大花鐵線蓮單重被花的轉(zhuǎn)錄組差異分析

熊陽陽 羅琳莉 趙士豪 周安龍 王 錦

(西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，昆明 650224)

被譽為“攀援植物皇后”的鐵線蓮隸屬毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis)，因鐵線蓮無花瓣，其顯示出的花瓣實際是由萼片發(fā)育出來，故形態(tài)學(xué)中將其不同形態(tài)的花瓣稱之為花被。大花鐵線蓮花型由于萼瓣數(shù)的不同及雌雄蕊不同程度的瓣化顯現(xiàn)出單瓣、半重瓣及重瓣3種不同的形態(tài)。觀賞植物的花朵重瓣程度高低對其觀賞效果有極大的影響，而重瓣花也隨其應(yīng)用價值提升近年來成為觀賞植物育種的重點對象。近年來研究成果中發(fā)現(xiàn)，與植物花發(fā)育相關(guān)的基因并且參與花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄因子大部分都屬于MADS-box基因家族[1]，在ABCDE模型相關(guān)的基因中現(xiàn)已被報道出對植物重瓣花性狀起到調(diào)控作用的基因亞家族主要有AP1、AP3[2～3]、PI[3～4]、AGAMOUS[5～6]、FRUITFULL[7]、TM6-like[8]、SEP[9]等。影響花器官形成的條件有光照、溫度、水分、肥料及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[10]。開花誘導(dǎo)是開花發(fā)育的關(guān)鍵，也是植物生殖生長的啟動階段，受光周期促進(jìn)、自發(fā)促進(jìn)、春化作用、開花抑制、赤霉素誘導(dǎo)以及年齡途徑等多條途徑控制[11]。重瓣花性狀的形成是外界條件及內(nèi)在多類基因表達(dá)共同作用的結(jié)果。之前通過石蠟切片的試驗了解到大花鐵線蓮重被花的形態(tài)起源方式為雌雄蕊不同程度的瓣化，但鐵線蓮重瓣化形成的分子調(diào)控機(jī)理仍然未知。典型的鐵線蓮重被品種“薇安”(C.patens‘Vyvyan Pennell’)在不同季節(jié)表現(xiàn)為重被與單被的特性是探究重被花形成機(jī)制較好的研究素材。本次研究采用高通量測序技術(shù)對鐵線蓮“薇安”同一株上出現(xiàn)的3種不同花型(單被、半重被、重被)進(jìn)行測序并分析相關(guān)生物學(xué)信息。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能在減少成本的同時獲取大量 EST，發(fā)掘功能基因成為一種非常高效可靠且高輸出的重要手段，適合缺乏基因組信息的非模式物種開展生物信息學(xué)相關(guān)研究[12]。通過轉(zhuǎn)錄本的豐富情況反映出3個樣本中各差異基因的表達(dá)水平，并采用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)一步驗證，初步篩選出可能參與鐵線蓮單重被花性狀調(diào)控的關(guān)鍵基因，為后續(xù)在分子水平上繼續(xù)發(fā)掘鐵線蓮重瓣化的調(diào)控基因及具體的克隆、分離與表達(dá)等研究提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

該試驗材料選取引進(jìn)的早花大花型線蓮中典型的重被品種“薇安”(C.patens‘Vyvyan Pennell’)同一株上同一時期3種不同花型的完整花瓣(圖1)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。該品種由于雄蕊瓣化程度不同進(jìn)而外觀上產(chǎn)生即可開單瓣又可開半重瓣及重瓣的性狀。材料取下后放入液氮中速凍，之后保存在超低溫冰箱中備用。

圖1 供試材料“薇安”Fig.1 Test materials C.patens‘Vyvyan Pennell’

1.2 樣品檢測及cDNA文庫的構(gòu)建

將鐵線蓮“薇安”的3個樣品(A:單被花；B：半重被；C：重被)送往北京諾禾致源科技生物公司。先使用Qubit2.0和Agilent 2100檢測RNA的濃度和完整度，再使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。RNA濃度檢驗合格后通過PCR富集得到cDNA文庫，Clean reads采用Trinity v2.4.0軟件拼接成為transcripts[13]。

