3種豬冠狀病毒抗體可視化檢測芯片的研制與初步應(yīng)用

武鑫宇,李 姿,石俊超,胡詩雨,劉 蕾,劉曉東,趙 魁,高 豐,賀文琦? (.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春3006;.青島易邦生物工程有限公司 動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島6644)

在養(yǎng)豬業(yè),冠狀病毒感染對其發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅,其中豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)均能感染仔豬,引起嘔吐、腹瀉、脫水等癥狀,且死亡率較高[1-3]。因此在傳統(tǒng)類癥鑒別診斷中,人們常常將上述3種疫病混淆、誤診。為滿足基層臨床對疾病快速鑒別診斷的需求,方便、快捷、直觀的可視化芯片技術(shù)則優(yōu)勢凸顯,為豬冠狀病毒病檢測方法革新帶來了新的契機(jī)。

可視化芯片技術(shù)是在傳統(tǒng)生物芯片基礎(chǔ)上,結(jié)合可視化顯色技術(shù)而發(fā)展的一種技術(shù)類型,分為可視化蛋白芯片和基因芯片,兼具快速、可視、操作簡易、設(shè)備要求低、成本低等優(yōu)點(diǎn),近些年被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原、基因突變或分型檢測等[4-6]。本研究擬將蛋白芯片技術(shù)與DAB顯色方法相結(jié)合,制備3種豬冠狀病毒(PEDV、TGEV、PHEV)抗體可視化檢測芯片,以滿足基層臨床對冠狀病毒類疾病快速鑒別診斷的需求。該方法具有更加方便、快捷、直觀等優(yōu)勢,可在臨床、養(yǎng)殖場等設(shè)備條件不足的情況下,對PEDV、TGEV、PHEV 3 種豬冠狀病毒的免疫效果評價(jià)、鑒別診斷等起到積極的推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1 血清陽性、陰性血清,均來自于吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院分子病理實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要材料與儀器鎳離子親和層析柱購自碧云天生物技術(shù)有限公司,PVDF 膜購自于Merck Millipore,NC膜購自于北京索萊寶科技有限公司,醛基基片購自于上海領(lǐng)成生物科技有限公司,DAB顯色試劑盒購自于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,山羊抗豬IgG H&L(HRP)購自于Abcam。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與濃縮設(shè)計(jì)合成引物PHEV-N、TGEV-N、PEDV-N(表1)。提取動(dòng)物組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為c DNA,PCR 擴(kuò)增。將目的基因克隆至p ET-32a 載體,構(gòu)建p ET-32a-PHEV-N、p ET-32a-TGEV-N、p ET-32a-PEDV-N原核表達(dá)質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá),當(dāng)菌液D600 為0.8 時(shí),加入1×10－4mol/L IPTG,37℃誘導(dǎo)8 h。收集菌體,溶解于 含0.01 mol/L 咪唑的8.00 mol/L 尿素之中,超聲破碎,收集上清。鎳柱法進(jìn)行蛋白純化,利用含0.20 mol/L 咪唑的8.00 mol/L尿素洗脫,經(jīng)超濾管離心,得到2 000 mg/L的蛋白濃縮液。

表1 重組N 蛋白擴(kuò)增引物信息

1.4 蛋白芯片制備與反應(yīng)條件優(yōu)化分別用水、磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01 mol/L,p H7.2)、含1%BSA的PBS、8 mol/L 尿素將重組蛋白稀釋至30～2 000 mg/L。將特定稀釋度樣品分別點(diǎn)樣至PVDF膜、NC膜、醛基基片上,于37℃溫箱固定60 min。隨后,以5%脫脂乳作為封閉液,37℃封閉60 min后,PBST 緩沖液洗滌5 min。將待檢血清樣品進(jìn)行200～12 800倍稀釋,滴加至封閉樣孔,分別于37℃孵育30 min、37℃孵育60 min、25℃孵育2 h、4℃孵育8 h,PBST 洗滌3次。選擇山羊抗豬IgG H&L(HRP)二抗于37℃孵育1 h,PBST 洗滌3次。最后,選用DAB 顯色液進(jìn)行1～10 min顯色,滴加二蒸水終止反應(yīng),風(fēng)干,肉眼觀察檢測結(jié)果。同時(shí),白光拍照并進(jìn)一步通過ImageJ、SPSS軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。

