HILIC-MS/MS測定牛奶中4種含氮化合物的含量*

SONG HANEUN(宋漢恩)，任 燕

(濱州醫(yī)學院，山東 煙臺 264003)

三聚氰胺(melamine，MEL)、三聚氰酸(cyanuric acid，CY)、二氰二胺(dicyandiamide，DCD)和尿酸(uric acid，UA)的含氮量如果折合成粗蛋白的含氮量，數(shù)值會大大增加[1]。牛奶中的蛋白質(zhì)的成分特別復雜，一般測定蛋白常用凱氏定氮法，但是這種方法只是檢測含氮的多少，不能檢測樣品中是不是含有非蛋白的氮成分。所以一些不法商家常將上述四種物質(zhì)添加到牛奶當中，從而使蛋白質(zhì)的含量測定值上升，嚴重影響我國奶制品質(zhì)量安全[2]。但三聚氰胺、三聚氰酸會引起腎結(jié)石或膀胱結(jié)石等病癥，甚至引起腎衰竭，吸入或者攝入二氰二胺后對身體有害，而尿酸會導致人體體液變酸，影響正常細胞的功能，長期發(fā)現(xiàn)不了或不治療將會引發(fā)痛風，這四種物質(zhì)均嚴重危害人們的身體健康[3-5]。牛奶中有可能存在三聚氰胺、三聚氰酸、二氰二胺和尿酸這些非法添加物。為保證牛奶的安全性，同時檢測三聚氰胺、三聚氰酸、二氰二胺和尿酸非常必要[1-9]。

目前檢測這四個化合物的分析方法很多，包括氣質(zhì)聯(lián)用法[10]、高效液相色譜法[11]等。但尚沒有對三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、二氰二胺同時進行檢測的分析方法。由于三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、二氰二胺的親水性質(zhì)，在普通的反相色譜柱上幾乎無保留，在不添加任何離子對試劑的條件下，HILIC柱對極性物質(zhì)有很好的保留能力，因此本實驗采用親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸、二氰二胺的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Agilent Hilic色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；液質(zhì)聯(lián)用儀器(包括島津高效液相色譜儀：檢測器為SPD-20A，高壓泵LC-20AD，控制器為CMB-20A，柱溫箱為CTO-20A和Applied Biosystems API3200質(zhì)譜儀)；TB-215D電子分析天平，丹佛儀器有限公司；DHG-9423A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；KG-50B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀公司；HH-4數(shù)量恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；TG16-WS合式高速離心機，上海盧湘儀離心儀器有限公司。

1.2 試 藥

甲醇、乙腈為色譜純；純水；9個品牌純牛奶。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件

親水性色譜柱Agilent Hilic色譜柱(4.6 mm×100 mm，3.5 μm)；流動相A為純水，流動相B為乙腈，恒度洗脫(純水:乙腈=50:50)；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為25 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件

表1 標準品的MRM模式參數(shù)

*定量離子，Δ定性離子。

氣簾氣(Curtain Gas)：10 psi；碰撞氣(Collision Gas)：4 psi；離子噴霧電壓(IonSpray Voltage)正離子：5500 V，負離子：-4400 V；離子源溫度(turbopray temperature)：550 ℃；霧化氣(Gas 1)：55 psi；加熱氣(Gas 2)：55 psi。標準品的MRM模式參數(shù)見表1。

2.2 標準品溶液的制備

分別稱取4個化合物適量，加入50%甲醇溶解，最終配制成三聚氰酸、二氰二胺、尿酸濃度均為4.0 μg/mL、2.0 μg/mL、1.0 μg/mL、0.8 μg/mL、0.4 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL和三聚氰胺濃度20.0 ng/mL、10.0 ng/mL、5.0 ng/mL、4.0 ng/mL、2.0 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL的系列標準品混合溶液。

2.3 供試品溶液制備

分別量取九個不同品牌的牛奶樣品100 μL，加入甲醇500 μL，渦旋15 s混合均勻，于4500 rpm離心10 min，取上清液于37 ℃下氮氣吹干。然后加入50 μL溶劑(甲醇:水=1:1)，超聲3 min，13000 rpm離心10 min。取上清液進行分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 樣品專屬性實驗

4個化合物在“2.1”質(zhì)譜色譜條件下所得的譜圖見圖1，三聚氰胺在正離子模式下檢測，三聚氰酸、尿酸、二氰二胺在負離子模式下檢測?？瞻兹軇┘皹悠啡芤涸凇?.1”分析條件下檢測所得的譜圖見圖2、圖3。結(jié)果表明，空白溶劑不會對標準品的測定產(chǎn)生影響，該實驗分析方法的專屬性良好。

圖1 二氰二胺(a)、三聚氰酸(b)、三聚氰胺(c)和尿酸(d)的HPLC-MS圖

圖2 二氰二胺(a)、三聚氰酸(b)、三聚氰胺(c) 和尿酸(d)的空白溶劑HPLC-MS圖

圖3 二氰二胺(a)、三聚氰酸(b)、三聚氰胺(c)和尿酸(d)的樣品溶液HPLC-MS圖

2.4.2 Carryover實驗

將4個化合物的最高定量限的標準混合溶液(三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為4.0 μg/mL，三聚氰胺的濃度為20 ng/mL)進行進樣，分析完之后立即分析空白溶液。將空白溶液中標準品的峰面積與最低定量限中標準品的峰面積進行比較，考察其carryover，其值均小于20%，表明高濃度標準品的殘留污染不會對樣品測定產(chǎn)生影響。