1.3 序列拼接、功能注釋及生物學(xué)通路分析

使用blast軟件將unigene序列分別與KOG、NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對統(tǒng)計功能注釋信息[14]。利用diamond軟件獲得NR、KOG及Swiss-Prot庫的基因功能注釋信息后，采用blast2go軟件獲取unigenes的GO注釋信息，再用KAAS軟件將unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對[15]。利用GOseq R和KOBAS軟件包進(jìn)行差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析[16]。

1.4 差異基因篩選及熒光定量PCR驗證

先采用TMM對read count數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再用DEGseq進(jìn)行差異分析，篩選閾值為Q-value<0.05且|log2FoldChange|>1，且Q-value越小基因表達(dá)量差異越顯著[17]。在3個樣品中共存的差異表達(dá)基因中篩選出與鐵線蓮花芽分化的相關(guān)關(guān)鍵基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證。用肌動蛋白(actin>Cluster-24019.26582[Sedum alfredii])作為內(nèi)參基因，用primer5.0設(shè)計PCR引物序列，各基因設(shè)3次PCR重復(fù)檢測，利用2^-△△Ct分析基因的相對表達(dá)量[18]，用超微量核酸蛋白測定儀(scandrop100)檢測RNA OD值，A260/A280比值計算RNA純度。樣品RNA檢測結(jié)果見表1，設(shè)定引物序列(5′—3′)見表2。

表1 樣品RNA檢測結(jié)果

表2 熒光定量PCR引物設(shè)定

圖2 差異基因維恩圖Fig.2 Differential gene venn diagram

2 結(jié)果與分析2.1 數(shù)據(jù)組裝拼接

通過轉(zhuǎn)錄組測序，共獲取3個樣品(A:單被花;B:半重被;C:重被)的轉(zhuǎn)錄組文庫，產(chǎn)生13.8GB原始數(shù)據(jù)。3個樣本Phred數(shù)值大于30比例(%)均超過87.44%。對組裝結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，共產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄組序列146 036個，基因99 652個。序列長度分布在201～14 638 bp，平均長度977 bp。N50分別為1 679及1 825 bp，拼接效果較好。

2.2 基因功能分類

將組裝得到的99 652條All-unigenes分別與7個公共數(shù)據(jù)庫NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、GO、Pfam和KOG比對，結(jié)果有9 133條(9.16%)unigenes在以上7個數(shù)據(jù)庫中均注釋成功。在轉(zhuǎn)錄本中，能夠被注釋到GO分類的Unigene有47 346條(47.51%)，有16 484條Unigene注釋到KOG數(shù)據(jù)庫，占總基因數(shù)的16.54%。KEGG通路分析共有23 555個基因參與了19個代謝通路，占總unigene的23.64%。通過與Nr庫進(jìn)行比對注釋獲取到與鐵線蓮基因序列最近緣的物種是蓮(Nelumbonucifera)[19]。