1.5 蛋白芯片的敏感性與特異性檢測基于上述優(yōu)化體系,以不同濃度重組蛋白稀釋液進(jìn)行點(diǎn)樣,每組3個(gè)重復(fù),SPF豬血清IgG 為陽性質(zhì)量控制,點(diǎn)樣緩沖液為空白對照,制備3×5 蛋白芯片矩陣(圖1)。利用該芯片分別檢測PHEV、TGEV、PEDV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等陽性血清,將檢測結(jié)果與ELISA 檢測結(jié)果對比分析,初步明確該蛋白芯片的敏感性與特異性。

圖1 蛋白芯片矩陣

1.6 蛋白芯片重復(fù)性檢測于不同時(shí)間制備3組蛋白芯片,檢測已知血清,每組重復(fù)3次,分析組內(nèi)、組間變異系數(shù),確定本研究制備的蛋白芯片的重復(fù)性。

1.7 蛋白芯片穩(wěn)定性檢測將同一批次制備的蛋白芯片分別置于4℃保存4周、－20℃保存8周,根據(jù)顯色效果確定本研究制備的蛋白芯片的穩(wěn)定性。

1.8 臨床血清樣品的檢測使用制備的蛋白芯片對來自吉林省松原市、白城市、梅河口市的100份臨床血清樣品進(jìn)行檢測,確定PHEV、TGEV、PEDV 3種病毒抗體的陽性率。

2 結(jié)果

2.1 蛋白固定載體的選擇分別選用NC 膜、PVDF膜、醛基基片3種載體進(jìn)行蛋白固定,結(jié)果如圖2所示,3種重組蛋白均能夠固定于上述3種載體上,且均可與血清抗體進(jìn)行良好反應(yīng)。但考慮到點(diǎn)樣效果、顯色效果、肉眼觀察效果、設(shè)備下觀察效果差異,最終確定NC膜為最適蛋白固定載體。

2.2 抗原點(diǎn)樣緩沖液的選擇分別選取無菌水、0.01 mol/L PBS、含1% BSA PBS 作 為 點(diǎn) 樣 緩 沖液,以8 mol/L尿素作為陰性對照進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示,各組重組蛋白在3種點(diǎn)樣緩沖液中均可有明顯顯色反應(yīng),其中以0.01 mol/L PBS組效果最好。因此,本研究選擇0.01 mol/L PBS作為抗原點(diǎn)樣緩沖液。

2.3 抗原點(diǎn)樣濃度的選擇利用0.01 mol/L PBS作為抗原稀釋液,對濃縮純化的重組蛋白溶液進(jìn)行梯度稀釋,選取各濃度稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)。如圖4所示,3種蛋白分別在62.5,125.0,250.0 mg/L條件下有明顯顯色反應(yīng)。排除假陽性的干擾,250.0 mg/L為PHEV-N 和PEDV-N 最適抗原點(diǎn)樣質(zhì)量濃度,125.0 mg/L為TGEV-N 最適抗原點(diǎn)樣質(zhì)量濃度。

2.4 待檢血清樣本孵育條件的選擇分別將標(biāo)準(zhǔn)陽性血清滴加至標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)芯片,分別于37℃孵育30 min、37℃孵育60 min、25℃孵育2 h、4℃孵育8 h。如圖5所示,在4個(gè)孵育條件下顯色效果均明顯,綜合考慮實(shí)際情況,37℃孵育60 min、25℃孵育2 h、4℃孵育8 h均可。

圖3 抗原點(diǎn)樣緩沖液的選擇 A.孵育PHEV 陽性血清;B.孵育TGEV 陽性血清;C.孵育PEDV 陽性血清;D.孵育SPF豬血清;a.無菌水;b.0.01 mol/L PBS;c.含1%BSA PBS;d.8 mol/L尿素

