竹材木質(zhì)素降解菌的篩選與鑒定*

劉 劍 李南林

(肇慶市林業(yè)局森林病蟲害防治檢疫站，廣東 肇慶 526040)

我國作為世界上竹林面積最大、竹類資源最為豐富的國家，竹材資源的利用始終受到木質(zhì)素降解的影響，導(dǎo)致竹類資源一直難以實(shí)現(xiàn)綜合利用[1-3]。竹材木質(zhì)素因木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常同纖維等物質(zhì)結(jié)合緊密，難于降解[4]。因此，竹材木質(zhì)素的降解一直受到研究者的關(guān)注，而天然竹材木質(zhì)素的降解是在自然條件下，通過多種微生物共同作用完成的，而微生物對竹材木質(zhì)素的降解不僅有降解率高的優(yōu)點(diǎn)，而且還能實(shí)現(xiàn)竹材資源的再利用，篩選具有良好降解能力的木質(zhì)素降解菌一直是研究者關(guān)注的問題[5-6]。文章以天然竹林中腐爛的竹材為材料，通過篩選得到一株具有竹材木質(zhì)素降解能力的菌株，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對菌株進(jìn)行鑒定，為解決竹材木質(zhì)素降解及竹纖維提取等竹資源應(yīng)用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分離樣品采集于廣東省肇慶市廣寧縣市屬葵垌國有林場天然竹林中腐爛的竹材。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（以下簡稱：PDA 培養(yǎng)基）；PDA 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入愈創(chuàng)木酚（0.5 g/L）和苯胺藍(lán)（0.1 g/L）制作PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基和PDA-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基；液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L）：葡萄糖 20 g/L，酒石酸銨0.2 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，硫胺素(VB1)0.1 g/L，CuSO47H2O 0.007 g/L，MnSO40.035 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，COCl2·6H2O 0.001 g/L，吐溫-80 1.0 g/L[7]。

1.3 方法

1.3.1 篩選竹材木質(zhì)素降解菌 通過平板稀釋法、平板劃線法對竹材木質(zhì)素降解菌進(jìn)行分離純化，將分離純化的菌株通過PDA-愈創(chuàng)木酚變色及PDA-苯胺藍(lán)退色反應(yīng)進(jìn)行初篩，將初篩得到的菌株進(jìn)行酶活力復(fù)篩，主要測定3 種木質(zhì)素降解酶活力，其中漆酶（Lac）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[8]；木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）活性測定采用黎蘆醇法[9]；錳過氧化物酶（Mnp）活性測定采用微量法[10]。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）菌落的形態(tài)觀察鑒定

將FG-22 菌株在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對平板上菌落形態(tài)和菌絲進(jìn)行觀察并根據(jù)魏景超著真菌分類學(xué)手冊《真菌鑒定手冊》[11]進(jìn)行鑒定分類。

（2）菌株的分子生物學(xué)鑒定

對FG-22 菌株的基因組總DNA 提取方法采用CTAB 法[12];以ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’）和ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’）為引物對提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[13], PCR 擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[14]，并將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行基因測序；通過將所測得的18SrDNA 序列與NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行相似性比較分析，再通過MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素降解菌株的篩選分離

利用腐爛的竹材，根據(jù)不同的菌落形態(tài)通過平板劃線法分離純化得到74 株真菌菌株。

2.2 木質(zhì)素降解菌的初篩

2.2.1 PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色的篩選結(jié)果 將2.1 篩選分離得到的74 株真菌接種到PDA-愈創(chuàng)木酚平板培養(yǎng)基上進(jìn)行顯色反應(yīng)，其中19 株菌株產(chǎn)生明顯的顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)結(jié)果詳見表1。顯色反應(yīng)見圖1。

表1 PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色初篩19 個(gè)菌株的顯色結(jié)果Tab.1 Primary screening of 19 strains by PDA-Guaiacol plate chromatography

