一株扁刺蛾病毒TsNPV的分離鑒定

王金昌，靳 亮，劉卓榮，占智高，況文東，關(guān)麗梅

(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096，南昌)

0 引言

扁刺蛾(Thosea sinensis Walker)屬于鱗翅目中的刺蛾科，又名黑點(diǎn)刺蛾、洋辣子。扁刺蛾分布廣(東南亞一些國家和我國23個(gè)省份均有分布)、食性雜(寄主達(dá)37科71種)[1－2]，主要寄主有油茶、茶樹、核桃、柿、棗、蘋果、梨、烏桕、楓香、楓楊、楊、大葉黃楊、柳、桂花、苦楝、香樟、泡桐、油桐、梧桐、喜樹、銀杏、桑、櫟、板栗等林木和果樹。

扁刺蛾在南昌1年發(fā)生2～3代[3]，幼蟲齡期為:1齡2 d，2齡3－4 d，3齡5－6 d，4齡7－8 d，5齡6－9 d，6齡5－10 d，幼蟲歷期約28－40 d左右[4]，為害時(shí)間從5－10月長達(dá)半年。扁刺蛾在南昌的寄主達(dá)30科43種植物[4]，是江西省的主要食葉害蟲之一，低齡幼蟲可將葉片吃成網(wǎng)狀，殘留葉脈，4齡后則食成缺刻和孔洞，僅留葉柄和主脈。6齡后食量大增，將全葉食盡，造成果實(shí)減產(chǎn)[5]。一般情況下葉片損失10%～15%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%以上[6];扁刺蛾聚集產(chǎn)卵及幼蟲間的相互吸引導(dǎo)致扁刺蛾幼蟲在某一棵寄主上高密度聚集，食光整棵樹的葉片，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致樹木死亡[7]。

扁刺蛾幼蟲除危害樹木外，幼蟲觸及人的皮膚可引起皮炎，受刺部位有劇烈灼痛感，重者劇痛難忍，少數(shù)可伴有頭痛、頭昏、惡心、嘔吐、心悸、周身不適及局部淋巴結(jié)腫痛等癥狀[6，8－9]，刺蛾變應(yīng)原似可引起變應(yīng)性哮喘[10]。因此防治扁刺蛾，既有生產(chǎn)上的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，又具有保障人類身心健康的重要意義[11]。

蔡秀玉等于1964年7月在北京首次發(fā)現(xiàn)扁刺蛾核型多角體病毒(Thosea sinensis Nuclear Polyhedrosis Virus，TsNPV)，其后相繼在江西、河北、安徽、湖南、山東也發(fā)現(xiàn)TsNPV。該病毒能夠通過水平擴(kuò)散和垂直傳遞在扁刺蛾種群內(nèi)傳播，自然感染率一般為43%，高時(shí)可達(dá)70%～87.2%以上，甚至達(dá)100%，是控制扁刺蛾種群數(shù)量的重要生物因子[12－14]。

近年來，扁刺蛾在南昌各小區(qū)、道路、果園和茶園泛濫成災(zāi)，防治扁刺蛾可采用人工抓捕扁刺蛾幼蟲，清除蟲繭，用燈誘殺成蟲等輔助手段，目前主要是用化學(xué)農(nóng)藥防治[15]。但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅造成林區(qū)的農(nóng)藥殘留超標(biāo)，而且在殺滅害蟲的同時(shí)也傷害了害蟲的天敵(螳螂、獵蝽、剌蛾廣肩小蜂、刺蛾紫姬蜂、寄蠅、絨繭蜂、赤眼蜂等[6])，破壞了生態(tài)平衡，同時(shí)還容易引起害蟲的抗藥性，不利于有害生物的可持續(xù)控制。最好的辦法是采用生物防治，其中噴施TsNPV病毒制劑是最有效的手段。

在江西省南昌市艾溪湖濕地公園里發(fā)現(xiàn)扁刺蛾幼蟲自然死亡的蟲尸，通過研磨蟲尸、離心純化，再次感染扁刺蛾，得到了更多病毒樣死亡癥狀的蟲尸。經(jīng)過再次樣品純化，電鏡切片觀察，初步判定該病原物是一種多角體病毒，同時(shí)進(jìn)行了生測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料 供試扁刺蛾幼蟲:江西省南昌市艾溪湖濕地公園里大葉黃楊生長的扁刺蛾幼蟲。養(yǎng)蟲器皿:禧天龍迷你收納盒。人工飼料:大葉黃楊帶葉片的枝條(飼喂前用無菌水洗滌3次，晾干，用紫外線照15 min)。病毒來源:江西省南昌市艾溪湖濕地公園里大葉黃楊扁刺蛾幼蟲自然死亡的蟲尸。

1.1.2 試驗(yàn)藥劑及器材 病毒制劑:自已分離的TsNPV。

1.2 TsNPV病毒實(shí)驗(yàn)

1.2.1 TsNPV病毒室內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn) 把TsNPV病毒原液用無菌水稀釋至1×106PIB/mL，用塑料噴壺噴灑到大葉黃楊帶葉片的枝條上，陰干后放入禧天龍迷你收納盒內(nèi)，接入采集的4－6齡扁刺蛾幼蟲。28℃，光照周9:15飼養(yǎng)至扁刺蛾幼蟲全部死亡。其間每天注意觀察，飼毒48 h后換上新鮮的大葉黃楊帶葉片的枝條，及時(shí)取出病死扁刺蛾幼蟲置4℃冰箱保存。