圖4 抗原點(diǎn)樣濃度的選擇 A.孵育PHEV 陽性血清;B.孵育TGEV 陽性血清;C.孵育PEDV 陽性血清;D.孵育SPF豬血清;a.2 000.0 mg/L;b.1 000.0 mg/L;c.500.0 mg/L;d.250.0 mg/L;e.125.0 mg/L;f.62.5 mg/L;g.31.3 mg/L;h.空 白

2.5 顯色時(shí)間的選擇在上述研究的基礎(chǔ)上,利用DAB顯色液標(biāo)記待檢血清樣本,分別選擇1,3,5,10 min 作為顯色時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖6所示,3種重組蛋白在3～10 min顯色條件下效果均明顯。因此,確定3 min為DAB顯色液的最佳顯色時(shí)間。

圖5 待檢血清樣本孵育條件的選擇 A.孵育PHEV 陽性血清;B.孵育TGEV 陽性血清;C.孵育PEDV 陽性血清;D.孵育SPF豬血清;a.37℃孵育30 min;b.37℃孵育60 min;c.25℃孵育2 h;d.4℃孵育8 h

圖6 顯色時(shí)間的選擇 A.孵育PHEV 陽性血清;B.孵育TGEV 陽性血清;C.孵育PEDV 陽性血清;D.孵育SPF 豬血清;a.1 min;b.3 min;c.5 min;d.10 min

2.6 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定肉眼下,檢測組圓點(diǎn)顯色較深且質(zhì)地凝實(shí)即可視為陽性;拍照保存并進(jìn)行灰度值分析,參考石霖等[7]建立的方法,檢測組圓點(diǎn)灰度值減去SPF豬血清孵育對照組圓點(diǎn)灰度值,大于等于SPF豬血清孵育對照組圓點(diǎn)灰度值3倍標(biāo)準(zhǔn)差即可視為陽性。

2.7 蛋白質(zhì)芯片最低檢測限的確定將效價(jià)均為27的3種病毒陽性血清梯度稀釋,利用上述標(biāo)準(zhǔn)化可視化蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行檢測,以明確其最低檢測限。如圖7所示,3種蛋白分別于200～12 800倍稀釋的血清中與抗體孵育結(jié)合,其中PHEV-N 蛋白、TGEV-N 蛋 白、PEDV-N 蛋 白 在3 200至12 800倍稀釋下顯色效果均較好,所以12 800倍稀釋可分別作為最低檢測限,用于判別診斷。

2.8 蛋白芯片敏感性與特異性分析取93例來自吉林省四平市、通化市的臨床腹瀉病待檢血清進(jìn)行檢測,并與ELISA 檢測結(jié)果相比較。如圖8所示,兩者符合率為91%,證明芯片敏感性好。如圖9所示,PHEV、TGEV、PEDV 陽性血清檢測結(jié)果均呈陽性,SPF豬陰性血清、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等陽性血清檢測結(jié)果均呈陰性,PHEV、TGEV、PEDV陽性混合血清檢測結(jié)果清晰,無交叉反應(yīng),證明芯片特異性較好。

2.9 蛋白芯片重復(fù)性檢測本研究于不同時(shí)間制備3組芯片,設(shè)為組1～3,分別對上述93份血清進(jìn)行重復(fù)性檢測,每份血清重復(fù)3次。結(jié)果表明3組組內(nèi)變異系數(shù)分別為0.68%,0.68%,0,組間變異系數(shù)為0.39%,均小于5.00%,證明重復(fù)性好。

2.10 蛋白芯片穩(wěn)定性檢測本研究將于同一批次制備的蛋白芯片分別于4℃保存4周、－20℃保存8周。結(jié)果顯色效果均明顯,證明本研究制備的蛋白質(zhì)芯片在－20℃條件下,8周內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖7 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清最低檢測限的確定 A.孵育PHEV 陽性血清;B.孵育TGEV 陽性血清;C.孵育PEDV 陽性血清;D.孵育SPF豬血清;a.200倍稀釋;b.400倍稀釋;c.800倍稀釋;d.1 600倍稀釋;e.3 200倍稀釋;f.6 400倍稀釋;g.12 800倍稀釋;h.空白

