在耐熱的馬克斯克魯維酵母中構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠

王冬梅, 洪 泂

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，合肥230026)

由于微生物具有多樣的代謝能力，可方便地進(jìn)行基因工程改造，通常還有快速增殖能力、易大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地用于構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，生產(chǎn)大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品、生物燃料、藥物及各種天然產(chǎn)物等。目前最常用的是以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為基礎(chǔ)構(gòu)建的真核微生物細(xì)胞工廠。由于釀酒酵母有悠久的研究歷史，其遺傳操作技術(shù)成熟，基因組信息也比較明確，而且還積累了大量的基因功能與生化方面的信息，使其可以生產(chǎn)多種多樣的產(chǎn)品[1]。而許多非釀酒酵母的酵母菌由于其特殊的遺傳及代謝特點(diǎn)，在微生物細(xì)胞工廠的應(yīng)用中也很有特色。例如巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)可以利用甲醇等甲基底物，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)能利用含脂肪或蛋白質(zhì)的廢料，這使它們?cè)谝恍╊I(lǐng)域比釀酒酵母更有優(yōu)勢(shì)。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)由于具有耐熱、高生長(zhǎng)速率和很強(qiáng)的五碳糖與菊糖利用能力，在構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1 馬克斯克魯維酵母的基本特點(diǎn)

馬克斯克魯維酵母屬于真菌-子囊菌門(mén)-酵母菌亞門(mén)-酵母菌目-酵母科-克魯維酵母菌屬。它于1888年第一次被發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于昆蟲(chóng)和果實(shí)中，并且在發(fā)酵乳制品例如奶酪和克菲爾粒中大量存在，通過(guò)生產(chǎn)各種脂類、酮類、醛類和醇類物質(zhì)使奶制品有特殊的風(fēng)味，也正因?yàn)槿绱笋R克斯克魯維酵母是經(jīng)美國(guó)FDA認(rèn)證的一種GRAS (Generally Recognized as Safe)級(jí)別的微生物，2013年中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)此酵母為可食用菌種。馬克斯克魯維酵母本身還具有很多其他的優(yōu)勢(shì)使其可能成為工業(yè)生產(chǎn)菌株：首先，可以在高溫下進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)酵，有些菌株最高生長(zhǎng)溫度達(dá)52 ℃[2]。這就意味著在工業(yè)級(jí)發(fā)酵中可以降低冷卻費(fèi)用以及產(chǎn)物的蒸餾分離成本[3]，可以在夏季及熱帶地區(qū)方便地進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)；同時(shí)被雜菌污染的可能性也大幅降低；還可以提高發(fā)酵過(guò)程中添加酶的催化效率，例如纖維素酶、淀粉酶等，這都可以降低生產(chǎn)成本[4]。其次，它可以利用非常廣泛的碳源，利用葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和菊糖等作為單一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。這些碳源中許多是農(nóng)林業(yè)或乳制品業(yè)的廢物或副產(chǎn)物中的主要成分，例如木糖是木質(zhì)纖維素中半纖維素的主要成分，乳清是乳制品工業(yè)中產(chǎn)生的富含乳糖的副產(chǎn)物，菊糖在菊芋、菊苣中大量存在，這使得馬克斯克魯維酵母利用廉價(jià)原材料等進(jìn)行發(fā)酵成為可能。最后，馬克斯克魯維酵母具有很高的生長(zhǎng)速率，在40 ℃時(shí)生長(zhǎng)速率可達(dá)0.86～0.99/h，被認(rèn)為是生長(zhǎng)最快的真核生物[5]，可以迅速獲得大量的細(xì)胞，提高生產(chǎn)速率。

綜上所述，馬克斯克魯維酵母作為一種生物安全的真核微生物，能夠利用多樣的碳源、高生長(zhǎng)速率、耐高溫等特點(diǎn)，使得它成為潛在的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用菌，被越來(lái)越多的研究人員用于構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠。

2 野生型馬克斯克魯維酵母在微生物細(xì)胞工廠上的應(yīng)用

鑒于馬克斯克魯維酵母有很多優(yōu)秀的品質(zhì)，有很多天然的菌株直接作為微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)各種產(chǎn)品。

2.1 菊糖酶的生產(chǎn)

菊糖酶(inulinase)，也叫菊粉酶，水解2,1-β-D-果聚糖果糖苷鍵，產(chǎn)生果糖、葡萄糖或寡聚果糖，可以用于生產(chǎn)高果糖漿、寡聚果糖，而產(chǎn)生的果糖和葡萄糖還可進(jìn)一步用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等其他產(chǎn)品。很多馬克斯克魯維酵母是天然的菊糖酶高產(chǎn)菌株(表1)。其中K.marxianusYS-1菌株經(jīng)過(guò)多輪條件優(yōu)化后，所產(chǎn)菊糖酶酶活從最初的47.3 U/mL提高到了140.23 U/mL[6]，而K.marxianusNBRC1777在木糖的誘導(dǎo)下，酶產(chǎn)量可達(dá)330 U/mL[7]。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，K.marxianusNRRL Y-7571可表達(dá)1294 U/mL菊糖酶[8]。不過(guò)可能由于酶的熱穩(wěn)定性，以及最適產(chǎn)酶條件等問(wèn)題，大多沒(méi)有采用高溫條件下培養(yǎng)產(chǎn)酶。

表1 天然能夠高效生產(chǎn)菊糖酶的馬克斯克魯維酵母菌株

注：CDW為細(xì)胞干重；ds為干底物

2.2 利用生物質(zhì)和農(nóng)牧業(yè)廢料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

由于生物質(zhì)燃料乙醇來(lái)自生物質(zhì)，而生物質(zhì)的可再生、可持續(xù)特性使生物質(zhì)乙醇在減少化石燃料使用、降低溫室氣體排放等方面很有優(yōu)勢(shì)，對(duì)農(nóng)牧業(yè)廢料的利用還可以減少環(huán)境污染、提高企業(yè)效益。由于馬克斯克魯維酵母不僅耐熱，在高溫(>40 ℃)下依然有不錯(cuò)的乙醇發(fā)酵能力，因此也被廣泛地用于利用生物質(zhì)和農(nóng)牧業(yè)廢料生產(chǎn)乙醇的研究中。

