gè)，分別為Mizugakiibacter(8.97%)、Rhizomicrobium(3.12%)、Gemmatimonas(3.01%)、Bryobacter(1.71%)、RB41(1.30%)、Sphingomonas(2.94%)、unidentified_Mitochondria(1.51%)、Granulicella(1.07%)。而M2013細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬共11個(gè)，分別為Blastococcus(1.12%)、unidentified_TK10(2.25%)、Gemmatimonas(1.33%)、Rhodanobacter(1.14%)、Bryobacter(2.86%)、Bradyrhizobium(1.78%)、Arthrobacter(1.32%)、CandidatusSolibacter(2.37%)、Sphingomonas(1.26%)、Acidothermus(1.75%)、Anaeromyxobacter(1.24%)；M6a細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬共11個(gè)，分別為Mizugakiibacter(1.73%)、Rhizomicrobium(1.80%)、Actinospica(1.04%)、Bryobacter(3.18%)、Bradyrhizobium(1.73%)、BurkholderiaParaburkholderia(1.11%)、Arthrobacter(1.70%)、CandidatusSolibacter(2.13%)、Pseudarthrobacter(1.07%)、Acidibacter(1.33%)、Acidothermus(4.63%)；M6a細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬共8個(gè)，分別為Rhizomicrobium(2.01%)、Bryobacter(2.21%)、Bradyrhizobium(2.20%)、BurkholderiaParaburkholderia(2.56%)、CandidatusSolibacter(2.31%)、Crossiella(1.01%)、Acidothermus(2.95%)、Variibacter(1.24%)。

2.2.2不同咖啡種植年限紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征 隨咖啡種植年限增加，潞江壩咖啡種植地土樣中放線菌門的相對(duì)豐度減少了3.25%；芒市咖啡種植地土樣中變形菌門的相對(duì)豐度提高了5.58%，而綠彎菌門和芽單胞菌門的相對(duì)豐度分別減少了5.94%和1.01%；另外，放線菌門(20.20%)的相對(duì)豐度在M6a土樣中豐度最高，而浮霉菌門(4.85%)和疣微菌門(4.30%)在M20a樣品中豐度最高(表4)。

2.2.3云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析 為了解潞江壩和芒市不同咖啡種植年限的紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，對(duì)其進(jìn)行了基于OUT水平的主成分分析(PCA)，提取出最大程度反映樣品間差異的兩個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為28.34%和15.96%。潞江壩和芒市的不同土樣圍繞PC1軸分開，潞江壩B5a和B8a分布在PC1的負(fù)軸，芒市M2013、M6a和M20a分布在PC1的正軸，說(shuō)明云南干熱區(qū)和濕熱區(qū)的咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯(圖2)。另外，潞江壩B5a與B8a的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，均分布在PC2負(fù)軸；而芒市M2013和M6a與M20a的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，M2013和M6a分布在PC2正軸，而M20a分布在PC2負(fù)軸(圖2)。

圖2 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落PCA分析Fig.2 Principal component analysis (PCA) of bacterial community composition of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

2.3 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落的多樣性分析

潞江壩B5a和B8a的細(xì)菌種類數(shù)目、豐富度(chao1和ACE指數(shù))均比芒市M2013和M6a多，但與M20a無(wú)顯著差異，說(shuō)明潞江壩咖啡種植8 a后和芒市20 a后紅壤細(xì)菌種類數(shù)目和豐富度無(wú)明顯差異，且在潞江壩咖啡種植8 a內(nèi)和芒市咖啡種植6 a內(nèi)并不能顯著提高紅壤細(xì)菌種類數(shù)目和豐富度(表5)。潞江壩B5a與B8a的多樣性指數(shù)shannon無(wú)顯著差異，但與M20a差異顯著；而芒市紅壤細(xì)菌多樣性指數(shù)shannon隨著咖啡種植年限的增加而提高(表5)。另外，潞江壩B5a與B8a的多樣性指數(shù)simpson無(wú)顯著差異，但與芒市3個(gè)咖啡種植地土樣差異顯著；芒市紅壤細(xì)菌多樣性指數(shù)simpson隨著咖啡種植年限的增加并無(wú)顯著提高(表5)。以上結(jié)果表明，咖啡種植年限增長(zhǎng)對(duì)云南熱區(qū)紅壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性無(wú)明顯提高。