注：- 表示不顯色；±代表開始顯色；+、+ +、+ + +、+ + + +顯色圈逐漸增大Note: - indicates no color rendering; ± indicates start of color rendering; +, + +, + + +, + + + + color developing circles increase gradually

通過表1 可以得出，19 個(gè)菌株都可在PDA-愈創(chuàng)木酚平板培養(yǎng)基上產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色隨著時(shí)間的延長不斷增強(qiáng)。而不同的菌株在顯色時(shí)間和顯色圈大小有差異，F(xiàn)G-08、FG-19、FG-22、FG-45、FG-63和FG-69 等6 個(gè)菌株顯色反應(yīng)較快，并且顯色圈較大。由此可判斷出FG-08、FG-19、FG-22、FG-45、FG-63 和FG-69 這6 株菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)漆酶（Lac）能力。

2.2.2 PDA-苯胺藍(lán)平板退色的篩選結(jié)果 根據(jù)PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)結(jié)果，將在PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色的19 種菌株接種在PDA-苯胺藍(lán)中進(jìn)行退色反應(yīng)。

表2 菌株的PDA-苯胺藍(lán)平板退色反應(yīng)結(jié)果Tab.2 Discoloration of fungi by PDA-Aniline Blue Plate

圖1 菌株FG-22 愈創(chuàng)木酚變色及苯胺藍(lán)退色Fig.1 Discoloration of guaiacol and decolorization of aniline blue by fungus FG-22

通過表2 可以看出，19 種菌株中發(fā)現(xiàn)有7 株菌（FG-04、FG-19、FG-22、FG-27、FG-33、FG-45 和FG-69）在PDA-苯胺藍(lán)平板上發(fā)生明顯退色反應(yīng)，并且在第4-6 天退色較為明顯的為FG-19、FG-22、FG-45、FG-69，并且出現(xiàn)全退色現(xiàn)象。由此初步表明這4 株菌株有產(chǎn)過氧化物酶類（Mnp 和Lip）的能力，而其他菌株未發(fā)生退色反應(yīng)或退色反應(yīng)不明顯，表明不產(chǎn)生降解木素質(zhì)的過氧化物酶類。PDA-苯胺藍(lán)退色反應(yīng)詳見圖1。

2.3 4 個(gè)菌株的復(fù)篩

根據(jù)以上PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)及PDA-苯胺藍(lán)平板退色反應(yīng)的初篩結(jié)果，對FG-19、FG-22、FG-45、FG-69 菌株進(jìn)行液態(tài)產(chǎn)酶復(fù)篩，測定其各自發(fā)酵液中漆酶（Lac）及過氧化物酶類（Mnp 和Lip）的酶活力，結(jié)果見圖2 和圖3。

圖2 4 個(gè)菌株的Lac 酶活變化Fig.2 Breakdown charts of lactase activities of four fungi

圖3 4 個(gè)菌株的過氧化物酶類（Mnp 和Lip ）酶活變化Fig.3 Breakdown charts of peroxidase (Mnp and Lip) activities in four fungi

從圖2 可以看出，4 個(gè)菌株均可出產(chǎn)Lac，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長酶活力不斷發(fā)生變化。從第5 天起各菌株的酶活明顯增高，在7～9 d 時(shí)分別達(dá)到產(chǎn)酶高峰值。在第7 天，F(xiàn)G-22 具有最高的產(chǎn)酶值，其酶活可達(dá)到10.8 U·mL-1，是FG-69 的7.14 倍。FG-19 和FG-45 的產(chǎn)酶能力比較接近。在酶活達(dá)到最高峰后，各菌株酶活開始逐漸下降直至趨于穩(wěn)定。