首先是利用菊芋、龍舌蘭等高菊糖含量的生物質(zhì)材料生產(chǎn)乙醇。由于很多馬克斯克魯維酵母能夠天然表達(dá)和分泌大量的菊糖酶，這賦予了該酵母高效利用菊芋等高菊糖含量材料的能力。在利用這些生物質(zhì)時(shí)，無(wú)需補(bǔ)充菊糖酶，馬克斯克魯維酵母就可以直接水解菊糖，也就是通過(guò)聯(lián)合生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)高效生產(chǎn)乙醇(表 2)。其中利用菊芋生產(chǎn)乙醇的能力最高可超過(guò)90 g/L[13]。不過(guò)為了保證發(fā)酵過(guò)程中菊糖酶的表達(dá)，發(fā)酵溫度并不高。

其次，利用乳清或乳清滲出液等乳業(yè)廢料生產(chǎn)乙醇。馬克斯克魯維酵母廣泛存在于乳制品中，有很好的利用乳糖的能力，而乳制品廢料中含有很高的乳糖(乳清4%～5%，乳清滲出液 6.8%～8.5%)[14]，因此可利用馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化乳糖。通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵裝置，Jedrzejewska 等利用乳清生產(chǎn)乙醇，生產(chǎn)速度最高可達(dá)8.61 g/L·d，得率0.203 g/g[15]。而從奶酪中分離出的K.marxianusURM 7404菌株以乳清和乳清滲出物為材料生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)量達(dá)11.48 g/L，生產(chǎn)速率達(dá)0.75 g/L·h[14]。

最后，利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇。由于馬克斯克魯維酵母天然能利用葡萄糖和木糖，而木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解后最主要的可發(fā)酵單糖是葡萄糖和木糖，因此馬克斯克魯維酵母也被用于蔗渣、葵粕、腰果渣、麥稈、柳條稷、雙稃草等木質(zhì)纖維素生物質(zhì)類型農(nóng)林廢料水解液的發(fā)酵(表2)。由于馬克斯克魯維酵母不表達(dá)纖維素酶，所以在利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)時(shí)需要添加纖維素酶，通常先通過(guò)纖維素酶將木質(zhì)纖維素糖化再利用(SHF)，或者進(jìn)行同步糖化與發(fā)酵(SSF)。由于這種酵母可以在較高溫度下生長(zhǎng)和發(fā)酵，而商業(yè)化的纖維素酶的最適溫度在48～50 ℃，這使得它在利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)方面更有優(yōu)勢(shì)。

正是由于馬克斯克魯維酵母可以在高溫發(fā)酵，因此采用該酵母通過(guò)SSF生產(chǎn)纖維素乙醇的研究較多，以下列舉一些高效率地木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的同步糖化與發(fā)酵的例子，可以看出在利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的同步糖化與發(fā)酵過(guò)程中，采用的發(fā)酵溫度都較高，多在40 ℃以上，甚至達(dá)到了45 ℃(表 2)。早在1991年，Ballesteros等就成功地采用馬克斯克魯維酵母在42 ℃通過(guò)SSF利用纖維素生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)量達(dá)37.6 g/L。其后，出現(xiàn)大量通過(guò)同步糖化與發(fā)酵利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的研究，但是產(chǎn)量都不高。de Barros研究組和Saini研究組，采用馬克斯克魯維酵母分別對(duì)腰果渣和麥稈在40 ℃和42 ℃進(jìn)行了同步糖化與發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量都超過(guò)了60 g/L(表2)。通過(guò)SSF利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量仍然不是太高的幾個(gè)因素為：1)馬克斯克魯維酵母的乙醇耐受性不夠好；2)前處理后的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中有發(fā)酵的抑制物；3)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中只有部分單糖能夠水解釋放出來(lái)，導(dǎo)致酵母實(shí)際能利用的糖濃度并不高；4)葡萄糖抑制效應(yīng)的存在導(dǎo)致對(duì)木糖等五碳糖的利用效率太低。

表 2 利用野生型馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)乙醇

注：“-”沒(méi)有數(shù)據(jù)

2.3 苯乙醇的生產(chǎn)

野生型的馬克斯克魯維酵母還具有較好風(fēng)味和芳香化合物的生產(chǎn)能力[28]。它們常常在酸奶、奶酪和葡萄酒中存在，對(duì)這些產(chǎn)品的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，但是對(duì)這方面生產(chǎn)研究的報(bào)道并不多。

苯乙醇(2-phenylethanol)由于有玫瑰的香味和甜味被廣泛地在化妝品和食品工業(yè)中作為香料和調(diào)味劑，天然的苯乙醇從玫瑰花瓣中提取，效率較低；大規(guī)模的商業(yè)化產(chǎn)品由化學(xué)法合成，但是化學(xué)法合成中溶劑和副產(chǎn)品會(huì)影響苯乙醇品質(zhì)；近年來(lái)，消費(fèi)者更喜歡生物法的天然產(chǎn)物，這就有了發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙醇的需求。由于苯乙醇對(duì)酵母細(xì)胞有一定的毒性，所以通常馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)苯乙醇的產(chǎn)量不高, 生產(chǎn)速度也比較低。De Lima 等篩選到的K.marxianusCCT 7735能夠生產(chǎn)3.44 g/L的苯乙醇[29]，已經(jīng)是很高的產(chǎn)量了，但是離工業(yè)化生產(chǎn)要求的產(chǎn)量仍有很大差距。通過(guò)原位產(chǎn)物移除技術(shù)(insituproduct removal, ISPR)，可以不斷地將培養(yǎng)基中的苯乙醇吸附或分離到另一相中，從而降低培養(yǎng)基中苯乙醇的濃度，提高苯乙醇的產(chǎn)量和生產(chǎn)速度。其中通過(guò)采用Hytrel 8206 珠子的液固雙相分離系統(tǒng)的方法，K.marxianusCBS 600在35 ℃利用苯丙氨酸生產(chǎn)苯乙醇的濃度達(dá)到了20.4 g/L，其生產(chǎn)速率高達(dá)0.43 g/L·h[30]。

2.4 乙酸乙酯(ethyl acetate)的生產(chǎn)

乙酸乙酯是一種可以降解的對(duì)環(huán)境友好的溶劑，世界產(chǎn)量超過(guò)17 000 000 t，目前的乙酸乙酯以化石燃料為材料通過(guò)化學(xué)法合成，而通過(guò)微生物利用可再生原材料進(jìn)行合成是一個(gè)不錯(cuò)的替代方法。有一系列采用馬克斯克魯維酵母利用廢乳清為材料生產(chǎn)乙酸乙酯的報(bào)道，中試規(guī)模的生長(zhǎng)顯示得率可達(dá)0.265 g/g, 生產(chǎn)速率可達(dá) 2 g/L·h[31]，但產(chǎn)量都不太高，仍需進(jìn)一步改進(jìn)提高。