1.2.2 TsNPV病毒的提取 取扁刺蛾幼蟲死亡的蟲尸，用已滅菌的0.02 mol/L pH7.2 PBS浸泡10 min，激烈振蕩或渦旋1 min，用3層沙布過濾，濾液進(jìn)行差速離心數(shù)次(先800 r/min離心5 min，取上清;再以4 000 r/min離心5 min棄去上清，無菌水懸浮)，直至獲得較純凈的多角體為止。在光學(xué)顯微鏡下，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并拍照，病毒液置4℃冰箱保存。

1.2.3 TsNPV病毒超薄切片樣品制備與電鏡鑒定 將純化的病毒多角體迅速用電鏡專用戊二醛前固定，用0.1 mol/L PBS漂洗后，用1%四氧化鋨后固定，用0.1 mol/L PBS漂洗;用30%～100%丙酮梯度脫水;用環(huán)氧樹脂包埋、聚合;半薄切片定位，超薄切片機(jī)切片。醋酸鈾和梓檬鉛溶液雙染色染色后將制好的切片銅網(wǎng)置于200 KV冷凍透射電子顯微鏡FEI Tecnai G20下，加速電壓為200 V，拍攝電鏡照片。

1.2.4 TsNPV病毒的室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn) 將TsNPV病毒用無菌水進(jìn)行梯度稀釋成1×107PIB/mL，1×106PIB/mL，1×105PIB/mL，1×104PIB/mL，1×103PIB/mL，1×102PIB/mL，1×101PIB/mL的6個(gè)濃度。用每個(gè)濃度TsNPV病毒液分別浸泡大葉黃楊帶葉片的枝條，晾干，進(jìn)行喂飼實(shí)驗(yàn)。每個(gè)濃度做為一組，每組放入一定數(shù)量的扁刺蛾幼蟲，分別放在已消毒的容器內(nèi)用濕紗布扎緊封口，涂無菌水作對(duì)照，重復(fù)2次。感染24 h后加入新鮮清潔葉片繼續(xù)飼養(yǎng)。按試驗(yàn)要求進(jìn)行觀察記載。計(jì)算死亡率，計(jì)算個(gè)不同病毒濃度的致死中時(shí)間，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV擴(kuò)增結(jié)果

扁刺蛾幼蟲感染病毒后食欲減退，行動(dòng)遲緩，顯病幼蟲先期體色變黃，最后呈黃褐、灰褐或黑褐色，幼蟲死亡后，軀體變軟，體內(nèi)組織液化，表皮松弛易破，流出乳白色至褐色膿汁，無臭味，呈典型“液化型”病癥，見圖1。取液化的扁刺蛾幼蟲血細(xì)胞和脂肪組織壓片，可以觀察到在細(xì)胞核內(nèi)增殖的核型多角體病毒，扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV擴(kuò)增成功。

扁刺蛾幼蟲感染TsNPV病毒8 d后全部死亡，收集蟲尸用PBS浸泡，激烈振蕩后差速離心提取TsNPV，用光學(xué)顯微鏡鏡檢可見折光性很強(qiáng)的病毒多角體，TsNPV鏡檢結(jié)果見圖2。

圖1 幼蟲感染病毒死亡后，呈典型“液化型”病癥圖

圖2 TsNPV多角體鏡檢圖(折光性很強(qiáng)的為病毒多角體)

2.2 扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV電鏡鑒定

經(jīng)中科院武漢病毒研究所電鏡室進(jìn)行超薄切片電鏡鑒定，此多角體病毒為不規(guī)則多面體，呈五邊形至近圓形。病毒粒子桿伏，單粒包埋于蛋白質(zhì)中，見圖3。從感病幼蟲的病癥，多角體和病毒粒子的形態(tài)與大小，按國際病毒分類委員會(huì)第4次報(bào)告，該病毒屬桿狀病毒科，經(jīng)鑒定為核型多角體病毒[16－18]。

圖3 TsNPV切片的200 kV冷凍透射電子顯微鏡圖

2.3 TsNPV病毒生測(cè)結(jié)果

TsNPV病毒生測(cè)結(jié)果如表1所示，從表1中可見1×107PIB/mL、1×106PIB/mL、1×105PIB/mL、1×104PIB/mL、1×103PIB/mL感染扁刺蛾幼蟲后2 d內(nèi)扁刺蛾幼蟲出現(xiàn)了死亡，扁刺蛾幼蟲死亡率隨著感染劑量增加而相應(yīng)提高，1×107PIB/mL、1×106PIB/mL、1×105PIB/mL 3個(gè)濃度感染扁刺蛾幼蟲后8－9 d內(nèi)，扁刺蛾幼蟲死亡率都達(dá)到了100%。1×107PIB/mL、1×106PIB/mL、1×105PIB/mL 3個(gè)濃度的的半至死時(shí)間都為4 d左右，1×104PIB/mL、1×103PIB/mL、1×102PIB/mL、1×101PIB/mL的4個(gè)濃度的半至死時(shí)間分別為6 d、7 d、8 d和8 d;用Spss軟件進(jìn)行方差分析，主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果見表2，從病毒濃度、死亡時(shí)間和病毒濃度*死亡時(shí)間的sig值是0.0000小于0.01，說明不同濃度TsNPV在不同時(shí)間對(duì)扁刺蛾幼蟲的致死作用效果差異顯著。

表1 TsNPV對(duì)扁刺蛾幼蟲感染致死的平均校正死亡率

表2 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)

3 結(jié)論

成功分離、鑒定和擴(kuò)增了扁刺蛾核型多角體病毒TsNPV，這不僅為以病毒治蟲提供了病毒毒源，對(duì)我國昆蟲病毒學(xué)的發(fā)展具有一定學(xué)術(shù)意義。扁刺蛾TsNPV能有效殺滅扁刺蛾，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，而且能夠在扁刺蛾種群內(nèi)進(jìn)行水平擴(kuò)散和垂直感染，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。