從圖3 可以看出，4 個(gè)菌株均有一定產(chǎn)生過氧化物酶類（MnP 和LiP）的能力。在第9 天，F(xiàn)G-22 達(dá)到最大產(chǎn)酶高峰，酶活力為20.16 U·mL-1，為FG-69 的2.2 倍。酶活力不斷達(dá)到高峰后恢復(fù)至穩(wěn)定，酶活力始終維持在19 U·mL-1。而FG-19 的過氧化物酶類最高酶活力雖然達(dá)到21.87 U·mL-1，但FG-19 的漆酶活力明顯小于FG-22。因此，綜合以上結(jié)果，菌株FG-22 具有較高的產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的綜合能力。

2.4 菌株FG-22 的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株FG-22 的鑒定：FG-22 菌株在平板上快速呈現(xiàn)出菌落特征，菌落呈白色、圓形，菌落成長較快，在平板培養(yǎng)7～9 d 就覆蓋平板，菌落新生長區(qū)的菌絲分布均勻，呈分散、有序的絮狀，菌落，表面較為平滑，新生長的菌絲無色，呈節(jié)狀分隔。

2.4.2 菌株FG-22 的rDNAITS 區(qū)PCR 擴(kuò)增結(jié)果 根據(jù)分子生物學(xué)的測序結(jié)果，所測得的序列如下所示：

AGTTGTACTGCGGAGACATTAACGAGTTTTGAACGAGTTGTAGCTGGCCTTCCGGGGCATGTGCACGCTCTGCTCATCCACTCTACCCCTGTGCACTTACTGTAGGTTGGCGTGGGCTCCTTTGCGGGAGCATTCTGCCGGCCTATGTATACTACAAACACTTTAAAGTATCAGAATGTAAACGCGTCTAACGCATCTATAATACAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACTTATAAATCCTTGTGATCTATAAGCTTGGACTTGGAGGCTTGCTGGCCCTTGTTGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTGGCTCGATTCCGTACGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGTGTTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCATTAGGACAACTTTTTAACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCCGAGTTGTAGTCTGGAGAAGCGTCTTCCGCGCTGGACCGTGTACAAGTCTCCTGA

2.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹 利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），通過基因序列相似性對比和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，菌株FG-22 與接收號為AY840585（Trametes versicolor）的ITS 序列最為接近，相似度達(dá)到98%，結(jié)合FG-22 菌落的形態(tài)特征，初步確定FG-22 屬多孔科、云芝屬的雜色云芝（Trametes versicolor）。

圖4 基于菌株FG-22 及來自GenBank 的ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees based on FG-22 fungi and ITS sequences from GenBank

3 結(jié)論與討論

3.1 通過平板劃線法對49 份腐爛的竹材樣品中分離純化得到74 株真菌，并對74 株真菌進(jìn)行木質(zhì)素降解篩選，經(jīng)過PDA-愈創(chuàng)木酚平板變色初篩得到19 株變色明顯的菌株，并對這19 株進(jìn)行PDA-苯胺藍(lán)退色篩選，其中FG-19、FG-22、FG-45、FG-694 株菌退色較為明顯，并對這4 株菌進(jìn)行酶活力測定復(fù)篩，通過酶活力測定發(fā)現(xiàn)菌株FG-22 具有較好的降解木質(zhì)素的綜合酶活力。

3.2 通過對FG-22 進(jìn)行菌落形態(tài)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等分子生物學(xué)鑒定，確定FG-22 菌株屬多孔科、云芝屬的雜色云芝（Trametes versicolor）。

3.3 自然界中，木質(zhì)素的降解主要是通過真菌、細(xì)菌和微生物的共同作用，其中真菌在降解木質(zhì)素中扮演著非常重要的作用，而研究者也將研究的重點(diǎn)側(cè)重于真菌對木質(zhì)素的降解，目前，研究較多的有黃孢原毛平革菌、變色栓菌、煙管菌、彩絨革蓋菌等白腐菌[15]。而文章通過從天然腐爛的竹材中新分離篩選得到一株新的木質(zhì)素降解菌——雜色云芝（Trametes versicolor），對竹材木質(zhì)素的降解更有效，為竹材木質(zhì)素降解的進(jìn)一步研究提供借鑒和參考。