3 基因工程改造的馬克斯克魯維酵母在微生物細(xì)胞工廠上的應(yīng)用

雖然馬克斯克魯維酵母具有很多優(yōu)秀品質(zhì)，但是在抗逆方面與在工業(yè)上廣泛利用的釀酒酵母相比還有一定差距。另外，雖然馬克斯克魯維酵母能夠利用很多釀酒酵母不能利用的木糖等五碳糖，但是葡萄糖抑制效應(yīng)同時(shí)存在，影響混合糖的利用效率。最后，提高馬克斯克魯維酵母對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)效率，以及通過(guò)合成生物學(xué)方法使該酵母能夠生產(chǎn)原本不能合成的產(chǎn)品，也需要對(duì)馬克斯克魯維酵母進(jìn)行基因工程改造，設(shè)計(jì)和搭建新的代謝路徑。

3.1 基因操作方法

對(duì)微生物進(jìn)行基因工程操作，需要具有選擇標(biāo)簽的宿主、和選擇標(biāo)簽配套的質(zhì)粒系統(tǒng)、能夠表達(dá)異源蛋白的啟動(dòng)子和終止子、外源基因DNA(質(zhì)粒)的轉(zhuǎn)化方法及基因敲除方法等一系列條件和技術(shù)。

3.1.1 宿主

對(duì)微生物進(jìn)行基因工程改造必須有合適的選擇標(biāo)簽，以便對(duì)基因敲除或過(guò)表達(dá)等修飾改造后的菌株進(jìn)行篩選。真核生物中常用的選擇標(biāo)簽包括抗生素的抗性標(biāo)簽和營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)簽。

在馬克斯克魯維酵母中已證明可使用的抗生素的抗性標(biāo)簽有G418[1，32]，博來(lái)霉素(bleomycin)等抗性標(biāo)簽[3]。由于這類抗性標(biāo)簽不需要對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行改造，可以直接使用，有很大的便利性，但是如果采用的是游離質(zhì)粒系統(tǒng)，在無(wú)抗生素培養(yǎng)基中容易丟失，而且在食品和醫(yī)藥相關(guān)的產(chǎn)品生產(chǎn)中要盡量避免在培養(yǎng)基中添加抗生素，因此，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的使用會(huì)更為廣泛。

馬克斯克魯維酵母中已經(jīng)使用的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)簽和釀酒酵母類似，主要是TRP1、LEU2、URA3等標(biāo)簽[32]。要使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)簽篩選，培養(yǎng)基中就不能含有對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如對(duì)應(yīng)TRP1、LEU2、URA3營(yíng)養(yǎng)缺陷型，培養(yǎng)基中不能含有色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶才能夠?qū)D(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。目前已報(bào)道的菌株，以URA3的標(biāo)簽為主，這是因?yàn)橹挥蠻RA3敲除或無(wú)功能突變體才能在含有5-氟乳清酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[32-33]。此外，對(duì)于一個(gè)菌株，同時(shí)能用的選擇標(biāo)簽越多，就意味著能夠?qū)氲耐庠椿蚓驮蕉?，這對(duì)在構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠時(shí)設(shè)計(jì)和重構(gòu)代謝路徑過(guò)程中要進(jìn)行的多個(gè)基因敲除和表達(dá)尤為方便。

3.1.2 質(zhì)粒系統(tǒng)

和釀酒酵母類似，馬克斯克魯維酵母中的質(zhì)粒也分游離質(zhì)粒和整合型質(zhì)粒兩大類，而且為了方便質(zhì)粒的構(gòu)建和擴(kuò)增，一般都是大腸桿菌和馬克斯克魯維酵母的穿梭載體。

整合型質(zhì)粒比較簡(jiǎn)單，只需要有一個(gè)馬克斯克魯維酵母中可用的選擇標(biāo)簽即可，一般可以以大腸桿菌的質(zhì)粒為基礎(chǔ)，含有大腸桿菌中自主復(fù)制的元件例如常見(jiàn)的ori，大腸桿菌篩選的標(biāo)記例如氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、博來(lái)霉素抗性基因等。在此基礎(chǔ)上插入與酵母宿主遺傳缺陷型對(duì)應(yīng)的基因例如URA3、LEU2、TRP1等[32]，或者抗性基因例如卡那霉素抗性(對(duì)應(yīng)G418)[1，32]、博來(lái)霉素抗性基因[3]，然后再加上需要轉(zhuǎn)入酵母的DNA片段，例如外源基因的表達(dá)框等?？偟膩?lái)說(shuō)，和釀酒酵母的整合型質(zhì)粒沒(méi)有太大區(qū)別。由于很多釀酒酵母的啟動(dòng)子等元件能夠直接在馬克斯克魯維酵母中執(zhí)行功能，所以很多釀酒酵母中的質(zhì)?？梢宰鳛檎闲唾|(zhì)粒在馬克斯克魯維酵母中使用。

游離型質(zhì)粒是可以在馬克斯克魯維酵母細(xì)胞中的染色體外獨(dú)立存在并自主復(fù)制的質(zhì)粒。這類質(zhì)粒中最重要的元件是使該質(zhì)?？梢元?dú)立存在和復(fù)制的序列。主要有3大類：第一類是衍生于來(lái)自Kluyveromycesdrosophilarum的KD1質(zhì)粒，早期的研究發(fā)現(xiàn)KD1質(zhì)粒也可以在馬克斯克魯維酵母中獨(dú)立存在和復(fù)制，因而以pKD1為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一類馬克斯克魯維酵母的游離質(zhì)粒，例如pKDU7[34]，細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)可達(dá)40。第二類是來(lái)源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的pDblet[35]，也能在馬克斯克魯維酵母中獨(dú)立存在和復(fù)制，但是拷貝數(shù)低。第三類游離型質(zhì)粒主要是包含來(lái)自染色體自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequence，ARS)和著絲粒序列。其中最小的ARS僅60 bp即可使得質(zhì)粒能夠以游離質(zhì)粒存在[36]。在馬克斯克魯維酵母中包含ARS和中心粒的質(zhì)粒，拷貝數(shù)比較低(2～4拷貝)[36-38]。

