低纖維素酶背景里氏木霉菌株的構(gòu)建和應用

劉杜娟,黃火清,蘇小運

(中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室, 北京 100081)

絲狀真菌里氏木霉在工業(yè)中被廣泛應用于生產(chǎn)纖維素酶，其分泌能力強。里氏木霉分泌的纖維素酶主要為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase, CBH)和內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase, EG)，二者總計占總分泌蛋白的90%～95%[1-2]。由于具備強大的分泌潛能，且還能對蛋白質(zhì)進行糖基化修飾，因此，里氏木霉被認為是一種優(yōu)秀的用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的表達宿主。對絲狀真菌而言，內(nèi)源酶大量分泌表達可能對以其為宿主進行的異源表達造成負面影響，但這為工程改造絲狀真菌提高生產(chǎn)異源酶提供了一種可能性。例如，抑制米曲霉中內(nèi)源性蛋白α-淀粉酶的表達可改善外源蛋白牛凝乳酶的分泌[3]。另有報道，在里氏木霉缺失CBHI的菌株中，重組內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ的產(chǎn)量增加了約4倍[4]，這意味著在里氏木霉中，通過遺傳改造干擾內(nèi)源酶的表達可能有利于異源基因的高水平表達。

對里氏木霉而言，干擾主要纖維素酶基因的表達是創(chuàng)建異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)平臺的必經(jīng)途徑。因此，需要一種方法來有效地破壞該菌中目的基因表達。在里氏木霉中，通過基于同源性的DNA重組(homology dependent recombination, HDR)方法可以將目的基因用篩選標記基因替換從而破壞其表達[5]，然而里氏木霉中HDR的效率很低。敲除參與非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)的ku70[6]或mus53基因[7]可以改善HDR的效率，但需事先制備獲得NHEJ功能減弱的的受體菌株。CRISPR/Cas9系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9)是細菌Ⅱ型適應性免疫系統(tǒng)[8]，其可以作為里氏木霉基因破壞的替代手段。在該系統(tǒng)中，gRNA識別特定的靶DNA序列，在識別位點形成DNA/RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，引導內(nèi)切核酸酶Cas9切割DNA。CRISPR/Cas9技術(shù)已廣泛用于哺乳動物細胞、植物和微生物的基因組編輯，近年來已實現(xiàn)了通過胞內(nèi)表達Cas9[9]和體外組裝Cas9/gRNA復合物快速敲除里氏木霉特定基因[10]的方法，這為干擾主要纖維素酶基因的表達、創(chuàng)建異源蛋白質(zhì)生產(chǎn)平臺打下了良好的基礎(chǔ)。RNAi(RNA inteference)可以沉默目的基因表達，是另一種有效干擾基因表達的方法。和CRISPR/Cas9系統(tǒng)相比，雖然RNAi其并不能將目的基因從基因組上敲除，但其優(yōu)勢在于不僅可以對多個基因(或多拷貝基因)同時進行操作，對必需基因(即敲除該基因后宿主菌無法存活)進行研究，而且操作簡單。RNAi發(fā)揮作用的關(guān)鍵是在胞內(nèi)生成靶序列特異的siRNA(small interfering RNA)，而這可以通過構(gòu)建質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化進入細胞，通過特殊的設(shè)計使得所表達的RNA在胞內(nèi)自動形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，從而被胞內(nèi)的DICER識別并切割成為siRNA[11]。