圖3 單被薇安與半重被薇安差異基因GO富集柱狀圖 橫坐標(biāo)為GO三個大類的下一層級的GO term，縱坐標(biāo)為注釋到該term下(包括該term的子term)的差異基因個數(shù) 1.碳水化合物代謝過程；2.對生長素的反應(yīng)；3.細(xì)胞葡聚糖代謝過程；4.葡聚糖代謝過程；5.多糖代謝過程；6.細(xì)胞多糖代謝過程；7.氧化還原過程；8.細(xì)胞碳水化合物代謝過程；9.細(xì)胞壁修飾；10.激素反應(yīng)；11.對內(nèi)生刺激的反應(yīng)；12.脂類生物合成的過程；13.脂肪酸生物合成過程；14.對有機(jī)物的反應(yīng)；15.脂肪酸代謝過程；16.化學(xué)反應(yīng)；17. 細(xì)胞壁組織；18.代謝過程；19.脂質(zhì)代謝過程；20.細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生；21.外部封裝結(jié)構(gòu)；22.細(xì)胞壁；23.質(zhì)外體；24.脂肪酸合成酶復(fù)合物；25.細(xì)胞外圍；26.胞外區(qū)；27.胞質(zhì)部分；28.BB若干；29.細(xì)胞胞質(zhì)；30.水解酶活性，作用于糖基鍵；31.水解酶活性，水解鄰糖基化合物；32.催化活性；33.木葡聚糖：木葡糖苷轉(zhuǎn)移酶活性；34.氧化還原酶活性；35.果膠酯酶活性；36.酶抑制劑的活性；37.血紅素結(jié)合；38.四吡咯粘合物；39.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移己糖基；40.羧酸酯水解酶活性；41. 3-氧基?；d體蛋白質(zhì)合成酶活性；42.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移糖基；43.水解酶活性；44.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移酰基；45.脂肪酸合酶活性；46.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移氨基?；酝獾孽；?7.鐵離子結(jié)合；48.腺苷同型半膀氨酸酶活動；49.水解酶活性，作用于醚鍵Fig.3 Single and semidouble flower C.patens‘Vyvyan Pennell’ GO enriched terms 1.Carbohydrate metabolic process; 2.Response to auxin; 3.Cellular glucan metabolic process; 4.Glucan metabolic process; 5.Polysaccharide metabolic process; 6.Cellular polysaccharide metabolic process; 7.Oxidation-reduction process; 8.Cellular carbohydrate metabolic process; 9.Cell wall modification; 10.Response to hormone; 11.Response to endogenous stimulus; 12.Lipid biosynthetic process; 13.Fatty acid biosynthetic process; 14.Response to organic substance; 15.Fatty acid metabolic process; 16.Response to chemical; 17.Cell wall organization; 18.Metabolic process; 19.Lipid metabolic process; 20.Cell wall organization or biogenesis; 21.External encapsulating structure organization; 22.Cell wall; 23.Apoplast; 24.Fatty acid synthase complex; 25.Cell periphery; 26.Extracellular region; 27.Cytosolic part; 28.BBSome; 29.Cytosol; 30.Hydrolase activity,acting on glycosyl bonds; 31.Hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds; 32.Catalytic activity; 33.Xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity; 34.Oxidoreductase activity; 35.Pectinesterase activity; 36.Enzyme inhibitor activity; 37.Heme binding; 38.Tetrapyrrole binding; 39.Transferase activity, transferring hexosyl groups; 40.Carboxylic ester hydrolase activity; 41. 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase activity; 42.Transferase activity,transferring glycosyl groups; 43.Transferase activity,transfer sugar-based; 44.Hydroase activity; 45.Fatty acid synthase activity transferase activityl; 46.Transferase activity,transferring acyl groups other than amino-acyl groups; 47.Adenosylhomocysteinase activity; 48.Iron ion binding; 49.Hydrolase activity,acting on ether bonds

