水分含量對藍藻堆肥腐熟及藻毒素含量的影響

汪晶晶，鄧 威，方夢縈，李玉成，吳 涓，張學勝，王 寧

近年來，隨著巢湖流域內(nèi)人口的增加和工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，水體富營養(yǎng)化進程加快，導致藍藻水華頻繁暴發(fā)[1]。有毒藍藻細胞破裂后釋放出多種不同類型的藻毒素，其中微囊藻毒素（Microcystin，MC）是一類出現(xiàn)頻率高、產(chǎn)生量大和造成危害嚴重的藻毒素[2]。目前，可大規(guī)模推廣的藍藻污染治理技術(shù)主要有厭氧發(fā)酵和好氧堆肥，相對于厭氧發(fā)酵，好氧堆肥投資較低，對技術(shù)的要求不高，運行管理也較為簡單。雖然好氧處理對MC有明顯的生物降解效果[3-4]，但不恰當?shù)奶幚頃е露逊十a(chǎn)品未腐熟且殘留較多的MC，還田后不利于作物生長，甚至危害人類健康[5]。以往的研究主要以脫水藻泥為原料并在室內(nèi)容器中小試，如江君等[6-8]研究物料比、C/N以及水分對堆肥效果及微囊藻毒素降解的影響，主要通過有機質(zhì)、氨氮和C/N等指標判斷堆肥是否腐熟，而通過腐質(zhì)化指標評價藍藻有機肥腐熟度的研究較少。在藍藻好氧堆肥的實際生產(chǎn)過程中，藍藻脫水處理技術(shù)成本較高且不利于實際推廣應用，如何利用堆肥輔料的特點來降低藍藻含水率、確定堆體最適宜含水量、促進堆肥快速腐熟且能最大限度地降解物料中的MC尚不明確。

在影響好氧堆肥過程的諸多因素中，水分含量是對微生物的生長代謝起著關(guān)鍵作用的因素，堆肥過程中適宜的水分含量為50%～60%[9-11]。打撈的新鮮藍藻水分含量較高且C/N較低，因此需要添加其他低含水量且含碳量較高的物料來調(diào)節(jié)堆體參數(shù)。稻殼作為一種常見的富含有機質(zhì)的干介質(zhì)，不僅能夠調(diào)節(jié)水分和C/N，還能作為結(jié)構(gòu)調(diào)理劑，增加混合堆體的粒度和孔隙率。考慮到稻殼的比重小，在實際中需結(jié)合其他農(nóng)業(yè)廢棄物配合使用，以提高工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。

本實驗以藍藻、蘑菇菌渣和水稻稻殼聯(lián)合堆肥，確定3種物料比例（以干質(zhì)量計算）進行混合堆制，調(diào)節(jié)堆體水分含量分別為50%、55%和60%，同時使堆體的C/N滿足最適宜比例[10，12]，進行室外開放環(huán)境中較大規(guī)模的堆肥試驗，研究堆體不同初始含水率條件下藍藻堆肥的腐熟效果及藻毒素的降解效率，以期為藍藻堆肥腐熟及無害化處理提供理論依據(jù)，探索簡易且安全高效的藍藻好氧堆肥生產(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 物料來源

實驗于2018年11月進行。堆肥實驗所用藍藻打撈自安徽省合肥市巢湖塘西河口。菌渣取自安徽天都靈芝制品公司，用于調(diào)節(jié)堆體參數(shù)。水稻稻殼取自試驗基地附近米廠，用于調(diào)節(jié)堆體含水率。原料基本理化性質(zhì)列于表1。

1.2 堆肥實驗

將打撈自巢湖的藍藻生物質(zhì)經(jīng)0～7 d自然晾曬的前處理（含水率＞90%），分別取晾曬第7、5、0 d的藍藻（藍藻含水率不同），同時添加相同量的菌渣和不同量的稻殼調(diào)節(jié)堆體初始含水率和C/N。試驗分為3個含水率處理，即 50%（W50%）、55%（W55%）和 60%（W60%）。堆體由藍藻添加菌渣和水稻稻殼以及1%的EM菌（有效微生物群，可以改善和加速堆肥的過程）混合堆制而成，3個處理組藍藻和菌渣用量均為1000 kg，利用水稻稻殼來調(diào)節(jié)堆體的水分含量（增加堆體孔隙率、便于堆體升溫和避免高水分導致厭氧環(huán)境產(chǎn)生惡臭現(xiàn)象），3個處理中稻殼添加量分別為400、200、100 kg，使堆體的初始含水率分別為50%、55%和60%，堆體最終C/N約為22.13。每組2個重復。堆體按長×寬×高為1.0 m×1.0 m×0.5 m自然堆置。堆制時間為2018年11月5日至12月22日，每隔10 d翻堆一次。整個試驗在安徽省合肥市紫蓬鎮(zhèn)試驗基地進行。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 采樣時間與方法