本實驗室所保存的里氏木霉SUS5菌株(過表達內(nèi)切葡聚糖酶EG2的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株)基因組中整合了多個eg2的基因，且主要分泌CBH1和EG2兩個纖維素酶。本研究嘗試利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合RNAi對eg2基因進行表達沉默，研究通過一步法快速獲得低纖維素酶背景的菌株。在此基礎(chǔ)上，又嘗試表達了來自于NeosartoryafischeriP1 來源的 GH3 家族耐熱β-葡萄糖苷酶NfBgl3A外源基因；相應的，也將該基因轉(zhuǎn)化到正常表達纖維素酶的里氏木霉出發(fā)菌株中，以NfBgl3A基因為模型，對高、低纖維素酶表達背景下的外源基因的表達量進行了對比研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其余菌株和質(zhì)粒均為本實驗室構(gòu)建并保存?；蚬こ叹锸夏久筍US5為過表達內(nèi)切葡聚糖酶EG2的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株?；趐APA質(zhì)粒[12]為骨架構(gòu)建含ampR-pyr4-ampR的重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒pEG2i用于對eg2基因進行干擾。質(zhì)粒pRS-NfBgl3A-solo系將來源于Neosartoryafischeri的NfBgl3A基因插入到里氏木霉的cbh1啟動子和終止子之間并構(gòu)建于pRS424質(zhì)粒中[13]，用于耐熱β-葡萄糖苷酶NfBgl3A基因表達。

1.1.2培養(yǎng)基 土豆培養(yǎng)基(1 L)：土豆浸出物20 g、葡萄糖20 g、固體培養(yǎng)基(PDA)再加入瓊脂20 g。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minimal medium, MM)(1 L): (NH4)2SO45.0 g、KH2PO415.0 g、 MgSO4·7H2O 0.6 g、CaCl2·2H2O 0.6 g、CoCl2·6H2O 0.003 7 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、 ZnSO4·7H2O 0.001 4 g、MnSO4·H2O, 0.001 6 g、 碳源為2% 葡萄糖(體積分數(shù))，自然pH。

纖維素誘導培養(yǎng)基：MM培養(yǎng)基中將碳源替換為2%微晶纖維素Avicel，自然pH。

1.1.3主要試劑 尿嘧啶、PEG4000、山梨醇、濾紙、羧甲基纖維素(CMC-Na)和pNP-β-1,4-glucose(pNPG)、4-methylumbelliferyl-β-D-lactopyranoside(MUL)、DMSO購自Sigma公司；Taq酶和限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ和AscⅠ)購買自Fermentas公司；重組Cas9蛋白購自南京金斯瑞生物科技有限公司；2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix和pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit購自北京全式金有限公司；Fungal DNA Midi Kit真菌基因組提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；RNA純化試劑盒購自北京天根公司；MEGAshortscript T7 Transcrip’s Kit購自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)；無縫拼接試劑盒(2×ClonExpress Mix (ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit, Vazyme)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。引物(表1)由上海美吉生物技術(shù)有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.4主要儀器 主要儀器包括T100TM普通PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)和CFX-96實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機，日本HIMAC公司；Synergy H1酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 pEG2i質(zhì)粒構(gòu)建

利用真菌基因組提取試劑盒提取里氏木霉SUS5基因組DNA，以此為模板，以Eg2-F/Eg2-R、Pdc1-F/Pdc1-R及Eno1-F/Eno1-R(表1)為引物，分別擴增503 bp的eg2基因片段(933～1 436 bp)及pdc1和eno1啟動子(均為1 000 bp)，1%瓊脂糖凝膠電泳、回收備用。通過引物設(shè)計，使擴增得到的pdc1啟動子及eno1啟動子具有和pAPA質(zhì)粒NotⅠ和AscⅠ兩端短的重疊區(qū)域(15～20 bp)。PCR反應體系(50 μL)：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，F(xiàn)astPfu PCR SuperMix 25 μL，ddH2O 12 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。首先使用Gibson assembly方法[14]構(gòu)建含有對向啟動子(pdc1和eno1兩個啟動子方向相對)的中間質(zhì)粒載體pPdc1-Eno1：用NotⅠ和AscⅠ將pAPA質(zhì)粒進行雙酶切，然后利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit處理該質(zhì)粒與pdc1啟動子及eno1啟動子片段。反應體系(10 μL)：2×Assembly Mix 5 μL，線性化質(zhì)粒 3 μL，基因片段共1.0 μL，dd H2O 1.0 μL。轉(zhuǎn)化TransI-T1并篩選陽性克隆。同樣構(gòu)建對eg2基因進行干擾的重組質(zhì)粒pEG2i:首先將質(zhì)粒pPdc1-Eno1用EcoRⅠ酶切線性化，再與上述擴增得到的eg2基因無縫拼接，熱激轉(zhuǎn)化TransI-T1并篩選陽性克隆。經(jīng)PCR及測序驗證得到正確重組的質(zhì)粒pEG2i。