圖4 單被薇安與重被薇安差異基因GO富集柱狀圖 1.碳水化合物代謝過程；2.細(xì)胞葡聚糖代謝過程；3.葡聚糖代謝過程；4.細(xì)胞多糖代謝過程；5.多糖代謝過程；6.細(xì)胞碳水化合物代謝過程；7.氧化還原過程；8.防御反應(yīng)；9.蔗糖代謝過程；10.淀粉代謝過程；11.二糖代謝過程；12.細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生；13.單個有機(jī)體代謝過程；14.胺生物合成的過程；15.細(xì)胞生物胺生物合成工藝；16.Wnt信號通路負(fù)調(diào)控；17.酪氨酸代謝過程；18.逆境反應(yīng)；19.細(xì)胞壁修飾；20.細(xì)胞壁組織；21.細(xì)胞壁；22.外部封裝結(jié)構(gòu)；23.質(zhì)外體；24.胞外區(qū)；25.細(xì)胞外圍；26.水解酶活性，水解鄰糖基化合物；27.水解酶活性，作用于糖基鍵；28.氧化還原酶活性；29.血紅素結(jié)合；30.木葡聚糖：木葡糖苷轉(zhuǎn)移酶活性；31.四吡咯粘合物；32.催化活性；33.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移糖基；34.酶抑制劑的活性；35.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移己糖基；36.碳氧裂解酶的活動；37.聚半乳糖醛酶活性；38.果膠酯酶活性；39.抗氧化活性；40.過氧化物酶活性；41.氧化還原酶活性，作用于過氧化氫作為受體；42.色氨酸合成酶活性；43.鐵離子結(jié)合；44.羧酸酯水解酶活性；45.裂合酶活性Fig.4 Single and double flower C.patens‘Vyvyan Pennell’ GO enriched term 1.Carbohydrate metabolic process; 2.Cellular glucan metabolic process; 3.Glucan metabolic process; 4.Cellular polysaccharide metabolic process; 5.Polysaccharide metabolic process; 6.Cellular carbohydrate metabolic process; 7.Oxidation-reduction process; 8.Defense response; 9.Sucrose metabolic process; 10.Starch metabolic process; 11.Disaccharide metabolic process; 12.Cell wall organization or biogenesis; 13.Single-organism metabolic process; 14.Amine biosynthetic process; 15.Cellular biogenic amine biosynthetic process; 16.Negative regulation of Wnt signaling pathway; 17.Tyrosine metabolic process; 18.Response to stress; 19.Cell wall modification; 20.Cell wall organization; 21.Cell wall; 22.External encapsulating structure; 23.Apoplast; 24.Extracellular region part; 25.Cell periphery; 26.Hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds; 27.Hydrolase activity,acting on glycosyl bonds; 28.Oxidoreductase activity; 29.Heme binding; 30.Xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity; 31.Tetrapyrrole binding; 32.Catalytic activity; 33.Transferase activity,transferring glycosyl groups; 34.Enzyme inhibitor activity; 35.Transferase activity,transferring hexosyl groups; 36.Carbon-oxygen lyase activity; 37.Polygalacturonase activity; 38.Pectinesterase activity; 39.Antioxidant activity; 40.Peroxidase activity; 41.Oxidoreductase activity,acting on peroxide as acceptor; 42.Tryptophan synthase activity; 43.Iron ion binding; 44.Carboxylic ester hydrolase activity; 45.Lyase activity