取樣時間分別為堆制當日，以及堆制后6、12、20、28、38、48 d。取樣時，在堆體的上部、中部和下部各取物料300 g，混勻后作為一個堆體的樣品。每個樣品分為2份：一份為新鮮樣品，保存在4℃的冰箱中，用于測定pH、種子發(fā)芽指數(shù)和藻毒素含量；另一份放置于陰涼處晾干，研磨過篩，陰涼通風處貯存，用于測定總碳、總氮、總磷、總鉀和腐殖質(zhì)及其組分含量。

表1 堆肥原料的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic characteristics of composting materials

1.3.2 測定指標與方法

堆肥溫度：用紅外線溫度探測儀（SENIT/SNT 550，德國衡利）測定。

全碳、全氮及pH的測定參照有機肥料標準（NY 525—2012）。全碳采用重鉻酸鉀外加熱法測定；全氮采用硫酸-過氧化氫消煮，凱氏定氮法測定。

pH：稱取過20目篩的試樣5.0 g于100 mL燒杯中，加50 mL純水，恒溫振蕩25 min，靜置30 min后取上清液，用pH酸度計測定。

種子發(fā)芽率[13]：用以評價堆肥是否腐熟以及對植物的毒性。以液固比10 L·kg-1浸提鮮樣，取10 mL提取液加入鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，點播30粒油菜種子，在（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，測定種子發(fā)芽率（GI），同時以純水作為對照。GI（%）由下式確定：

腐殖質(zhì)及其組分含量：采用腐殖質(zhì)組成修改法，主要參照Kumada方法，并在此基礎(chǔ)上修改了提取溫度和分組方法[14-15]。腐殖質(zhì)（Humus，HS）、胡敏酸（Humic acid，HA）和富里酸（Fulvic acid，F(xiàn)A）含量用總有機碳分析儀（vario TOCcube）測定。

微囊藻毒素含量（MC-LR、MC-RR）[16-17]：稱取5 g（準確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入25 mL 5%乙酸，超聲振蕩30 min后離心5 min（10 000 r·min-1），將所得上清液置于水浴鍋上進行蒸發(fā)濃縮，離心得到微囊藻毒素粗提液，粗提液通過C18-SPE小柱（預先用3 mL甲醇和3 mL水平衡），依次用3 mL 25%甲醇水溶液淋洗，3 mL 80%甲醇（內(nèi)含0.1%的三氟乙酸）水溶液洗脫。洗脫液于65℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1.0 mL甲醇溶液溶解，0.22μm膜過濾，供HPLC分析。HPLC分析條件：Waters Alliannce-2695型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器為Waters-2996型，柱溫35℃，檢測波長238 nm，流動相由A乙腈和B純水（內(nèi)含0.08%的三氟乙酸）組成，梯度洗脫，檢測流速為1.0 mL·min-1，進樣量為20μL。

微囊藻毒素平均降解速率：以 0、6、12、20、28、38、48 d堆肥樣品MC（MC-LR和MC-RR）含量差值與時間的比值表示該時間段MC的平均降解速率。

實驗所用試劑均為優(yōu)級純，實驗用水為超純水。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析；使用SPSS軟件對堆肥過程中微囊藻毒素含量與其他理化指標的關(guān)系進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中的理化性質(zhì)

