復(fù)合菌固體發(fā)酵構(gòu)樹生產(chǎn)蛋白飼料的試驗研究

■張秀江 王品勝 丁 松 高正龍 向凌云 方玉美 胡 虹* 呂文竹

(1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450008；2.河南省高新技術(shù)實業(yè)有限公司，河南鄭州450008；3.信陽市畜牧工作站，河南信陽464000）

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）屬桑科構(gòu)屬多年生落葉喬木或亞喬木，在我國大部分地區(qū)廣泛分布，自然條件下常見于溝谷、村旁、緩坡和丘陵以及山澗石縫中生長[1]。構(gòu)樹作為我國的鄉(xiāng)土樹種，因其營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高、速生性強等特點，作為蛋白飼料倍受到關(guān)注[2]。構(gòu)樹飼料蛋白質(zhì)含量高，是一種潛在的的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)飼料原料，但因其復(fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在單胃動物胃腸道內(nèi)不易降解，很難被消化吸收,不能充分利用。構(gòu)樹飼料較高的粗纖維含量對單胃動物營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收也有一定的影響[3]。另外，構(gòu)樹葉中還含有抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧和木質(zhì)素。單寧主要是與飼料中的其他營養(yǎng)成分結(jié)合，影響動物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，造成營養(yǎng)成分利用不充分，降低飼料的營養(yǎng)價值，單寧含量過高，還影響飼料的適口性，導(dǎo)致動物采食量下降。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以被畜禽消化利用，是直接導(dǎo)致構(gòu)樹飼料消化利用率低的主要原因。如何提高構(gòu)樹飼料中粗蛋白的含量，特別是容易被動物消化吸收的酸溶蛋白含量，降低粗纖維、木質(zhì)素和單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，開發(fā)出優(yōu)質(zhì)高效的構(gòu)樹蛋白飼料，增加構(gòu)樹飼料在動物基礎(chǔ)日糧中的添加比例和使用效果是目前急需解決的技術(shù)問題。本試驗利用復(fù)合益生菌固體發(fā)酵構(gòu)樹飼料，通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵技術(shù)參數(shù)，明確發(fā)酵條件對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響，旨在探討優(yōu)質(zhì)高效的構(gòu)樹蛋白飼料開發(fā)路徑，為構(gòu)樹飼料更加廣泛的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

試驗用菌種為復(fù)合益生菌固體粉劑，含枯草芽孢桿菌≥2.5×108個/g，嗜酸乳桿菌≥2.0×108個/g，釀酒酵母菌≥1.0×108個/g。

1.1.2 原料

構(gòu)樹飼料采用構(gòu)樹全葉試驗，采于7 月中旬信陽羅山縣莽張鎮(zhèn)。葉片選擇1～1.5 m 高當(dāng)年生的構(gòu)樹，高、中、低部位隨機摘取，自然條件下曬至含水量10%以下，粉碎過30 目分析篩，裝袋備用。玉米粉、麩皮、稻糠為市售產(chǎn)品,糖蜜主要成分為蔗糖，紅褐色黏稠液體，干物質(zhì)含量為48.98%，水溶性糖含量為64.8%。

1.1.3 培養(yǎng)基

試驗發(fā)酵培養(yǎng)基（1 kg）：構(gòu)樹粉700 g、玉米粉100 g、麩皮50 g、稻糠50 g、糖蜜100 g。

1.1.4 儀器

樣品粉碎機（ⅩI-A），江蘇金壇迅生儀器廠；凱氏定氮儀（KDN-04D），北京新諾立華儀器有限公司；電阻爐（SX2-12），武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；離心機（Multifuge X1R），德國Thermo 公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DRP-9052型），上海森信；全波長掃描式多功能讀數(shù)儀（Varioskan Flash），美國THERMO；電子天平（ME204E），上海梅特勒-托利多；立式壓力蒸汽滅菌鍋（SX-500），日本TOMY。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法

試驗發(fā)酵培養(yǎng)基無需滅菌，用1 000 ml三角瓶裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵培養(yǎng)，以粗蛋白質(zhì)的含量為考察指標(biāo)，對菌種接種量、培養(yǎng)基裝料量、培養(yǎng)基初始含水量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行優(yōu)化。按正交試驗優(yōu)化的條件發(fā)酵構(gòu)樹飼料，比較發(fā)酵前后構(gòu)樹飼料營養(yǎng)成分含量的變化。

1.2.2 試驗設(shè)計

1.2.2.1 菌種接種量的優(yōu)化

將試驗發(fā)酵培養(yǎng)基裝入1 000 ml的三角瓶中，其他發(fā)酵條件一致，分別接入2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的菌種進行固體發(fā)酵，48 h 后通過測定發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量來確定最佳的菌種接種量。