圖5 半重被薇安與重被薇安差異基因GO富集柱狀圖 1.碳水化合物代謝過程；2.多糖代謝過程；3.細(xì)胞葡聚糖代謝過程；4.葡聚糖代謝過程；5.細(xì)胞多糖代謝過程；6.細(xì)胞碳水化合物代謝過程；7.單細(xì)胞碳水化合物代謝過程；8.單個有機(jī)體代謝過程；9.二糖代謝過程；10.蔗糖代謝過程；11.淀粉代謝過程；12.核糖體生物合成；13.寡糖代謝過程；14.氧化還原過程；15.細(xì)胞壁修飾；16.核糖核蛋白復(fù)雜生物起源；17.細(xì)胞壁組織或生物起源；18.含吲哚的復(fù)合生物合成過程；19.外部封裝結(jié)構(gòu)組織；20.細(xì)胞壁組織；21.外部封裝結(jié)構(gòu)；22.細(xì)胞壁；23.質(zhì)外體；24.細(xì)胞外圍；25.核糖體；26.病毒基因組；27.β-半乳糖苷酶復(fù)合體；28.胞外區(qū)；29.細(xì)胞外基質(zhì)；30.膜的固有成分；31.膜的積分分量；32.蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)；33.光系統(tǒng)Ⅰ；34.精母細(xì)胞5-精母細(xì)胞6復(fù)合體；35.細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合體；36.核糖核蛋白復(fù)合體；37.核糖體的結(jié)構(gòu)成分；38.木葡聚糖：木葡糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性；39.結(jié)構(gòu)分子活性；40.水解酶活性，水解鄰糖基化合物；41.酶抑制劑的活性；42.氧化還原酶活性；43.水解酶活性，作用于糖基鍵；44.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移糖基；45.羧酸酯水解酶活性；46.催化活性；47.果膠酯酶活性；48.轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移己糖基；49.聚半乳糖醛酶活性；50.色氨酸合成酶活性；51.β-半乳糖苷酶活性；52.DNA-3甲基腺嘌呤糖基化酶的活性；53.DNA-3甲基堿糖基化酶的活性；54.碳氧裂解酶活性，作用于多糖；55.半乳糖苷酶活性；56.裂合酶活性Fig.5 Simidouble and double flower C.patens‘Vyvyan Pennell’GO enriched term 1.Carbohydrate metabolic process; 2.Polysaccharide metabolic process; 3.Cellular glucan metabolic process; 4.Glucan metabolic process; 5.Cellular polysaccharide metabolic process; 6.Cellular carbohydrate metabolic process; 7.Single-organism carbohydrate metabolic process; 8.Single-organism metabolic process; 9.Disaccharide metabolic process; 10.Sucrose metabolic process; 11.Starch metabolic process; 12.Ribosome biogenesis; 13.Oligosaccharide metabolic process; 14.Oxidation-reduction process; 15.Cell wall modification; 16.Ribonucleoprotein complex biogenesis; 17.Cell wall organization or biogenesis; 18.Indole-containing compound biosynthetic process; 19.External encapsulating structure organization; 20.Cell wall organization; 21.External encapsulating structure; 22.Cell wall; 23.Apoplast; 24.Cell periphery; 25.Ribosome; 26.Viral genome; 27.Beta-galactosidase complex; 28.Extracellular region; 29.Extracellular matrix; 30.Intrinsic component of thylakoid membrane; 31.Integral component of membrane; 32.Proteinaceous extracellular matrix; 33.Photosystem Ⅰ; 34.Smc5-Smc6 complex; 35.Intracellular ribonucleoprotein complex; 36.Ribonucleoprotein complex; 37.Structural constituent of ribosome; 38.Xyloglucan:xyloglucosyl transferase activity; 39.Structural molecule activity; 40.Hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosyl compounds; 41.Enzyme inhibitor activity; 42.Oxidoreductase activity; 43.Hydrolase activity,acting on glycosyl bonds; 44.Transferase activity,transferring glycosyl groups; 45.Carboxylic ester hydrolase activity; 46.Catalytic activity; 47.Pectinesterase activity; 48.Transferase activity,transferring hexosyl groups; 49.Polygalacturonase activity; 50.Tryptophan synthase activity; 51.Beta-galactosidase activity; 52.DNA-3-methyladenine glycosylase activity; 53.DNA-3-methylbase glycosylase activity; 54.Carbon-oxygen lyase activity,acting on polysaccharides; 55.Galactosidase activity; 56.Lyase activity

圖6 單被vs半重被差異基因KEGG富集散點圖Fig.6 A vs B DEG enriched KEGG pathway

圖7 單被vs重被差異基因KEGG富集散點圖Fig.7 A vs C DEG enriched KEGG pathway

2.3 “薇安”不同花被中的差異基因分析

通過對試驗材料“薇安”同一時期同一植株上的3個不同花型的轉(zhuǎn)錄本兩兩對比進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，共獲得3 075條差異表達(dá)基因(DEG)，其中單被花與半重被樣本對比(A vs B)包括649條上調(diào)DEG，605條下調(diào)DEG；半重被花與重被花對比(B vs C)包括上調(diào)DEG 1 046條和下調(diào)DEG 721條；單被花與重被花對比(A vs C)有上調(diào)DEG 1 129條和下調(diào)DEG 859條。將各組合比較得到的差異基因個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計畫成維恩圖可直觀展現(xiàn)出各差異比較組合之間共有與特有的差異基因數(shù)目，對3個兩兩比較的組合篩選的差異基因數(shù)目繪制維恩圖結(jié)果見圖2。