2.4.3 標準曲線與線性關(guān)系

分別以四個標準品的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標建立標準曲線，三聚氰胺在濃度范圍0.5～20 ng/mL內(nèi)線性良好，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度范圍均在100～4000 ng/mL內(nèi)線性良好，標準曲線方程與R值見表2。

表2 各標準品的標準曲線方程

2.4.4 精密度，重復性和穩(wěn)定性實驗

配制4個化合物的標準混合溶液，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為3.2 μg/mL、1.0 μg/mL、0.4 μg/mL，三聚氰胺對應(yīng)的濃度分別為16.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL，按照“2.1”的分析條件下用于精密度、重復性及穩(wěn)定性的考察。連續(xù)進樣6次考察日內(nèi)精密度，隨后連續(xù)三天每天進樣6次考察日間精密度考察，配制6份三聚氰酸、二氰二胺、尿酸、三聚氰胺的標準混合溶液重復性考察，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h共進樣8次，根據(jù)色譜峰面積變化來判斷樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其RSD值均小于15%，說明該方法精密度、重復性、穩(wěn)定性良好。實驗結(jié)果見表3。

2.4.5 加樣回收率實驗

配制4個化合物的標準混合溶液，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為3.2 μg/mL、1.0 μg/mL、0.4 μg/mL，三聚氰胺對應(yīng)的濃度分別為16.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL，分別將高、中、低三個濃度的混合標準溶液加入到空白牛奶樣品中，每一水平平行制備6份，檢測其加樣回收率。結(jié)果測得三聚氰胺回收率在85.5%～109.0%之間，三聚氰酸回收率在83.8%～109.0%之間，尿酸回收率在88.4%～115.0%之間，二氰二胺回收率在82.5%～115.0%之間，回收率滿足樣品分析的要求，實驗結(jié)果見表3。

表3 精密度、重復性、穩(wěn)定性和回收率數(shù)據(jù)

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng)

表4 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

A組：配制4個化合物的標準混合溶液，三聚氰酸、二氰二胺、尿酸的濃度均為3.2 μg/mL、1.0 μg/mL、0.4 μg/mL，三聚氰胺對應(yīng)的濃度分別為16.0 ng/mL、5.0 ng/mL、2.0 ng/mL，高、中、低三個濃度每個濃度進樣6次，進行液質(zhì)聯(lián)用分析。

B組：分別稱取空白牛奶樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入甲醇500 μL，渦旋15 s混合均勻，于4500 rpm離心10 min，取出上清液，于37 ℃下用氮氣吹干。然后加入50 μL 標準品混合溶液，渦旋15 s混合均勻，超聲3 min，在13000 rpm高速離心10 min。取上清液進樣10 μL，每個濃度平行6份，進行液質(zhì)聯(lián)用分析。結(jié)果如表4所示，由表中結(jié)果可以看出樣品的基質(zhì)效應(yīng)均在87.90%～108.0%之間，符合標準。

2.5 樣品測定

分別稱取九個不同品牌的牛奶樣品100 μL，按供試品操作方法進行制備，然后進行液質(zhì)連用分析。結(jié)果有八個品牌牛奶中含有尿酸，另外一個品牌牛奶中未檢測出任何一種違禁物質(zhì)。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果

2.6 陽性樣品的結(jié)果確證

為了避免所測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，我們根據(jù)2002/657/EC進行判定，2002/657/EC是2008年8月12日被歐盟授權(quán)執(zhí)行關(guān)于分析方法的運行和結(jié)果解釋歐盟指令96/23/EC的授權(quán)文件。這一授權(quán)文件中，描述了相對離子強度最大的允許范圍。

表6 陽性樣品峰面積比值

根據(jù)尿酸標準品計算求得定性離子/定量離子平均值為88.3%，陽性樣品的定性離子/定量離子的比值在≥50%范圍內(nèi)，HPLC-MS/MS允許的誤差范圍為±20%。由表6可知，陽性樣品的相對離子強度偏差都在允許的誤差范圍內(nèi)，確證該實驗所測樣品結(jié)果為陽性結(jié)果。

3 討 論

3.1 色譜柱的選擇

開始選用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)進樣，發(fā)現(xiàn)幾個標準品由于極性太大，在色譜柱上幾乎不保留，保留時間比較小，也不能很好地分離。選用親水性的Agilent Hilic色譜柱(4.6×100 mm，3.5 μm)進行分析，幾個標準品得到較好的分離，且保留時間均延后，適于三聚氰胺、三聚氰酸、尿酸和二氰二胺這些極性化合物的分析。

3.2 流動相的選擇

選用乙腈-乙酸水和乙腈-水分別作為流動相進行比較分析，結(jié)果顯示加入的乙酸會抑制三聚氰酸負離子的信號強度，所以選擇乙腈-水來作為流動相進行色譜分析。此外分別進行了乙腈:水為95:5、90:10、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、10:90、5:95九種不同比例的流動相進行分析，最終結(jié)果顯示在乙腈:水為50:50的情況下，各個標準品的色譜峰信號強度最強，峰形最美觀，不拖尾，無雜峰。所以最終選用乙腈:水為50:50作為流動相進行色譜分析。