1.2.2.2 培養(yǎng)基裝料量的優(yōu)化

在1 000 ml 的三角瓶中分別裝入試驗發(fā)酵培養(yǎng)基100、200、300、400、500、600、700、800、900 g，其他發(fā)酵條件一致，進行固體發(fā)酵，48 h 后通過測定發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量來確定最佳的培養(yǎng)基裝料量。

1.2.2.3 培養(yǎng)基初始含水量的優(yōu)化

將試驗發(fā)酵培養(yǎng)基裝入1 000 ml的三角瓶中，其他發(fā)酵條件一致，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始含水量為48%、51%、54%、57%、60%、63%、66%、69%、72%，發(fā)酵48 h 后通過測定發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量來確定最佳的培養(yǎng)基初始含水量。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

將試驗發(fā)酵培養(yǎng)基裝入1 000 ml的三角瓶中，其他發(fā)酵條件一致，分別在溫度為24、26、28、30、32、34、36、38、40 ℃進行固體發(fā)酵，48 h后通過測定發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量來確定最佳的發(fā)酵溫度。

1.2.2.5 發(fā)酵時間的優(yōu)化

將試驗發(fā)酵培養(yǎng)基裝入1 000 ml的三角瓶中，其他發(fā)酵條件一致，在發(fā)酵過程中在12、18、24、30、36、42、48、54、60 h分別測定發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量來確定最佳的發(fā)酵時間。

1.2.2.6 正交試驗

以單因素發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計4因素3 水平的正交試驗，確定構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料最佳的工藝參數(shù)。

1.2.2.7 構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的效果

將試驗發(fā)酵培養(yǎng)基裝入1 000 ml的三角瓶中，按正交試驗確定的構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料最佳工藝參數(shù)發(fā)酵構(gòu)樹飼料，測定發(fā)酵前后構(gòu)樹飼料粗蛋白、酸溶蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素和單寧的含量，比較發(fā)酵前后構(gòu)樹飼料成分含量的變化。

“栽植黃芪溝深要達到10—15厘米，溝距是30厘米，苗一定要朝著一個方向平栽在溝內(nèi)。”4月19日，一八三團住阿克恰普帕村訪惠聚工作隊將北屯市農(nóng)科所專業(yè)技術(shù)人員請到村里的黃芪種植示范田，現(xiàn)場為種植戶進行科技培訓(xùn)，村民孫學(xué)海邊學(xué)邊做，不懂就問，很快掌握了黃芪栽植技術(shù)。“工作隊為我們村民送致富門路，送科技知識，讓我們致富的信心更足了?！睂O學(xué)海說。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 構(gòu)樹飼料成分的測定

飼料中的粗蛋白、粗脂肪和單寧的含量分別按GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 27985—2011的方法進行。中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）參照Van Soest 等[4]方法進行測定。

1.2.3.2 酸溶蛋白質(zhì)含量的測定

在酸性條件下高分子蛋白質(zhì)易被沉淀，可被水解的較低分子量的蛋白質(zhì)即為酸溶蛋白質(zhì)。酸溶蛋白質(zhì)主要包括肽和游離氨基酸。測定方法：利用三氯醋酸作蛋白質(zhì)沉淀劑，將樣品中的蛋白質(zhì)和肽鏈較長的肽沉淀，并將其中短鏈的肽和游離氨基酸用酸溶解出來，經(jīng)離心、過濾、消化、蒸餾，測定其蛋白質(zhì)含量[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用dps 統(tǒng)計軟件進行單因素的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 菌種接種量對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

按不同接種量分別接入試驗發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白含量的結(jié)果如圖1?？莶菅挎邨U菌為好氧菌，釀酒酵母為兼性厭氧菌，嗜酸乳桿菌為厭氧菌。發(fā)酵前期枯草芽孢桿菌和釀酒酵母利用培養(yǎng)基中的氧氣快速生長，當(dāng)氧氣耗盡嗜酸乳桿菌開始生長，產(chǎn)生大量的乳酸使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 值下降，限制枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的生長繁殖。隨著菌種接種量的加大，發(fā)酵反應(yīng)起步更快，單位時間內(nèi)發(fā)酵反應(yīng)進行更充分，發(fā)酵培養(yǎng)物粗蛋白含量不斷增高。但菌種接種量達到一定比例后，由于大量微生物的快速生長繁殖，過度消耗構(gòu)樹發(fā)酵飼料中的營養(yǎng)成分，導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)物粗蛋白含量降低。由圖1 可以看出，接種量為8%時，構(gòu)樹發(fā)酵飼料粗蛋白含量最高。因此確定正交試驗的接種量為7%、8%、9%。