3.1.3 啟動(dòng)子和終止子

要想在酵母中表達(dá)外源基因，構(gòu)建表達(dá)框時(shí)必須有啟動(dòng)子和終止子。

啟動(dòng)子又分為組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子兩大類。常用的組成型啟動(dòng)子包括PPGK、PTDH3、PADH2、PTEF1等啟動(dòng)子[39-40]，雖然表達(dá)基因的能力有強(qiáng)弱區(qū)別，但主要是一些維持細(xì)胞正常代謝所需基因的啟動(dòng)子，受培養(yǎng)條件的影響較小，或者雖然受培養(yǎng)條件影響，但不會(huì)引起非常劇烈的表達(dá)水平的改變。隨著越來(lái)越多的科研人員對(duì)馬克斯克魯維酵母的重視，對(duì)馬克斯克魯維酵母中啟動(dòng)子的強(qiáng)度進(jìn)行了評(píng)測(cè)。我們以β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶基因的表達(dá)為指標(biāo)，對(duì)系列組成型啟動(dòng)子進(jìn)行了測(cè)試，證實(shí)測(cè)試的啟動(dòng)子強(qiáng)度順序?yàn)镻KmPGK>PKmTDH3>PScPGK>PScTDH3>PKmADH1>PScADH1[39]，而Lee研究組則采用綠色熒光蛋白的表達(dá)測(cè)試了來(lái)自釀酒酵母的組成型啟動(dòng)子在馬克斯克魯維酵母中的表現(xiàn)，結(jié)果顯示PGPD>PADH≈PTEF>>PCYC[33]。Rajkumar等對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行了進(jìn)一步的系統(tǒng)研究，確定PKmTDH3、PScTDH3、PENO1、PFBA1和PPGK1啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子，PTDH1和PHHF1為中等強(qiáng)度啟動(dòng)子，PREV1和PGDH2為弱啟動(dòng)子[1]。

另一類啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。目前在馬克斯克魯維酵母中主要是糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。由于此酵母具有較強(qiáng)的乳糖利用能力，其自身的β-半乳糖苷酶LAC4基因的啟動(dòng)子和釀酒酵母GAL1基因的啟動(dòng)子可以在該酵母中通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)控，在以乳糖或半乳糖為碳源時(shí)，控制的基因表達(dá)水平可以上調(diào)6～15倍[1]。另外，由于馬克斯克魯維酵母天然地高效利用木糖，利用木糖的關(guān)鍵基因木糖還原酶、木糖醇脫氫酶等基因的啟動(dòng)子，也是潛在的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子[41]。很多馬克斯克魯維酵母菌株能天然地生產(chǎn)大量的菊糖酶，菊糖酶的啟動(dòng)子PINU1很早就被確定是個(gè)強(qiáng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，早在1993年，為了驗(yàn)證菊糖酶啟動(dòng)子的效率，將一個(gè)來(lái)源于瓜爾豆的α-半乳糖苷酶在菊糖酶的啟動(dòng)子控制下高效表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)153 mg/L[42]。由于菊糖啟動(dòng)子表達(dá)外源基因的重復(fù)性不好，雖然有一些測(cè)試性地表達(dá)外源基因的報(bào)道，但一直沒(méi)有廣泛應(yīng)用，直至最近，呂紅研究組對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了外源蛋白基因高表達(dá)的質(zhì)粒系統(tǒng)[43-44]。由于馬克斯克魯維酵母是耐熱酵母，所以有些基因的表達(dá)受溫度影響比較大，例如HAP60、HAP104、TSA1以及SSA2等基因啟動(dòng)子隨溫度上升表達(dá)水平也上升[1]。另一個(gè)負(fù)調(diào)控的啟動(dòng)子Tet-off通過(guò)控制β-葡萄糖醛酸酶的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)試，可以通過(guò)添加四環(huán)素關(guān)閉所控制的基因的表達(dá)[45]。

在酵母中表達(dá)外源基因時(shí)對(duì)終止子的關(guān)注較少，但是終止子也會(huì)影響基因的表達(dá)。我們?cè)谘芯狂R克斯克魯維酵母中啟動(dòng)子強(qiáng)度時(shí)，為了避免終止子影響表達(dá)，統(tǒng)一采用了TDH3基因的終止子(TTDH3)[39]，其他常用的終止子包括菊糖酶基因的終止子(TINUI)[44,46]、LAC4、PGK、ADH、TEF等基因的終止子[1，3，47-49]。在相同的啟動(dòng)子控制下，使用不同的終止子的表達(dá)強(qiáng)度會(huì)不同，趨勢(shì)為T(mén)PGK>TPDC>TADH1>TINU1>TLAC4[1]，但是啟動(dòng)子的作用更大一些，即使表達(dá)量低一些的終止子和強(qiáng)啟動(dòng)子組合，外源蛋白的表達(dá)也會(huì)大幅度上升。

3.1.4 基因敲除和Crispr-cas9

在馬克斯克魯維酵母中進(jìn)行基因敲除有兩種策略。第一個(gè)策略是采用同源臂構(gòu)建敲除框，在酵母細(xì)胞中通過(guò)同源重組，與染色體上的對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行替換，將基因組中的對(duì)應(yīng)基因置換成破壞或部分刪除的基因(敲除框)，達(dá)到基因敲除的目的[32,40]。這個(gè)方法和釀酒酵母中的方法類似，但是由于馬克斯克魯維酵母中外源基因DNA插入染色體DNA時(shí)以非同源重組為主，導(dǎo)致依賴同源臂重組的基因敲除效率要低很多，而且同源臂要求比較長(zhǎng)，一般500 bp以上。在敲除中用于構(gòu)建敲除框和基因敲除菌株的選擇標(biāo)簽一般用卡那霉素抗性或URA3居多[32]。采用卡那霉素抗性基因結(jié)合培養(yǎng)基中添加G418進(jìn)行篩選，可以直接對(duì)野生型菌株進(jìn)行敲除，比較方便；而采用URA3作為篩選標(biāo)簽，需要事先構(gòu)建URA3的敲除菌株或者失活突變菌株(營(yíng)養(yǎng)缺陷型)。但是由于URA3營(yíng)養(yǎng)缺陷型很容易在添加5-氟乳清酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，實(shí)際上使用時(shí)并不麻煩，并且正因?yàn)橛?-氟乳清酸的負(fù)篩選存在，很方便循環(huán)使用URA3標(biāo)簽。