堆肥周期為48 d，以當日環(huán)境溫度作為對照（CK）。由圖1a可知，堆肥過程中3個處理的溫度變化總體趨勢為先升高再下降最后趨于穩(wěn)定，至48 d時堆肥已達腐熟。堆肥初期3個處理的溫度迅速上升，在4～5 d時堆體溫度達到45℃并持續(xù)了10～12 d，達到了消滅病菌的目的，W50%、W55%和W60%處理在堆制11～12 d后均達到堆肥過程中的最高溫度，分別為59.7、61.8、56.9℃。W55%處理中適宜的含水率以及添加較多的稻殼增加了堆體的孔隙率，有利于堆肥過程中氧氣的供給，提高了微生物的數(shù)量和活性，導致堆體的溫度高于其他兩組。

由圖1b可知，隨著堆肥進行，3個處理的有機碳含量呈明顯的下降趨勢，并且在堆肥升溫期和高溫期下降幅度最大，一方面是因為高溫條件有利于微生物種群的繁殖，提高了降解有機物質(zhì)的能力，另一方面，堆肥前期微生物優(yōu)先利用易降解、結(jié)構(gòu)簡單的有機物；堆肥中后期，微生物活性降低且難降解的有機物質(zhì)成為微生物利用的主體碳源，導致有機碳的下降趨勢變緩。堆肥結(jié)束后，W50%、W55%和W60%處理的有機碳含量分別為 262.12、263.98、271.69 g·kg-1，相對于初始含量，損失率分別為22.25%、21.97%和20.64%。

有機肥料國家標準（NY 525—2012）中規(guī)定了有機肥的技術(shù)指標，其中有機質(zhì)含量（以烘干基計）≥45%，總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）含量（以烘干基計）≥5%。由圖1b和圖1c可知，堆肥結(jié)束后，W50%、W55%和W60%處理的有機質(zhì)含量分別為45.19%、45.51%和46.84%，總養(yǎng)分含量分別為6.47%、6.04%和5.82%，均已達到有機肥料標準。

種子發(fā)芽率（GI）能簡單評價堆肥產(chǎn)品的植物毒性及腐熟程度，是衡量堆肥效果好壞的指標之一。由圖1d可知，堆肥初期，3個處理的種子發(fā)芽率均低于30%，表明未經(jīng)處理的堆肥產(chǎn)品具有植物毒性，抑制種子萌發(fā)。隨著堆肥的進行，GI上升，堆肥產(chǎn)品植物毒性逐漸降低，W55%處理最先達到80%，且增長速度高于W50%與W60%處理，堆肥結(jié)束后3個處理組的GI均大于85%，表示堆肥產(chǎn)品基本無植物毒性。

2.2 腐殖質(zhì)碳及組分含量的變化

由圖2a可知，隨著堆肥時間的延長，3個處理的HS含量均呈緩慢下降的趨勢。堆肥初期，HS含量在225～227 g·kg-1范圍內(nèi)；堆肥 48 d時，W50%、W55%和W60%處理的HS含量分別為174.09、176.50、183.28 g·kg-1，與初始含量相比分別下降了23.16%、21.71%和19.50%。

由圖2b可知，隨著堆肥時間的延長，3個處理的HA含量均呈先迅速升高再緩慢降低的趨勢。W50%、W55%和W60%處理的HA含量在堆制第12 d時均達到最大值，相比初始含量分別提高了100.22%、80.36%和 57.06%；在 13～48 d內(nèi) HA含量分別下降了15.40%、10.97% 和 8.38%，堆肥結(jié)束后，W50%、W55%、W60%處理的 HA 含量分別為 67.86、70.51、65.57 g·kg-1。

由圖2c可知，3個處理的FA含量隨堆肥進行呈下降的趨勢。堆肥結(jié)束時，W50%、W55%和W60%處理的FA含量與初始含量相比分別下降了50.30%、50.09%和40.36%。在堆肥初期，3個處理的FA含量下降趨勢基本相似，隨著堆肥的進行，W60%處理的FA含量下降趨勢變緩且高于W50%和W55%兩個處理。

HI值（HA/FA）是堆肥腐殖化的良好指標，描述最終堆肥的成熟度及HA和FA轉(zhuǎn)換的相對速度。由圖2d可知，3個處理的HI值隨著堆肥的進行呈上升趨勢。堆肥結(jié)束時，W50%、W55%和W60%處理的HI值分別為2.85、2.94和2.23，相對于堆肥初始值增幅分別為240.81%、221.78%和141.27%，其中W50%和W55%處理的HI值明顯高于W60%處理。