圖8 蛋白質(zhì)芯片與ELISA 符合率比較圖

2.11 臨床血清樣品的檢測取100例來自吉林省松原市、白城市、梅河口市的臨床患病待檢血清進(jìn)行檢測,效果良好,PHEV、TGEV、PEDV 陽性率分別為32%,14%,81%。

3 討論

目前,國內(nèi)外針對PEDV、TGEV、PHEV 等病原已建立多種診斷方法,其中PCR、ELISA、免疫熒光等方法都需要專業(yè)設(shè)備,成本高昂,且僅限于實(shí)驗(yàn)室使用,而膠體金檢測技術(shù)則通常只能識別1種抗體,在臨床疾病鑒別診斷的復(fù)雜環(huán)境中同樣不便。本研究建立了一種同時(shí)檢測PEDV、TGEV、PHEV血清抗體的可視化蛋白芯片檢測方法,能夠快速、準(zhǔn)確、直觀的對3種病毒抗體進(jìn)行初步監(jiān)測。該檢測方法的建立,在基層臨床、養(yǎng)殖場等設(shè)備條件不足的情況下,對于該類疫病的及早診斷、防治能起到積極促進(jìn)作用。目前,可視化芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用到動(dòng)植物病毒檢測、食品中抗生素殘留檢測、基因分型、酶功能鑒定等方面[8-11]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷推廣和充分應(yīng)用,可視化芯片檢測技術(shù)必將在現(xiàn)代化生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展過程中逐步發(fā)揮重要作用。

圖9 蛋白質(zhì)芯片特異性檢測 A.孵育PHEV 陽性血清;B.孵育TGEV 陽性血清;C.孵育PEDV 陽性血清;D.孵育SPF豬血清;E.孵育CSFV 陽性血清;F.孵育PRRSV 陽性血清;G.孵育PRV 陽性血清;H.孵育PCV2陽性血清;I.孵育PHEV 和TGEV 陽性血清;J.孵育PHEV 和PEDV 陽性血清;K.孵育TGEV 和PEDV 陽性血清;L.孵育PHEV、TEGV 和PEDV陽性血清

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在獸醫(yī)診斷學(xué)上的應(yīng)用在近些年來已取得了巨大進(jìn)步[12-14]。本研究選取3種病毒的N 蛋白進(jìn)行表達(dá)純化,優(yōu)化點(diǎn)樣濃度、作用載體、顯色方法等關(guān)鍵反應(yīng)環(huán)境條件,最終實(shí)現(xiàn)對豬冠狀病毒感染血清中病毒抗體進(jìn)行檢測。本研究建立的可視化蛋白質(zhì)芯片的敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,雖然與ELISA 的符合率并不能達(dá)到100%,但作為臨床初步診斷的一種快速檢測方法,是具有重要潛在應(yīng)用價(jià)值。此外,作為傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分子檢測技術(shù)的替代方法,可視化蛋白質(zhì)芯片兼具平價(jià)、易操作、高通量、易推廣、易保存等優(yōu)點(diǎn),能夠深入基層臨床,為其他動(dòng)物病毒性疾病檢測方法的革新提供重要參考,有利于適應(yīng)當(dāng)今動(dòng)物疫病檢測的市場需求。

在未來研究工作中,可以針對更多的豬常見病毒病進(jìn)行綜合鑒別診斷,甚至于對更多新老再發(fā)疫病進(jìn)行整體監(jiān)控。上述基礎(chǔ)研究工作的順利開展,將對生豬養(yǎng)殖業(yè)規(guī)范化、規(guī)模化、自動(dòng)化起到積極推動(dòng)作用,有望為人類的食品安全環(huán)境帶來重要提升。