在多個(gè)基因敲除時(shí)，需要對(duì)篩選標(biāo)簽進(jìn)行循環(huán)刪除，也就是敲除第一個(gè)基因后，將選擇標(biāo)簽進(jìn)行刪除，可以再次利用URA3構(gòu)建下一個(gè)基因的敲除框。除了直接對(duì)轉(zhuǎn)入的標(biāo)簽進(jìn)行再敲除外，還有兩個(gè)常用的便利策略，即hisG系統(tǒng)[32]和Cre-loxP系統(tǒng)[50]。本文作者采用hisG系統(tǒng)對(duì)K.marxianusNBRC 1777進(jìn)行了多重敲除，獲得了TRP1、LEU2、URA3三重營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株[32]，而Ribeiro等通過(guò)Cre-loxP系統(tǒng)對(duì)馬克斯克魯維酵母中的兩份β-半乳糖酶基因LAC4成功進(jìn)行了敲除[50]。

hisG系統(tǒng)僅包括兩端相同的來(lái)自沙門(mén)氏菌的hisG序列，在構(gòu)建敲除框時(shí)，該序列鏈接在選擇標(biāo)簽例如URA3基因序列的兩端，同源臂序列的內(nèi)側(cè)即可。此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是兩個(gè)hisG序列能夠自發(fā)的重組，刪除其中的選擇標(biāo)簽基因，不需要額外標(biāo)簽去除步驟，所以只需將敲除菌株稀釋涂布到平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選少量菌株鑒定是否丟失了選擇標(biāo)簽即可，操作簡(jiǎn)單方便；缺點(diǎn)是hisG長(zhǎng)達(dá)1 kb，構(gòu)建敲除框比較麻煩，而且由于自發(fā)重組的頻率高，導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定，有時(shí)構(gòu)建敲除框難度大。

Cre-LoxP系統(tǒng)由一個(gè)識(shí)別LoxP位點(diǎn)的重組酶Cre和34 bp的保守的loxP位點(diǎn)組成[50]。Cre-loxP系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是LoxP序列很短，在構(gòu)建敲除框時(shí)可以通過(guò)PCR直接引入，簡(jiǎn)單快捷，缺點(diǎn)是通常需要另一份表達(dá)Cre的質(zhì)粒，會(huì)占用一個(gè)選擇標(biāo)簽，有時(shí)還需要通過(guò)無(wú)選擇壓力的培養(yǎng)，去除Cre質(zhì)粒。

隨著Crispr-cas9技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)也被用于馬克斯克魯維酵母系統(tǒng)之中[40，51-55]。這個(gè)系統(tǒng)有通過(guò)ARS/CEN[51-53]、pKD1[55]或pDblet[40]為基礎(chǔ)構(gòu)建的游離質(zhì)粒系統(tǒng)，也有將Cas9整合到基因組中的[54]。而控制gRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和釀酒酵母類似，主要是SNR52啟動(dòng)子[51-52,54]、苯丙氨酸或甘氨酸t(yī)RNA啟動(dòng)子[51,53]。Lobs等測(cè)試了各種RNA聚合酶III的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄gRNA后的敲除效率，以木糖醇脫氫酶基因(XYL2)敲除為例，發(fā)現(xiàn)RPR1-tRNAGly 雜合啟動(dòng)子效率最高，敲除效率達(dá)66%；甘氨酸的tRNA啟動(dòng)子控制的gRNA，敲除效率也不錯(cuò)，可達(dá)52%；而常用的SNR52啟動(dòng)子控制下敲除效率僅有10%[51]。在采用游離質(zhì)粒的Crispr-Cas9系統(tǒng)中，Cas9的表達(dá)和gRNA的轉(zhuǎn)錄元件通常會(huì)放在同一個(gè)質(zhì)粒中轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。這樣可以減少轉(zhuǎn)化過(guò)程，提高效率，也方便敲除后Cas9基因的去除和更換gRNA，這對(duì)減少脫靶以及多重敲除有很大幫助。

3.2 重組表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白的微生物細(xì)胞工廠

這部分外源蛋白的生產(chǎn)是指以獲得大量重組蛋白為目的的研究。在馬克斯克魯維酵母的遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程中，尤其是啟動(dòng)子和表達(dá)條件等研究中，表達(dá)的一些β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、熒光蛋白等基因，目的是驗(yàn)證表達(dá)系統(tǒng)效率，不是獲得外源蛋白；而代謝工程改造方面也需要表達(dá)外源基因，但是目的不是外源蛋白，而是其他目標(biāo)產(chǎn)品，因此不歸在此類。

由于馬克斯克魯維酵母的表達(dá)系統(tǒng)研究較少，所以與巴斯德畢赤酵母等其他菌株相比較，以獲取外源蛋白為目的的研究報(bào)道也比較少。雖然有大量的啟動(dòng)子可以使用，但是以外源蛋白的高表達(dá)為目標(biāo)時(shí)，一般采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子將菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)適當(dāng)?shù)胤蛛x，有利于獲得更高濃度的產(chǎn)品。

馬克斯克魯維酵母中將乳清克魯維酵母來(lái)源的超氧歧化酶在乳清酵母的ADH4啟動(dòng)子控制下進(jìn)行了表達(dá)，產(chǎn)量達(dá) 24.1 kU/L[56]，通過(guò)菊糖酶啟動(dòng)子對(duì)嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)的酯酶進(jìn)行表達(dá)的產(chǎn)量達(dá)56.9 U/g 細(xì)胞干重[49]。而通過(guò)敲除MIG1基因解除葡萄糖抑制效應(yīng)可以使β-半乳糖苷酶產(chǎn)量提高到121.0 U/mL[57]。對(duì)菊糖酶啟動(dòng)子和分泌的信號(hào)肽進(jìn)行的研究中，成功地對(duì)幾種纖維素水解相關(guān)的酶進(jìn)行了高效表達(dá)(表3)，該系統(tǒng)還成功地表達(dá)了豬圓環(huán)病毒顆粒，產(chǎn)量達(dá)到了1.91 g/L的水平[43]。雖然有很多馬克斯克魯維酵母天然地高效表達(dá)菊糖酶，但是在工業(yè)生產(chǎn)中，酶制劑的成本越低越好，也就要求更高的產(chǎn)量，因此重組表達(dá)是一個(gè)重要的策略。 Zhou等在K.marxianusKM-526菌株中成功實(shí)現(xiàn)了菊糖酶重組表達(dá)，產(chǎn)量達(dá)133.5 U/mL[58]。之后，Zhang等構(gòu)建了K.marxianusKM-KN16菌株，通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子、優(yōu)化菊糖酶基因密碼子和采用高密度培養(yǎng)，菊糖酶產(chǎn)量高達(dá)896.1 U/mL[59](表3)?？偟膩?lái)看，馬克斯克魯維酵母以外源蛋白表達(dá)為目的的研究不多，但是，由于馬克斯克魯維酵母具有快速增殖能力和高密度培養(yǎng)能力(OD600最高可超過(guò)700)，在大量表達(dá)外源蛋白上應(yīng)該很有前景。

表 3 馬克斯克魯維酵母中重組蛋白的表達(dá)