表5 云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)Table 5 Bacterial diversity indexes of red soil samples in coffee-growing regions of tropical Yunnan

3 討論

微生物類群數(shù)量是靈敏指示土壤環(huán)境質(zhì)量變化的生物學(xué)指標(biāo)之一，反映了土壤環(huán)境生態(tài)功能的演變規(guī)律[21]。云南保山市潞江壩和德宏芒市是云南主要咖啡種植區(qū)，其紅壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門和厚壁菌門。本研究結(jié)果與稻田紅壤和有機(jī)農(nóng)田紅壤的根際土壤細(xì)菌群落研究結(jié)果相似[22-24]。目前研究表明，氨氧化古菌(AOA)傾向于在酸性和低氮的寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中起作用，而紅壤酸性強(qiáng)、有機(jī)質(zhì)含量低、養(yǎng)分匱乏，因此,AOA在紅壤細(xì)菌中主導(dǎo)氨氧化作用[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在潞江壩和芒市咖啡種植地紅壤中AOA豐度顯著高于其他氨氧化細(xì)菌，可能是云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤的關(guān)鍵氨氧化微生物。另外，2個(gè)咖啡種植地的紅壤中均發(fā)現(xiàn)有利于咖啡生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌屬，如Sphingomonas(降解化學(xué)殺蟲劑)[28]，Blastococcus(抵御不良環(huán)境、防治土壤病害)[29]，Arthrobacter、Acidothermus、Bryobacter和CandidatusSolibacter(分解有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)土壤碳循環(huán))[30-33]。因此，研究云南熱區(qū)咖啡種植紅壤的細(xì)菌類群及其作用，將為保持云南咖啡生態(tài)系統(tǒng)平衡，促進(jìn)云南咖啡產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供重要參考。

咖啡種植年限低于8 a，保山潞江壩相對(duì)于芒市咖啡種植地的紅壤細(xì)菌種類多，并且細(xì)菌豐富度也較高，說(shuō)明云南干熱區(qū)相較于濕熱區(qū)可能更有利于紅壤細(xì)菌的生長(zhǎng)。這可能與不同熱區(qū)的海拔維度、氣候條件、土壤含水量、土壤肥力、咖啡根系生物量、農(nóng)業(yè)管理措施等因素密切相關(guān)。土壤微生物的生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜，并且時(shí)刻處于動(dòng)態(tài)平衡的變化過(guò)程中，影響云南熱區(qū)土壤微生物數(shù)量變化的主控因子還有待深入研究。

另外，不同咖啡種植年限下云南熱區(qū)咖啡種植地紅壤細(xì)菌在群落組成和豐度存在一定差異。隨咖啡種植年限增加，潞江壩或芒市咖啡種植地紅壤一些細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬發(fā)生了變化，并且芒市咖啡種植地的紅壤細(xì)菌群落組成相對(duì)潞江壩變化較大，但2個(gè)區(qū)域咖啡種植地紅壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性并無(wú)明顯提高。目前不同種植年限下紅壤微生物多樣性研究還較少，有的研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物數(shù)量和多樣性隨著種植年限的增加而增多[34-35]，有的研究結(jié)果卻不同[36-39]。這可能與土壤采樣時(shí)間、采樣深度、采樣點(diǎn)肥力差異等有關(guān)，特別是與土壤的最高種植年限密切相關(guān)。最高種植年限不同，土壤的結(jié)構(gòu)、通氣性、水分狀況、養(yǎng)分等理化性狀均會(huì)發(fā)生變化，因而對(duì)土壤微生物多樣性產(chǎn)生了重要影響。