1.3 設(shè)計靶向chh1的gRNA

使用E-CRISPR服務器(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)設(shè)計針對cbh1的gRNA序列[10]。在gRNA的上游設(shè)計T7啟動子(5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′)，相應的合成互補的兩條單鏈脫氧核糖核苷酸引物gRNA-cbh1-F3和gRNA-cbh1-R3(表1)。等量(1 μg)混合兩種互補寡核苷酸，沸水浴10 min，室溫下緩慢冷卻以退火。使用該退火的雙鏈DNA作為模板，使用MEGAshortscript T7 Transcrip’s Kit體外轉(zhuǎn)錄獲得gRNA,使用RNA純化試劑盒純化。

1.4 里氏木霉轉(zhuǎn)化

將里氏木霉孢子接種于PDA平板，28 ℃靜置培養(yǎng)，5 d后收集新鮮孢子，用滅菌棉簽刮下孢子后溶于水，收集孢子懸液并通過200目篩過濾去除菌絲及雜質(zhì)，接種1×107個孢子于50 mL土豆培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r·min-1震蕩培養(yǎng)12 h。用200目篩過濾收集萌發(fā)的菌絲，以無菌水及1.2 mol·L-1MgSO4溶液洗滌，之后溶于15 mL含150 mg Lysing enzymes 的1.2 mol·L-1MgSO4溶液，28 ℃消化2 h后收集原生質(zhì)體。12 mg Cas9與6.5 mg gRNA混合，室溫孵育30 min，得到Cas9/gRNA復合物。以PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[15]將5 mg pEG2i質(zhì)粒和Cas9/gRNA復合物共同轉(zhuǎn)入里氏木霉SUS5原生質(zhì)體，涂布于含1 mol·L-1山梨醇的MM-glucose瓊脂糖培養(yǎng)基上生長。

4 d后隨機挑取平板上的轉(zhuǎn)化子，接種于含MM-glucose培養(yǎng)基的固體平板上，28 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)3～4 d。挑取平板上菌落少許菌絲，使用UniversAll組織提取/ PCR試劑盒提取基因組DNA作為模板，以YZ-Eg2-F/R為引物(表1)PCR驗證pEG2i質(zhì)粒是否已整合進入里氏木霉的基因組。對Cas9/gRNA介導的cbh1基因組座位的編輯，用YZ-cbh1F/R為引物(表1)PCR驗證。同上采取PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pRS-NfBgl3A-solo質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉細胞中，挑轉(zhuǎn)化子驗證。

1.5 纖維素酶和異源β-葡萄糖苷酶基因誘導表達

將2×107個里氏木霉新鮮孢子接種于50 mL MM-glucose種子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d。用12層紗布過濾收集菌絲，并用無菌水充分沖洗、濾干。將等量濕重(1 g)的菌絲轉(zhuǎn)接于50 mL 誘導培養(yǎng)基中(MM-Avicel)，28 ℃、180 r·min-1振搖培養(yǎng)。從24 h 開始收集發(fā)酵液，每24 h 收集一次，酶液樣品存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 纖維素酶酶活測定

1.6.1β-葡萄糖苷酶酶活測定 用對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)作為底物進行測定?；旌?25 μL 4 mmol·L-1的pNPG溶液和275 μL的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH 5.0)，50 ℃水浴平衡。加入適當稀釋的酶液100 μL，50 ℃水浴保溫10 min，向反應體系中加入1.5 mL Na2CO3試劑以終止反應，測定405 nm的吸光度。在50 ℃、pH 5.0的條件下，每小時水解pNPG，產(chǎn)生1 μmol的pNP所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.6.2外切纖維素酶活的測定 稱取15 mg MUL溶于500 μL DMSO，再將其轉(zhuǎn)移到30 mL檸檬酸緩沖液(pH 5.0，50 mmol·L-1)中。將25 μL適當稀釋的酶液、200 μL MUL和25 μL葡萄糖(1 mol·L-1)混合，此為不加纖維二糖實驗組。在混合溶液中，葡萄糖會抑制β-葡萄糖苷酶降解MUL，因此，測得的活性實際為外切纖維素酶活(CBH1)和內(nèi)切纖維素酶酶(EG)的活性。同時添加纖維二糖實驗組：25 μL酶液和200 μL MUL、25 μL葡萄糖(1 mol·L-1)、25 μL(50 mmol·L-1)纖維二糖，于50 ℃反應20 min。加入纖維二糖會抑制CBH1的活性，因此測得的是EG的活性。終止反應時，加入250 μL Na2CO3(1 mol·L-1)，于370 nm測定吸光度。將不加纖維二糖實驗組酶活減去添加纖維二糖實驗組酶活，即為外切纖維素酶較為特異的活性。一單位外切纖維素酶酶活定義為每分鐘催化1 nmol MUL水解所需要的酶量。