3.3 通過(guò)基因工程改造構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠

通過(guò)基因工程手段和合成生物學(xué)理念為基礎(chǔ)的改造，可以提高馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)能力，還能夠使馬克斯克魯維酵母獲得新的產(chǎn)品生產(chǎn)能力，因此有了不少通過(guò)基因工程改造構(gòu)建的微生物細(xì)胞工廠的報(bào)道。

3.3.1 生產(chǎn)乙醇

雖然野生型馬克斯克魯維酵母也用于乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，但是為了進(jìn)一步提高馬克斯克魯維酵母的乙醇生產(chǎn)能力，對(duì)各種底物的利用能力以及抗逆特性進(jìn)行了基因工程改造。

Yuan等通過(guò)在馬克斯克魯維酵母中表達(dá)菊糖酶基因，將利用菊糖生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量和速率，分別從93.7 g/L 和 1.12 g/L·h提高到96.2 g/L和 1.34 g/L·h, 利用菊芋生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量和速率從62 g/L 和 1.29 g/L·h提高到 69 g/L 和 1.44 g/L·h[60]。我們通過(guò)在馬克斯克魯維酵母中表達(dá)淀粉酶，實(shí)現(xiàn)了在42 ℃不添加淀粉酶的情況下利用生淀粉生產(chǎn)乙醇，產(chǎn)量達(dá)79.75 g/L[61]。

木糖是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解液中主要的可發(fā)酵單糖之一，雖然馬克斯克魯維酵母能利用木糖，但是由于其木糖代謝路徑中木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的輔酶偏好性不同，導(dǎo)致氧氣受限制時(shí)馬克斯克魯維酵母利用木糖的能力不足。為了提高馬克斯克魯維酵母利用木糖發(fā)酵的能力，既可以將其中的氧化還原路徑替換成木糖異構(gòu)酶路徑，避免對(duì)輔酶的依賴，也可以將木糖還原酶和木糖醇脫氫酶換成輔酶兼容的組合，避免氧氣受限制的發(fā)酵條件下輔酶的不平衡問(wèn)題。我們?cè)贙.marxianusYRL005中成功表達(dá)了木糖異構(gòu)酶基因，該菌株在42 ℃消耗20 g/L的木糖，產(chǎn)生8.25 g/L乙醇，沒(méi)有木糖醇積累[62]。不過(guò)在酵母中高效表達(dá)木糖異構(gòu)酶一直是一個(gè)難題，因此這方面成功的例子較少，而且表達(dá)效率距離工業(yè)生產(chǎn)要求還很遠(yuǎn)。改造木糖的氧化還原路徑的研究比較多一些。我們通過(guò)將K.marxianusYHJ010的木糖還原酶基因替換成各種突變體，使乙醇產(chǎn)量提高了12.24倍，而Goshima等通過(guò)重組表達(dá)樹(shù)干畢赤酵母的木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和釀酒酵母的木酮糖激酶使得獲得的菌株能夠在42 ℃利用木糖生產(chǎn)4.9 g/L的乙醇[63]。隨后的進(jìn)一步研究中，我們將木糖還原酶替換成脈孢霉的木糖還原酶，同時(shí)與木糖醇脫氫酶的突變體進(jìn)行各種組合的篩選，對(duì)下游磷酸戊糖途徑進(jìn)行強(qiáng)化，獲得的YZJ088菌株在42 ℃利用118.39 g/L木糖，生產(chǎn) 44.95 g/L乙醇，生產(chǎn)速率達(dá)2.49 g/L·h，該菌株還能夠利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵生產(chǎn)51.43 g/L乙醇[64]，被認(rèn)為是利用五碳糖發(fā)酵最好的馬克斯克魯維酵母，生產(chǎn)速率已經(jīng)和已知的最好的釀酒酵母工程菌株相匹敵[65]。Suzuki等把馬克斯克魯維酵母中的XDH替換成偏好于使用輔酶NADP+，在40 ℃利用木糖生產(chǎn)乙醇的得率提高到了0.402 g/g[66]。

而利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇除了前文提到過(guò)的同步糖化和(共)發(fā)酵(SSF)外，還有一個(gè)聯(lián)合生物加工(CBP)策略，該策略的終極目標(biāo)是把纖維素酶的生產(chǎn)和利用糖的發(fā)酵整合在同一菌株中，避免添加纖維素酶，大幅度降低成本。 聯(lián)合生物加工策略被認(rèn)為是更有前景的方法，但是由于纖維素酶表達(dá)的困難，這個(gè)策略挑戰(zhàn)也更大。我們?cè)贙.marxianusYHJ029中表達(dá)了耐熱的β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切-1，4-葡聚糖苷酶和纖維二糖水解酶，實(shí)現(xiàn)了在45 ℃不添加纖維素酶的前提下利用纖維二糖產(chǎn)43.3 g/L 乙醇，或者利用羧甲基纖維素為碳源生長(zhǎng)[32]。而另一個(gè)研究報(bào)道了表面展示內(nèi)切葡萄糖苷酶和β-葡聚糖苷酶的KΔU/AGEGII-AGBGL菌株實(shí)現(xiàn)了無(wú)外加纖維素酶條件下，在48 ℃利用β-葡聚糖生產(chǎn)乙醇[67]。而表達(dá)了8種不同纖維素酶的KR9菌株有了不錯(cuò)的纖維素酶活性，可以大幅度降低額外補(bǔ)充的纖維素酶量，距離成功又前進(jìn)了一步[48]。

3.3.2 生產(chǎn)乳酸

乳酸在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及食品上有很大的需求，而可降解塑料更是要求高光學(xué)純度(optical purity)的乳酸。生物合成乳酸可以容易獲得高光學(xué)純度的乳酸，而且在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域相對(duì)化學(xué)法合成的乳酸有更好的生物安全性。Bae 等通過(guò)敲除馬克斯克魯維酵母中的丙酮酸脫羧酶(PDC1)基因和過(guò)表達(dá)L或D-乳酸脫氫酶基因獲得了直接利用菊芋生產(chǎn)乳酸的菌株，生產(chǎn)L-乳酸和D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)130 g/L和122 g/L, 光學(xué)純度超過(guò)99%。但是這樣的結(jié)果是在很大的接種量下實(shí)現(xiàn)的(OD600=25)，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，而且發(fā)酵溫度較低(35 ℃)[68]。而我們?cè)谕瑫r(shí)利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)丙酮酸的基礎(chǔ)上[69]，通過(guò)篩選和表達(dá)高效的L-乳酸脫氫酶，同樣實(shí)現(xiàn)了直接利用菊芋生產(chǎn)L-乳酸，在低接種量(OD600=1.0)，42 ℃條件下，產(chǎn)量達(dá)125.93 g/L。 同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)利用堿處理的玉米芯生產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)量達(dá)103.00 g/L，光學(xué)純度99.5%，是第一個(gè)報(bào)道的利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸的酵母菌株[40]。