2.3.1 差異表達(dá)基因的GO富集分析

對“薇安”3種花型兩兩比較組合的差異基因根據(jù)上調(diào)或下調(diào)分開分別進(jìn)行富集分析，差異表達(dá)基因分屬于生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子類別(MF)三大類。如圖3，單被“薇安”與半重被“薇安”(A vs B)對比注釋到2 220條Unigene，在49個二級節(jié)點中，差異基因數(shù)目分布最多的是代謝生物過程(614個,64.97%)、細(xì)胞外區(qū)域細(xì)胞成分(68個,7.2%)、催化活性分子功能(580個,61.38%)；如圖4，單被“薇安”與重被“薇安”(A vs C)對比注釋到2 592條Unigene，在45個二級節(jié)點中，差異基因數(shù)目分布最多的是碳水化合物代謝過程(172個,11.67%)、胞外區(qū)(94個,6.38%)、催化活性(839個,56.92%)；如圖5，半重被“薇安”與重被“薇安”(B vs C)對比注釋到2 507條Unigene，在56個二級節(jié)點中，差異基因數(shù)目分布最多的是單個有機(jī)體代謝過程(422個,31.87%)、膜的固有成分(200個,15.11%)、催化活性(753個,56.87 %)。

2.3.2 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

差異基因KEGG富集散點圖是KEGG富集分析結(jié)果的圖形化展示方式，KEGG富集程度通過Rich factor、qvalue和富集到此通路上的基因個數(shù)來衡量[20]。在3個樣本兩兩對比中挑選出富集最顯著的20條pathway條目展示在圖中。如圖6，單被與半重被“薇安”差異表達(dá)基因?qū)Ρ裙矃⑴c93條代謝通路，其中富集程度較多的是3(淀粉和蔗糖的代謝，55個)、6(苯丙素的生物合成，50個)以及14(氰氨基酸代謝，38個)。單被與重被“薇安”差異對比共參與96條代謝通路，富集程度較多的是3(淀粉和蔗糖的代謝，66個)、4(苯丙素的生物合成，53個)、14(氰氨基酸代謝，35個)(圖7)。半重被與重被“薇安”差異對比共參與98條代謝通路，其中富集程度較多的是3(核糖體，54個)、2(淀粉和蔗糖的代謝，36個)、9(戊糖和葡萄糖醛酸結(jié)合，28個)(圖8)。

2.3.3 鐵線蓮單重被花性狀相關(guān)基因的篩選

根據(jù)差異篩選的閾值及基因功能注釋，在所有的DEG中共挑選出25條可能與鐵線蓮重瓣化性狀相關(guān)的基因(表3)。25條差異基因的FPKM值進(jìn)行表達(dá)水平聚類分析用于計算3個樣本中相對表達(dá)量的高低情況[21](圖9)。Log2FC為表達(dá)量差異倍數(shù)的對數(shù)值，值為正數(shù)代表該基因上調(diào)，值為負(fù)數(shù)代表基因下調(diào)。綜合圖表可知在單瓣花中表達(dá)量較高的基因有MADS域蛋白中的PMADS1、AP3、FRUITFULL基因，促進(jìn)頂端分生組織蛋白及主要在雌蕊柱中表達(dá)的1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸合成酶；生長素類有吲哚乙酸和脫落酸；在半重瓣中表達(dá)量較高的有MADS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白FLC下游蛋白，以及激活甲基化反應(yīng)的S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、參與細(xì)胞壁構(gòu)建的果膠甲酯酶及木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶等，生長素類有吲哚乙酸和脫落酸；在重瓣花中表達(dá)量較高的基因是參與冷脅迫的幾丁質(zhì)酶、CHY鋅指結(jié)構(gòu)及生長素輸入載體蛋白。