1.6.3內(nèi)切纖維素酶酶活測定 采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)作為底物進行測定。用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol·L-1、pH 5.0)配制1.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。羧甲基纖維素鈉溶液應立即使用，使用前適當搖勻。取適當稀釋的酶液100 μL，加入到900 μL CMC-Na底物中，振蕩混合均勻，50 ℃水浴10 min，向各試管中加入1.5 mL DNS試劑，再向空白中加酶液0.1 mL，混合均勻。在沸水中煮5 min，迅速冷卻，測定540 nm的吸光度。在50 ℃、pH 5.0的條件下，每小時水解羧甲基纖維素鈉，產(chǎn)生1 μmol還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

1.7 RT-qPCR

接種2×107個里氏木霉孢子至MM+glucose液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min1振搖培養(yǎng)48 h，收集菌絲。在液氮中研磨菌絲，采用TRIzol試劑盒提取總RNA，并利用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以actin基因作為內(nèi)參，通過熒光定量PCR(RT-qPCR-EG2F/R，表1)檢測eg2的轉(zhuǎn)錄水平，用2-ΔΔCT[16]方法對目的基因相對轉(zhuǎn)錄豐度進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 chh1的基因敲除

將成功構(gòu)建的pEG2i質(zhì)粒和Cas9/gRNA復合物轉(zhuǎn)入里氏木霉SUS5菌株。理論上除了對eg2基因進行RNAi介導的基因沉默外，還能依賴于CRISPR/Cas9系統(tǒng)對cbh1基因進行敲除。驗證引物分別設(shè)計在gRNA識別cbh1位點的前后大約250 bp處。從圖1可以看出，以出發(fā)菌株SUS5作模板擴增出500 bp左右的特異性條帶，和預期大小相符；以大部分轉(zhuǎn)化子為模板擴增，雖然擴增出了此特異性條帶，但經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)和基因組序列完全一致，未能發(fā)生有效的基因組編輯。而5號、8號和11號轉(zhuǎn)化子均未能擴增出特異性條帶。根據(jù)使用Cas9/gRNA復合物對里氏木霉基因組編輯的報道[10]，里氏木霉中使用體外組裝的Cas9/gRNA編輯基因時主要發(fā)生較大DNA片段的插入，這些片段包括染色體DNA、質(zhì)粒DNA或污染的大腸桿菌的染色體DNA。因此，這些轉(zhuǎn)化子中有可能發(fā)生cbh1基因組座位的編輯。

注：M為DNA分子量標準；1～13為轉(zhuǎn)化子；14為SUS5。Note: Lane M is DNA molecular mass marker; lanes 1～13 are transformants; lane 14 is SUS5.圖1 轉(zhuǎn)化子中cbh1基因敲除的PCR鑒定Fig.1 PCR verification of cbh1 disruption of T. reesei transformants