3.3.3 生產(chǎn)果糖糖漿

盡管馬克斯克魯維酵母能夠大量表達(dá)菊糖酶，但是由于馬克斯克魯維酵母本身有強(qiáng)大的葡萄糖和果糖利用能力，生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)消耗大量的葡萄糖和果糖，因此在利用菊芋等材料制備高果糖漿的時(shí)候，采用的是菊糖酶的酶制劑。如果消除馬克斯克魯維酵母利用果糖的能力，即可獲得直接降解菊糖和利用葡萄糖的菌株，用于生產(chǎn)含葡萄糖極低的果糖糖漿。我們通過(guò)敲除K.marxianusYHJ010的己糖激酶(HXK1)基因，過(guò)表達(dá)葡萄糖激酶(GLK)基因，消除了該菌株利用果糖的能力，使得該菌株可以在42 ℃，利用未滅菌菊芋，在不添加額外營(yíng)養(yǎng)的條件下高效生產(chǎn)果糖糖漿，最高產(chǎn)量和最大生產(chǎn)速率分別為 234.44 g/L 和 10.26 g/L·h[70]。這個(gè)策略避免了制備酶制劑的步驟，使成本進(jìn)一步降低。

3.3.4 生產(chǎn)木糖醇

雖然有不少將木糖通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究，但是生物質(zhì)乙醇的主要目標(biāo)燃料乙醇的成本壓力很大，而木糖醇作為一種重要的甜味劑，在藥品、保健品、食品和飲料工業(yè)中廣泛使用。此外，木糖醇的價(jià)格比乙醇要高得多，生產(chǎn)木糖醇也使企業(yè)更容易生存和發(fā)展。預(yù)計(jì)2020年全球木糖醇需求達(dá)250 000 t[71]，目前的生產(chǎn)木糖醇的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法需要高溫高壓和金屬催化劑，而且需要高純木糖，成本相對(duì)較高，污染相對(duì)較大，因此通過(guò)生物法將木糖轉(zhuǎn)化成木糖醇的研究也一直在進(jìn)行中。雖然有些假絲酵母有較好的木糖醇生產(chǎn)能力，但是致病性導(dǎo)致這些酵母的應(yīng)用受到一定的影響，而生物安全的馬克斯克魯維酵母在這方面很有優(yōu)勢(shì)。在馬克斯克魯維酵母中構(gòu)建生產(chǎn)木糖醇的酵母有兩個(gè)途徑，既可以通過(guò)過(guò)表達(dá)木糖還原酶，促使木糖醇積累，也可以敲除木糖醇脫氫酶基因，避免木糖醇代謝，使木糖醇積累。為了進(jìn)一步提高效率，還可以將兩者結(jié)合起來(lái)。我們構(gòu)建的過(guò)表達(dá)脈孢霉的木糖還原酶的菌株YZJ015，在42 ℃生產(chǎn)木糖醇產(chǎn)量達(dá)132.31 g/L，循環(huán)使用酵母細(xì)胞發(fā)酵時(shí)，生產(chǎn)速率達(dá)4.41 g/L·h；而以木糖醇脫氫酶基因敲除菌株為平臺(tái)構(gòu)建的菌株，以甘油為輔助底物，生產(chǎn)木糖醇的得率接近100%[72]。在此基礎(chǔ)上通過(guò)過(guò)表達(dá)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使生產(chǎn)速率進(jìn)一步提高，分批發(fā)酵的生產(chǎn)速度達(dá)到4.14 g/L·h, 通過(guò)補(bǔ)料，木糖醇產(chǎn)量達(dá)到了312.05 g/L[73], 為報(bào)道的最高產(chǎn)量，而且添加的木糖無(wú)需滅菌。其后，我們?cè)谇贸禾羌っ富蚝瓦^(guò)表達(dá)葡萄糖激酶的基礎(chǔ)上通過(guò)過(guò)表達(dá)木糖還原酶和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，成功地避免了葡萄糖對(duì)木糖代謝的抑制，構(gòu)建的菌株YHY013利用玉米芯水解液和木糖母液，木糖醇產(chǎn)量分別為118.63 g/L 和101.75 g/L[41]。還有一些其他的馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)木糖醇的研究，但產(chǎn)量較低，基本是代謝機(jī)制方面的探索[74-77]。

3.3.5 其他產(chǎn)品

由于馬克斯克魯維酵母有很高的生長(zhǎng)速度，還可以進(jìn)行高密度培養(yǎng)，因此對(duì)一些和菌體相關(guān)的產(chǎn)品的生長(zhǎng)有特別的優(yōu)勢(shì)。蝦青素是一種脂溶性色素，有很強(qiáng)的抗氧化能力，由于其脂溶性，蝦青素一般不分泌到培養(yǎng)基中，而是在細(xì)胞的膜系統(tǒng)上，因此高濃度的菌體可以提高產(chǎn)量。在K.marxianusS3-2 菌株中引入蝦青素的合成路徑之后，通過(guò)調(diào)整基因拷貝數(shù)和選用合適的酶的突變體，使蝦青素的產(chǎn)量達(dá)到了9972 μg/g 細(xì)胞干重[47]。

在生產(chǎn)苯乙醇研究中，雖然龍舌蘭、乳清等材料也用于生產(chǎn)[78-79]，但實(shí)際上這些材料主要是提供碳源供馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，而真正用于苯乙醇生產(chǎn)的仍然是L-苯丙氨酸。由于苯丙氨酸成本相對(duì)較高，利用葡萄糖等廉價(jià)的底物直接生產(chǎn)苯乙醇在將來(lái)可能更有潛力。Kim等成功地通過(guò)表達(dá)苯丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶兩個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)了利用葡萄糖培養(yǎng)，無(wú)需添加L-苯丙氨酸生產(chǎn)苯乙醇，產(chǎn)量達(dá)1.3 g/L[80]。

4 馬克斯克魯維酵母作為構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的平臺(tái)，目前存在的問(wèn)題