2.4 10條候選基因的熒光定量PCR驗證

在3個樣本中共存的134條差異表達(dá)基因中根據(jù)各基因代謝通路及功能選出10個readcount值較大、序列較長且可能與花發(fā)育有關(guān)的基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證(圖10～19)。綜合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及熒光定量PCR驗證結(jié)果對比可知：10個基因中轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與PCR結(jié)果對比在三類花型中差異情況完全一致的有4個，部分差異一致的基因有5個，僅1個ATP酶亞基類基因結(jié)果存在差異。其中在單瓣中表達(dá)量數(shù)值最高的基因類型有cluster-24019.21952硝酸還原酶,最低的有cluster-24019.21011生長素反應(yīng)蛋白IAA9、cluster-24019.24487ATP酶亞基、 cluster-24019.26193ABC轉(zhuǎn)運體、cluster-24019.26426柚苷配基，2氧化戊二酸3加雙氧酶。在重瓣花中差異表達(dá)量最高的基因有cluster-24019.29079、cluster-24019.21011生長素反應(yīng)蛋白IAA9；表達(dá)量最低的有cluster-24019.25875木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶、cluster-24019.48125脫落酸 8′羥化酶、cluster-24019.23933MADS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)FLC下游蛋白。

圖8 半重被vs重被差異基因KEGG富集散點圖Fig.8 B vs C DEG enriched KEGG pathway

表3 25個關(guān)鍵基因的名稱、功能及表達(dá)模式

圖10 生長素反應(yīng)蛋白IAA9表達(dá)量差異Fig.10 Expression difference of auxin-responsive protein IAA9

圖11 硝酸還原酶表達(dá)量差異Fig.11 Expression difference of nitrate reductase[NADH]

圖12 MADS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)FLC下游蛋白表達(dá)量差異Fig.12 Expression difference of protein downstream of FLC

圖13 ATP酶亞基表達(dá)量差異Fig.13 Expression difference of ATPase subunit

圖14 木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶表達(dá)量差異Fig.14 Expression difference of xyloglucan endotransglucosylase

圖15 ABC轉(zhuǎn)運體表達(dá)量差異Fig.15 Expression difference of ABC transporter B family

圖16 生長素載體蛋白表達(dá)量差異Fig.16 Expression difference of auxin carrier protein

圖17 柚苷配基，2氧化戊二酸3加雙氧酶表達(dá)量差異Fig.17 Expression difference of naringenin,2-oxoglutarate 3-dioxygenase

圖18 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶表達(dá)量差異Fig.18 Expression difference of S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase

圖19 脫落酸8′羥化酶表達(dá)量差異Fig.19 Expression difference of Abscisic acid 8′-hydroxylase

圖10顯示生長素反應(yīng)蛋白IAA9在重被花中表達(dá)量最高且差異顯著，在單被中表達(dá)量最低，PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致；圖11中硝酸還原酶在單被花中表達(dá)量最高，在半重被及重被中表達(dá)量差別不大，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致；圖12中MADS轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)FLC下游蛋白在半重被中表達(dá)量較高，單重被的表達(dá)量差別不大，這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果完全一致；圖13中ATP酶亞基PCR顯示在單被中表達(dá)量最低，但轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中重被的表達(dá)量最低，三者間表達(dá)量值差別不大；圖14中木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶在半重被中表達(dá)量最高，單重被花中的表達(dá)量差別不大，這與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果完全吻合；圖15中ABC轉(zhuǎn)運體基因在單被中表達(dá)量最低，PCR顯示在重被中表達(dá)量顯著較高，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)部分一致；圖16中生長素載體蛋白在轉(zhuǎn)錄組與PCR結(jié)果中均顯示表達(dá)量在重被中顯著較高；圖17中柚苷配基，2氧化戊二酸3加雙氧酶在轉(zhuǎn)錄組與PCR數(shù)據(jù)中均顯示表達(dá)量在單被中表達(dá)量顯著較低，PCR顯示在重被中表達(dá)量顯著較高；圖18中S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶在三類花瓣中的表達(dá)量數(shù)值相近，PCR顯示在重被中的差異表達(dá)量較高；圖19中脫落酸8′羥化酶在轉(zhuǎn)錄組與PCR驗證中均顯示差異表達(dá)量在重被中顯著下調(diào)，二者結(jié)果對比差異情況完全一致。