2.3 堆肥過程中藻毒素含量的變化

從圖3中的柱狀圖可以看出，隨著堆肥的進行，3個處理的微囊藻毒素含量均呈下降趨勢。堆制12 d后，MC-LR和MC-RR降解率均達到60%；堆肥38 d，W50%、W55%和W60%處理的MC-LR含量分別為9.60、6.13、7.23 μg·kg-1，降解率分別為 95.48%、96.78%、96.36%，MC-RR 含量分別為 11.56、9.38、9.53μg·kg-1，降解率分別為96.65%、97.26%、97.01%；堆肥48 d，3個處理的MC含量均低于1.0μg·kg-1（堆肥結(jié)束均未檢測出MC，儀器檢測下限為1 μg·kg-1）。

圖3中折線圖顯示了堆肥過程中MC-LR和MC-RR的平均降解速率，3個處理的微囊藻毒素平均降解速率趨勢相似，且MC-RR的平均降解速率高于MC-LR。堆制第6 d，3個處理的MC平均降解速率均達到最大值，W50%、W55%和W60%處理的MC-LR平均降解速率分別為 18.11、16.75、17.82 μg·kg-1·d-1，MCRR平均降解速率分別為22.06、28.07、23.53 μg·kg-1·d-1，隨后MC的降解速率逐漸下降。在整個堆肥過程中，MC在堆肥升溫階段和高溫階段降解速率最高，在不同處理組間，W55%處理MC的降解速率更高。

圖2 堆肥過程中3個處理組HS、HA、FA和HI含量變化Figure2 Changesin HS，HA，F(xiàn)A，HIfor threetreatmentsduringcomposting

圖3 堆肥過程中微囊藻毒素含量及降解速率的變化Figure 3 Changes of microcystin content and degradation rate of microcystin-LRand RRduring the composting of cyanobacteria

運用Pearson相關(guān)性分析方法探究MC-LR、MCRR含量與其他理化指標之間的關(guān)系，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各處理MC-LR含量與堆體總有機碳、腐殖質(zhì)和FA含量呈顯著正相關(guān)，而與HA含量和腐質(zhì)化系數(shù)呈顯著負相關(guān)；MC-RR含量與總養(yǎng)分和FA含量呈顯著正相關(guān)，而與腐質(zhì)化系數(shù)呈顯著負相關(guān)。各處理MC-LR和MC-RR含量都與FA含量顯著正相關(guān)，與腐質(zhì)化系數(shù)顯著負相關(guān)，主要因為微生物是堆肥過程中物質(zhì)分解的真正執(zhí)行者，堆肥過程中微生物的活動在促進堆肥腐殖化、穩(wěn)定化的同時，還對藻毒素的降解有促進作用，因此腐熟指標也可作為藍藻藻毒素是否達到使用安全性的指示指標。

3 討論

腐殖化程度和堆肥品質(zhì)是堆肥成功與否的重要標志和指標，腐殖物質(zhì)作為堆肥中有機質(zhì)的主要成分，其形成和變化能很好地反映堆肥的腐熟度和堆肥品質(zhì)。本研究結(jié)果表明，藍藻和墊料聯(lián)合堆肥后，不同處理組HS含量呈下降趨勢，這與李吉進等[18]和李國學等[10]的研究結(jié)果相似。在堆肥過程中，不同處理組HA和FA的含量也都發(fā)生了明顯變化，HA呈上升趨勢、FA呈下降趨勢，表明3個水分處理均有利于堆肥過程中FA的轉(zhuǎn)化和HA的增加；同時，本研究發(fā)現(xiàn)HA和FA在高溫期變化幅度最大，可能是高溫有利于FA轉(zhuǎn)化為HA，這與鮑艷宇等[19]研究結(jié)果一致。由于堆肥原料及堆肥工藝的不同，堆肥過程中腐殖質(zhì)及其組分含量變化有所不同[18-22]，但堆肥過程中HI值升高，表明堆肥腐殖化、穩(wěn)定化程度增強，這一點已基本達成共識。一般認為HI＞1.9堆肥已達到適當?shù)某墒於群头€(wěn)定性[23]，W50%、W55%和W60%處理堆肥結(jié)束時的HI值分別為2.85、2.94和2.23，表明3個水分處理有利于堆肥腐質(zhì)化進程和品質(zhì)提高，且W50%和W55%處理HA含量和HI值均高于W60%處理，表明W50%和W55%處理更有利于形成腐殖類物質(zhì)，提高堆體腐熟度。