4.1 木糖和葡萄糖的共利用

馬克斯克魯維酵母最顯著的優(yōu)點(diǎn)是耐熱性，可在較高溫度下發(fā)酵，并且能利用木糖、半乳糖和阿拉伯糖，而商業(yè)化的纖維素酶的最適溫度在48 ℃左右，因此最有潛力的應(yīng)用是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的同步糖化與發(fā)酵，但是由于葡萄糖的存在，其他碳源的利用會(huì)被抑制，尤其是木糖的利用同樣被抑制，導(dǎo)致對(duì)木糖利用效率的下降。因此，研究和解決葡萄糖與木糖的共利用問(wèn)題，可以促進(jìn)馬克斯克魯維酵母作為微生物細(xì)胞工廠的發(fā)展。目前為止對(duì)馬克斯克魯維酵母中葡萄糖抑制效應(yīng)研究的并不多，有一些報(bào)道對(duì)半乳糖、棉籽糖、蔗糖及甘油等利用的抑制和釀酒酵母類似，主要是通過(guò)HXK→SNF1→MIG1的途徑[41,81]，但是馬克斯克魯維酵母中對(duì)木糖的抑制卻與對(duì)其他糖的抑制不同，不是通過(guò)經(jīng)典的MIG1路徑[35]，具體的路徑還在探索之中。我們?cè)诖搜芯炕A(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了葡萄糖存在時(shí)利用木糖高效生產(chǎn)木糖醇。由于葡萄糖和木糖共用轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此葡萄糖對(duì)木糖的抑制還體現(xiàn)在糖的轉(zhuǎn)運(yùn)階段，當(dāng)木糖的代謝路徑中各個(gè)代謝步驟的酶由組成型啟動(dòng)子控制，使酵母菌株能夠高效利用木糖時(shí)，仍然會(huì)受到葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)性抑制[64]。我們研究組在利用馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)木糖醇的研究中通過(guò)過(guò)表達(dá)木糖特異的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ScGAL2-N376F部分解決了這個(gè)問(wèn)題[3，41,69]。 但是由于在馬克斯克魯維酵母中葡萄糖對(duì)木糖利用抑制的機(jī)理研究還不夠明確，徹底解決這個(gè)問(wèn)題還需繼續(xù)努力。

4.2抗逆性

要構(gòu)建高效的微生物細(xì)胞工廠，使用的酵母細(xì)胞要有很好的抗逆性，這包括對(duì)高濃度底物和產(chǎn)物的耐受、對(duì)原材料中抑制物的耐受和對(duì)高溫的耐受等。雖然機(jī)理還不是很清楚，馬克斯克魯維酵母具有不錯(cuò)的耐熱特性，但是該酵母在其他方面的抗逆性上還需要進(jìn)一步提高。

在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化中，最吸引人的是利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為原料生產(chǎn)各種產(chǎn)品，但是由于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得酶很難快速將其水解從而釋放出可發(fā)酵的糖，打開(kāi)木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)致密結(jié)構(gòu)的前處理是不可避免的，而前處理過(guò)程中由于劇烈的物理化學(xué)條件會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的降解，其中六碳糖和五碳糖的破壞以及木素的降解和釋放會(huì)產(chǎn)生弱酸、糠醛和酚類等抑制微生物生長(zhǎng)與發(fā)酵的物質(zhì)[82]。馬克斯克魯維酵母中對(duì)這些抑制物的耐受的研究比較少。雖然在其他酵母中對(duì)這些抑制物的耐受機(jī)制有一定的研究，主要是通過(guò)將抑制物降解、轉(zhuǎn)化成低毒物質(zhì)和排出細(xì)胞外幾個(gè)途徑，在馬克斯克魯維酵母中可能有類似的機(jī)理。我們的轉(zhuǎn)錄組研究顯示馬克斯克魯維酵母在抑制物存在時(shí)，NAD+的合成和NAD(P)H合成的相關(guān)基因的表達(dá)上升，但是實(shí)際上由于對(duì)抑制物的耐受消耗還原型輔酶，導(dǎo)致NAD(P)H/NAD(P)+比例下降[83]。但是這些途徑是如何實(shí)現(xiàn)的仍然很不清楚。Oliva等對(duì)單種抑制物和多種抑制物對(duì)馬克斯克魯維酵母生長(zhǎng)與發(fā)酵的研究表明，馬克斯克魯維酵母對(duì)單種抑制物有較好的耐受性，而對(duì)于多種抑制物的耐受急劇下降[84]。我們的研究也表明馬克斯克魯維酵母對(duì)稀酸處理的玉米芯中的抑制物有一定耐受性，而且能夠快速降解糠醛類抑制物[3,41]。但是K.marxianu中細(xì)胞是如何對(duì)抑制物做出反應(yīng)及實(shí)現(xiàn)耐受的還不清楚。

高濃度的底物，尤其是可溶性糖類會(huì)導(dǎo)致高滲透壓而抑制微生物生長(zhǎng)發(fā)酵。馬克斯克魯維酵母中的HOG1被證實(shí)是酵母細(xì)胞對(duì)乳酸及滲透壓的耐受的關(guān)鍵蛋白[85]，但其他方面的研究還很少。

高濃度產(chǎn)物也會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)發(fā)酵產(chǎn)生抑制，目前的研究主要集中在乙醇對(duì)馬克斯克魯維酵母的影響。通過(guò)采用TATA結(jié)合蛋白SPT15突變體的全局轉(zhuǎn)錄工程(Global transcription machinery engineering，gTME)篩選到了對(duì)乙醇耐受和生產(chǎn)提升的突變體，但是耐受機(jī)理不明確[86]。Alvim等通過(guò)蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在高濃度乙醇存在時(shí)，胞內(nèi)海藻糖濃度上升，氧化應(yīng)激反應(yīng)上升[87]，而為了中和過(guò)多的活性氧NAD(P)H的生產(chǎn)也進(jìn)一步提高[88]。

5 總結(jié)

馬克斯克魯維酵母作為一個(gè)生物安全的酵母菌株，具有耐熱、快速增殖和利用廣泛的碳源等特點(diǎn)，在構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠上有很多優(yōu)勢(shì)。例如其快速增殖能力和利用菊糖的能力在生產(chǎn)菊糖酶和利用菊糖方面有不少成果，而其高密度培養(yǎng)的能力以及強(qiáng)大的菊糖酶基因啟動(dòng)子在表達(dá)外源蛋白方面也逐漸得到應(yīng)用，其利用木糖的能力和耐熱的特點(diǎn)在利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)各種產(chǎn)品上的優(yōu)勢(shì)也逐漸體現(xiàn)，而高溫發(fā)酵也可減少污染風(fēng)險(xiǎn)，為補(bǔ)料帶來(lái)方便。但是馬克斯克魯維酵母在工業(yè)上利用時(shí)間短，遺傳信息研究不夠充分，在乙醇耐受、抑制物耐受上還有所欠缺。為了將來(lái)更好地在工業(yè)生產(chǎn)上使用，葡萄糖和木糖等碳源的共利用、產(chǎn)物耐受及抑制物耐受是構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。