3 討論

根據(jù)植物對環(huán)境條件的反應(yīng)及自身的生物學(xué)特性，可以將植物成花類型分成光周期成花、春化作用成花和基因控制的植物成花3個類型[22]。重瓣花形成的分子機(jī)理可能是與 MADS-box功能基因突變或互作有關(guān)，這其中很可能是C-function基因突變及對下游調(diào)控因子的影響造成重瓣花形成，近年來調(diào)控重瓣花發(fā)育的許多同源異形基因被分離鑒定[23]。在篩取差異基因的過程中發(fā)現(xiàn)與MADS-box相關(guān)的基因約60個，但在單被和重被樣本對比中存在樣本對比差異的基因只有5個，說明在鐵線蓮重瓣化的過程中的行使調(diào)控功能作用的不僅僅由開花相關(guān)類基因調(diào)控。在鐵線蓮單被向重被轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)量存在顯著差異的基因類型主要與生長素類、ABCDE模型基因、低溫、生長發(fā)育中與細(xì)胞結(jié)構(gòu)及DNA甲基化反應(yīng)相關(guān)。在單被與重被樣本對比中篩到的MADS-BOX類基因有PMADS1、AP3、FRUITFULL及參與MADS調(diào)控的FLC下游蛋白，且都在單被中表達(dá)量較高，重被中表達(dá)量較低。由此可推測這幾類開花基因在花瓣中的低表達(dá)影響了鐵線蓮由單被向重被的轉(zhuǎn)化。半重被是鐵線蓮萼片由單被逐漸瓣化為重被的過程形態(tài)，它們行使的功能與生長發(fā)育、內(nèi)源物質(zhì)及與生長素類有關(guān)的基因IAA9、生長素載體蛋白在重被中表達(dá)量顯著最高，而脫落酸 8′羥化酶在單被中表達(dá)量較高。綜合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及熒光定量PCR驗證結(jié)果對比：在三類花型中共存的10個差異基因中轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與PCR結(jié)果對比差異情況完全或基本一致的有9個，說明本次試驗數(shù)據(jù)可靠且具有一定的說服性。

4 結(jié)論

將鐵線蓮“薇安”同一時期同一株上的3種花型的轉(zhuǎn)錄本兩兩比較，在GO富集分析中，3個對比數(shù)據(jù)中差異基因數(shù)目分布最多的共同二級類別是催化活性，KEGG富集分析中差異基因數(shù)目分布較多的共同通路是淀粉和蔗糖的代謝。在幾類內(nèi)源激素中主要參與了重瓣化的調(diào)控激素是吲哚乙酸和脫落酸，且相同條件下IAA在重被中表達(dá)量較高，ABA在單被中表達(dá)量較高。在鐵線蓮單被向重被轉(zhuǎn)化的過程中，特定開花基因的調(diào)控、低溫、內(nèi)源激素含量變化均起到了不可忽略的主導(dǎo)作用。綜合數(shù)據(jù)結(jié)果初步篩選出可能調(diào)控鐵線蓮重被化的部基因主要有MADS-BOX類基因PMADS1、AP3、FRUITFULL、FLC；生長素反應(yīng)蛋白IAA9、生長素輸入載體、吲哚乙酸誘導(dǎo)蛋白、ARG7脫落酸 8′羥化酶。這些基因表達(dá)量顯著上調(diào)或下調(diào)都有可能使鐵線蓮重瓣性狀產(chǎn)生。本次試驗步篩選出部分可能參與鐵線蓮重瓣性狀調(diào)控的關(guān)鍵基因，為探究鐵線蓮重瓣化形成分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，后續(xù)可對這些候選基因進(jìn)一步功能驗證及深入研究。