2.2 選定轉(zhuǎn)化子中CBH1和EG2分泌表達情況

將5號、8號和11號轉(zhuǎn)化子進行搖瓶發(fā)酵，并將轉(zhuǎn)化子發(fā)酵第4 d的培養(yǎng)上清(即粗酶液)進行SDS-PAGE分析(圖2)?？梢钥闯?，11號轉(zhuǎn)化子的粗酶液中沒有CBH1蛋白，說明基因組中的cbh1基因已被成功敲除，因此將該菌株命名為SUS6。同時， 11號轉(zhuǎn)化子中的EG2的表達受到了較大程度的抑制。分別測量外切纖維素酶以及內(nèi)切纖維素酶的酶活，與出發(fā)菌株相比，11號菌株的外切纖維素酶以及內(nèi)切纖維素酶活性均顯著降低。因此，相對于出發(fā)菌株，該菌主要纖維素酶的表達顯著降低甚至完全消失，因此構(gòu)建的菌株可被認為是低纖維素酶背景的里氏木霉菌株。

注：M為蛋白分子量標準；1為出發(fā)菌株SUS5；2～4分別為5號、8號和11號轉(zhuǎn)化子。Note: M is protein molecular mass marker；lane 1 is SUS5；lanes 2～4 are transformant 5, 8, and 11, respectively. 圖2 轉(zhuǎn)化子中CBH1和EG2分泌表達情況Fig.2 Secreted expression of CBH1 and EG2 in transformants

2.3 eg2基因轉(zhuǎn)錄水平分析

使用熒光定量RT-qPCR方法對eg2基因的表達進行分析，轉(zhuǎn)入Cas9/gRNA蛋白以及RNAi表達質(zhì)粒的SUS6轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株SUS5的eg2基因的相對轉(zhuǎn)錄豐度進行比較。與原始菌株SUS5相比，轉(zhuǎn)化子eg2基因的相對轉(zhuǎn)錄豐度下降了約98%，這表明eg2基因的表達受到了顯著的抑制；對應于EG2蛋白大大下降的表達量。

2.4 低纖維素酶背景菌株中外源基因NfBgl3A表達分析

以所得到的低纖維素酶背景菌株SUS6為宿主菌，將NfBgl3A的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到該菌中，分別選取兩株代表性轉(zhuǎn)化子作搖瓶發(fā)酵，測定b-葡萄糖苷酶的酶活并SDS-PAGE分析蛋白的分泌表達情況。如圖3所示，以SUS5為宿主菌的兩個轉(zhuǎn)化子(SUS5/S7和SUS5/S24)，其最高酶活出現(xiàn)在第1 d，分別為11.6和31.9 U·mL-1，隨后則迅速隨之下降至無法觀測；而以SUS6菌株為宿主菌的兩個代表性轉(zhuǎn)化子(SUS6/S2和SUS6/S9)，其最高酶活分別為172.4和79.3 U·mL-1，分別出現(xiàn)在第2和第1 d。從圖3B也可看出，以SUS5為宿主菌表達的NfBgl3A，最高酶活所在的第1 d目的蛋白b-葡萄糖苷酶的條帶顯著弱于以SUS6菌株為宿主菌的兩個代表性轉(zhuǎn)化子。因此，實驗說明以低纖維素酶背景的菌株來表達異源基因NfBgl3A，可明顯提高目的基因的表達水平。

注： M為蛋白分子量標準；1和2為SUS5發(fā)酵第1和第2 d樣品；3和4為SUS5/S7第1和第2 d樣品；5和6為SUS5/S24第1和第2 d樣品；7和8為SUS6第1和第2 d樣品；9和10為SUS6/S2第1和第2 d樣品；11和12為SUS6/S9第1和第2 d樣品。Note: Lane M is protein molecular mass marker；lanes 1 & 2 are fermentation supernatants of SUS5 for 1 and 2 d；lanes 3 & 4 are fermentation supernatants of SUS5/S7 for for 1 and 2 d；lanes 5 & 6 are fermentation supernatants of SUS5/S24 for 1 and 2 d；lanes 7 & 8 are fermentation supernatants of SUS6 for 1 and 2 d；lanes 9 & 10 are fermentation supernatants of SUS6/S2 for 1 and 2 d；lanes 11 & 12 are fermentation supernatants of SUS6/S9 for 1 and 2 d.圖3 SUS6菌株中NfBgl3A表達增強Fig.3 Enhanced expression of NfBgl3A in the SUS6 T. reesei strain