圖1 菌種接種量對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

2.2 裝料量對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

圖2 裝料量對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

2.3 培養(yǎng)基初始含水量對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響（見圖3）

圖3 培養(yǎng)基初始含水量對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

構(gòu)樹試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量，直接影響發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量。含水量過低，降低了發(fā)酵培養(yǎng)基的膨脹度，抑制菌體生長。含水量過高，培養(yǎng)基的透氣性變差，抑制枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的生長，影響發(fā)酵效果。圖3 表明，構(gòu)樹發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量為57%時，發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白含量最高。因此確定正交試驗的培養(yǎng)基初始含水量為54%、57%、60%。

2.4 發(fā)酵溫度對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響（見圖4）

從圖4 可見，隨著發(fā)酵溫度的提升，構(gòu)樹發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白的含量逐漸提高，但當(dāng)溫度超過34 ℃以后，構(gòu)樹發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白含量有逐漸降低的趨勢。因此可以確定34 ℃是構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的最適溫度。正交試驗發(fā)酵培養(yǎng)溫度設(shè)為32、34、36 ℃。

圖4 溫度對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響

2.5 發(fā)酵時間對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響（見圖5）

由圖5 可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵培養(yǎng)基中粗蛋白的含量在開始的12 h內(nèi)提高速度緩慢，12～36 h 迅速提高，36～48 h 提高速度趨于平緩，發(fā)酵到48 h，發(fā)酵培養(yǎng)基中粗蛋白的含量最高達23.9%。隨著時間的繼續(xù)延長，發(fā)酵培養(yǎng)基中粗蛋白的含量逐漸下降，為了縮短發(fā)酵周期，減少被雜菌感染的機會，降低發(fā)酵成本，發(fā)酵最佳時間為48 h。

圖5 發(fā)酵時間對構(gòu)樹發(fā)酵蛋白飼料的影響

2.6 正交試驗優(yōu)化復(fù)合菌發(fā)酵構(gòu)樹生產(chǎn)蛋白飼料的工藝參數(shù)

本試驗設(shè)計L9(34)正交試驗，以構(gòu)樹發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白為考察指標(biāo)，確定接種量、培養(yǎng)基裝料量、培養(yǎng)基初始含水量和發(fā)酵溫度對構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響，因素和水平、正交試驗結(jié)果見表1～表2。

表1 正交試驗的因素和水平

表2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，從R值來看，以粗蛋白為考察指標(biāo)，構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響程度順序為A＞C＞D＞B，即接種量＞培養(yǎng)基初始含水量＞溫度＞培養(yǎng)基裝料量，其中接種量影響顯著。最優(yōu)組合為A3C2D2B2，即最優(yōu)發(fā)酵條件參數(shù)：接種量9%、培養(yǎng)基初始含水量57%、溫度34 ℃、培養(yǎng)基裝料量400 g。

2.7 構(gòu)樹發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的效果

構(gòu)樹發(fā)酵試驗培養(yǎng)基按正交試驗優(yōu)化的發(fā)酵條件進行培養(yǎng)，測定發(fā)酵前后構(gòu)樹飼料成分含量的變化，結(jié)果見表3。表3 表明構(gòu)樹飼料發(fā)酵前后粗蛋白和酸溶蛋白的含量分別提高35.23%和70.88%，差異顯著(P＜0.05)，酸溶蛋白占粗蛋白的比由40.27%提高到50.89%；粗脂肪含量變化不明顯(P＞0.05)；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素、單寧的含量分別降低25.00%、34.59%、18.53%、85.95%，差異顯著(P＜0.05)。

表3 構(gòu)樹發(fā)酵蛋白飼料的效果

3 討論

試驗結(jié)果表明，本試驗選用的含3種益生菌的復(fù)合菌劑發(fā)酵構(gòu)樹飼料，在發(fā)酵過程中3種益生菌彼此之間有一定的協(xié)同作用，作用與功能互補。發(fā)酵前期枯草芽孢桿菌和釀酒酵母生長繁殖，消耗氧氣，隨著構(gòu)樹發(fā)酵培養(yǎng)基中氧氣的減少，嗜酸乳桿菌開始生長繁殖，產(chǎn)生乳酸及一些抑制雜菌感染的物質(zhì)，發(fā)酵培養(yǎng)物的pH 值逐漸降低，且有效地控制其他雜菌的感染。發(fā)酵過程中還會不斷產(chǎn)生積累一些醇、醛等芳香類物質(zhì)和多種生物酶類及未知生長因子，這些生物發(fā)酵產(chǎn)物可以顯著提高構(gòu)樹發(fā)酵飼料的適口性，增加構(gòu)樹飼料的消化吸收率，這與國內(nèi)多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致[6-8]。