目前微囊藻毒素在世界衛(wèi)生組織和《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB 5749—2006）中規(guī)定限值為1.0μg·L-1，成人每日允許攝取量為0.04 μg·kg-1[24]。本研究結(jié)果表明，堆肥38 d時，W50%、W55%和W60%處理的MCLR含量分別為9.60、6.13、7.23 μg·kg-1，MC-RR含量分別為11.56、9.38、9.53 μg·kg-1，仍有較大的可降解空間，這與江君等[6]的研究結(jié)果相似。堆肥48 d，3個處理的MC含量均低于1.0 μg·kg-1，相比于江君等[6]研究MC的降解更為徹底，這可能與堆肥原料和工藝參數(shù)有關(guān)。在堆肥進程中，3種含水量處理的MC平均降解速率變化趨勢相似，且MC在堆肥升溫階段和高溫階段迅速降解，堆制第6 d平均降解速率最大，同時發(fā)現(xiàn)MC-RR的降解速率高于MC-LR，這與Park[25]的研究結(jié)果相似。微生物降解微囊藻毒素主要通過改變其側(cè)鏈Adda的結(jié)構(gòu)或打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)降低或降解其毒性，MC-RR的肽狀結(jié)構(gòu)更容易被微生物所利用，導致MC-RR在堆肥過程中的降解速率更高[26-27]。

基于對藍藻堆肥腐熟進程和無害化考慮，在實際生產(chǎn)中，藍藻堆肥的時間應不少于48 d，堆體的水分含量可控制在55%左右。藍藻中含有大量的有機質(zhì)和植物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)（如氮、磷），環(huán)巢湖流域存在將藍藻作為肥料直接還田的現(xiàn)象，未經(jīng)腐熟處理的藍藻嚴重危害了作物生長和人類健康。本試驗堆制的藍藻有機肥各項指標均達到有機肥標準，且藻毒素含量低于1.0μg·kg-1，有機肥施用后MC在土壤-農(nóng)作物系統(tǒng)中會發(fā)生一系列的降解、轉(zhuǎn)化，藻毒素攝入量（以最大值1.0μg·kg-1，食物攝入量為1 kg計算）低于世界衛(wèi)生組織推薦MC的可耐受劑量值2.6μg·d-1（成人），目前藍藻有機肥已在試驗區(qū)得到推廣應用，施用面積達8 hm2，其環(huán)境效益和經(jīng)濟效益有待進一步研究。關(guān)于腐殖質(zhì)及其組分含量和微囊藻毒素含量在堆肥過程中的相關(guān)性機理尚未明確，另外如何延長堆肥高溫持續(xù)時間、縮短堆肥周期，并提高微囊藻毒素降解和促進腐質(zhì)化進程，是下一步研究亟需解決的問題。

4 結(jié)論

（1）在48 d的堆肥周期內(nèi)，各處理成品均已滿足有機肥標準，種子發(fā)芽率高于85%，表明堆肥已腐熟。

（2）堆制48 d，W50%、W55%和W60%處理的腐殖質(zhì)含量相對于初始值分別下降了23.16%、21.71%和19.50%；胡敏酸含量分別提高了69.40%、60.58%和43.89%；富里酸含量分別下降了50.30%、50.09%和40.36%；堆肥結(jié)束時，HI值分別為2.85、2.94和2.23，且W50%和W55%處理的腐殖化程度明顯高于W60%處理。表明3個水分處理均有利于有機物料腐殖化，W50%和W55%處理更有利于形成腐殖類物質(zhì)，提高堆體腐熟度。

（3）堆制48 d，各處理MC-LR和MC-RR含量均低于1μg·kg-1，降解率達95%；高溫促進了MC降解，且MC-RR的降解速率高于MC-LR；W55%處理藻毒素的降解效果最好。

（4）微囊藻毒素降解與腐殖質(zhì)及其組分含量變化顯著相關(guān)，腐殖質(zhì)及其組分含量可作為藍藻堆肥能否安全使用的指示指標。