3 討論

本研究使用CRISPR/Cas9和RNAi技術(shù)相結(jié)合，在敲除cbh1基因的同時，還顯著降低了宿主菌中主要的內(nèi)切纖維素酶eg2的表達，從而一步快速得到了低纖維素酶背景的菌株。使用RNAi對目的基因進行表達沉默，目前主要有三種質(zhì)粒的構(gòu)建策略：表達反義RNA、使用對向的雙啟動子和構(gòu)建表達發(fā)卡狀RNA的質(zhì)粒[17]。本研究采用對向雙啟動子將eg2的一段外顯子片段構(gòu)建到pdc1和eno1強組成型啟動子之間，因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉后，兩個啟動子會同時對該基因片段進行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄得到的RNA在胞內(nèi)會相互識別、退火并形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，為Dicer蛋白剪切為21～25 nt的小RNA片段，指導對目的基因mRNA的剪切。獲得的轉(zhuǎn)化子CBH1外切纖維素酶的表達完全消失，而EG2內(nèi)切纖維素酶的分泌也大大下降，證明在Cas9切割、破壞cbh1基因的同時，RNAi機制還將eg2的mRNA豐度降低了，因此組合CRISPR/Cas9和RNAi技術(shù)這種方法能非常有效和快速的獲得低纖維素酶背景的里氏木霉工程菌。

使用體外裝載Cas9/gRNA對里氏木霉進行基因組編輯，主要發(fā)生大片段的染色體或質(zhì)粒DNA在切割位點的插入。由于有的插入片段可能長度很大， PCR難以擴增出條帶，因此，以不能擴增出條帶來判定發(fā)生了基因組編輯，并進而通過SDS-PAGE來分析表型。據(jù)此得到的11號轉(zhuǎn)化子(SUS6)在cbh1基因組座位上發(fā)生了基因組編輯,從而不能分泌表達CBH1蛋白。其他兩株菌雖然也不能擴增出任何條帶，但分析發(fā)現(xiàn)，CBH1蛋白仍然被大量表達，因此未能在該基因組座位上發(fā)生基因組編輯。

里氏木霉分泌表達大量的內(nèi)源纖維素酶，這些蛋白需要經(jīng)過基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、糖基化、轉(zhuǎn)運等過程才能順利分泌到胞外。相似的，在里氏木霉中表達外源基因也會同樣經(jīng)歷這些過程，因此，如果外源酶和內(nèi)源纖維素酶受到同樣的調(diào)控機制，那么，它們在分泌表達時很可能存在一定的競爭。例如，在絲狀真菌中進行外源基因的表達常需要使用多拷貝策略，而當啟動子拷貝數(shù)過多時，則可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子對于啟動子的“滴定效應”[18]，反而降低目的基因的表達。對NfBgl3A的表達發(fā)現(xiàn)，在低遺傳背景的里氏木霉菌株中表達該酶，不管是酶活還是SDS-PAGE檢測，均優(yōu)于在未破壞纖維素酶表達的出發(fā)菌株中進行的實驗。NfBgl3A、內(nèi)源酶cbh1和額外拷貝的eg2基因的表達均使用的是cbh1啟動子，因此，NfBgl3A和內(nèi)源纖維素酶的表達不太可能是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程發(fā)生了競爭，而更可能是在其他調(diào)控途徑(例如分泌途徑)上有所競爭。但弄清楚相關(guān)的分子機制還需要通過更多的實驗來加以證明。類似的，在里氏木霉中使用RNAi單獨干擾CBH1的表達能提高黑曲霉脂肪酶的表達[19]。值得注意的是，通過對已發(fā)表的里氏木霉在纖維素和葡萄糖培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可以發(fā)現(xiàn)，許多已發(fā)現(xiàn)的分泌途徑關(guān)鍵蛋白所對應基因的轉(zhuǎn)錄豐度在纖維素酶表達時并未顯著提高[20-21]。因此，如果這些關(guān)鍵蛋白是分泌的限制性因素，當外源基因大量表達時，這些酶就可能和內(nèi)源纖維素酶競爭分泌通道；而將纖維素酶敲除后，則可提高相應外源基因的表達。