構(gòu)樹飼料蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，畜禽消化吸收困難，豐富的蛋白質(zhì)資源沒有被充分的開發(fā)利用，造成嚴(yán)重的資源浪費。用發(fā)酵技術(shù)處理構(gòu)樹飼料不僅能降解構(gòu)樹飼料大分子復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，還能使粗蛋白和游離氨基酸的含量增加，提高動物對構(gòu)樹飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和構(gòu)樹飼料蛋白質(zhì)的利用價值[9]。何國英[10]研究表明，通過酶工程技術(shù)和生物工程技術(shù)對構(gòu)樹飼料進行微生物發(fā)酵處理，能夠?qū)?gòu)樹飼料中結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)降解，提高粗蛋白和游離氨基酸的含量。楊青春等[11]用米酒曲發(fā)酵構(gòu)樹葉片后，生長豬對構(gòu)樹葉飼料粗蛋白、粗纖維、干物質(zhì)、無氮浸出物、磷以及總能的表觀消化率均有不同程度的提高。李海新[12]利用生物工程技術(shù)、酶工程技術(shù)對構(gòu)樹葉進行發(fā)酵處理，使構(gòu)樹蛋白質(zhì)消化的吸收率達80%以上。熊羅英等[13]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵構(gòu)樹葉,與未發(fā)酵相比，肉仔雞對發(fā)酵構(gòu)樹葉的粗蛋白和粗纖維的消化率顯著提高。熊羅英等[14]報道，采用外源酶發(fā)酵構(gòu)樹飼料具有提高游離氨基酸含量，降解粗纖維的效果，可以提高三黃雞對構(gòu)樹粗蛋白、粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì)的消化。李海新[12]用米酒曲發(fā)酵構(gòu)樹葉粗蛋白含量增加5.29%。本試驗發(fā)酵后構(gòu)樹飼料中的粗蛋白含量提高了35.23%，與前述學(xué)者研究的結(jié)果一致。飼料中酸溶蛋白主要包括肽和游離氨基酸，最容易被畜禽消化吸收利用，酸溶蛋白含量的高低可作為評價飼料中粗蛋白質(zhì)量好壞的主要指標(biāo)，酸溶蛋白在構(gòu)樹飼料發(fā)酵蛋白方面的研究少見文獻報道。本試驗構(gòu)樹飼料經(jīng)發(fā)酵酸溶蛋白的含量提高了70.88%，表明復(fù)合菌發(fā)酵構(gòu)樹飼料不僅提高了粗蛋白的含量，還能夠大幅度的提高畜禽對構(gòu)樹飼料蛋白的消化吸收率。

構(gòu)樹飼料中單寧、粗纖維等抗?fàn)I養(yǎng)因子影響構(gòu)樹飼料的適口性和畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用。構(gòu)樹的適口性差在于構(gòu)樹本身的粗纖維和單寧含量高[15]。發(fā)酵和青貯技術(shù)對木質(zhì)素和植物纖維具有軟化作用，對提高飼料的適口性有很大的幫助[11]。熊羅英等[16]通過發(fā)酵處理，構(gòu)樹葉的單寧含量顯著下降，從發(fā)酵前的1.69%降到發(fā)酵后的0.061%，下降了96.39%。本試驗發(fā)酵后構(gòu)樹飼料單寧含量降低了85.95%，與前述學(xué)者研究的研究結(jié)果一致。構(gòu)樹葉粗纖維含量高，粗纖維主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，單胃動物難以消化纖維素、半纖維素，木質(zhì)素對全部畜禽均不能消化利用，通過微生物發(fā)酵可以降解粗纖維，降低其含量，提高飼料消化利用率。本試驗對構(gòu)樹飼料中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素的含量進行試驗研究，更能準(zhǔn)確反映構(gòu)樹飼料中纖維素、半纖維素，木質(zhì)素的含量。張益民等[17]用啤酒酵母和米曲霉發(fā)酵構(gòu)樹葉，粗纖維含量降低15.3%。李海新[12]發(fā)酵處理構(gòu)樹葉粗纖維降低21.76%。熊羅英[18]采用篩選的菌株發(fā)酵構(gòu)樹葉，粗纖維含量降低11.68%～14.96%。本試驗構(gòu)樹飼料發(fā)酵后中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素的含量分別降低25.00%、34.59%、18.53%，與前述學(xué)者研究一致。

4 結(jié)論

采用含枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌和釀酒酵母的復(fù)合菌固體發(fā)酵構(gòu)樹飼料，以粗蛋白含量為考察指標(biāo)，通過L9(34)正交試驗確定構(gòu)樹飼料發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為接種量9%、培養(yǎng)基初始含水量57%、溫度34 ℃、培養(yǎng)基裝料量400 g、發(fā)酵時間48 h。構(gòu)樹飼料經(jīng)發(fā)酵粗蛋白和酸溶蛋白的含量分別提高35.23%和70.88%，酸溶蛋白占粗蛋白的比由40.27%提高到50.89%；粗脂肪含量變化不明顯；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素、單寧的含量分別降低25.00%、34.59%、18.53%、85.95%。