干燥溫度及生長(zhǎng)年限對(duì)黔產(chǎn)青錢柳質(zhì)量的影響

王 維， 葉世蕓， 殷少文， 鄭立肯

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽(yáng) 550000)

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja]系胡桃科青錢柳屬，是我國(guó)特有的高大速生闊葉多用途喬木[1]，于冰川世紀(jì)保存至今，是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一。據(jù)《中國(guó)中藥資源志要》記載，其葉具有清熱解毒、止痛、治療頑癬等功能[2]，其根、莖、枝均可入藥。青錢柳目前以保健茶的形式出現(xiàn)在大眾視野中。青錢柳茶是以初春嫩葉為原料，經(jīng)過炒制而成的[3]。茶飲氣清香、色澤呈紅棕色、味甘甜，具有生津止渴、清熱解暑的功效，特別適宜現(xiàn)代“三高”類慢性疾病人群飲用[4]。雖然青錢柳葉一直被當(dāng)作茶來(lái)飲用，但青錢柳并不屬于普通食品范疇，到2013年青錢柳葉被正式批準(zhǔn)為新食品原料，可以作為普通食品食用，因此有關(guān)青錢柳茶的基礎(chǔ)性研究也需隨之加強(qiáng)。

現(xiàn)代研究表明，從青錢柳中已分離獲得的成分主要有多糖類、三萜類、黃酮類、酚酸類和無(wú)機(jī)元素類等[5]。青錢柳多糖具有降血脂[6-7]、降血糖[8]、降血壓[9]、免疫調(diào)節(jié)[10-12]等作用。青錢柳中總?cè)芠13-14]包括熊果酸、齊墩果酸、科羅素酸等，具有減輕β胰島細(xì)胞的損傷和抑制其凋亡[15]、促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗、調(diào)節(jié)酪氨酸蛋白的磷酸化平衡[16-19]等作用。青錢柳黃酮類化合物具有抗氧化、增強(qiáng)心血管的作用，能降低“三高”發(fā)病率[20-21]等。由此可見，青錢柳的保健功能是有效物質(zhì)群多靶點(diǎn)的共同作用結(jié)果。

本研究同時(shí)測(cè)定樣品中的多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰素含量，以確定青錢柳的最佳干燥溫度和適宜的生長(zhǎng)年限，為青錢柳的產(chǎn)業(yè)化種植、產(chǎn)地加工、產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)[22]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，購(gòu)自安捷倫科技(中國(guó))有限公司；Agilent C18柱(規(guī)格：250 mm×4.6 mm，5 μm，型號(hào)PN880975-902)，購(gòu)自北京國(guó)譜科技有限公司；UV-2501PC紫外光譜儀，購(gòu)自日本島津公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，購(gòu)自金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ-100E超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5A低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，購(gòu)自湖南星科科學(xué)儀器有限公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自天津天泰儀器有限公司；XS205電子天平，購(gòu)自瑞士梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司。

槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：20160322)、山柰素對(duì)照品(批號(hào)：20160113)、齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)：20160511)、D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：20151119)，購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司；色譜級(jí)甲醇(批號(hào)：20130410)，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；香草醛(批號(hào)：20150305)，購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司；苯酚(批號(hào)：20150604)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸(批號(hào)：20130101)，購(gòu)自川東化工集團(tuán)。

1.2 試樣來(lái)源和預(yù)處理

樣品采自黔東南苗族侗族自治州劍河縣雷山鎮(zhèn)八萬(wàn)山林場(chǎng)(108.58°E、26.64°N)的不同生長(zhǎng)年限的青錢柳。經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院葉世蕓教授鑒定為胡桃科青錢柳屬青錢柳。葉片除雜后，分別在陰干(25 ℃)及60、70、80、90、100 ℃條件下干燥(其水分含量約為4.0%)，打粉，過60目篩備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖含量測(cè)定方法 通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和全波段掃描，確定樣品多糖含量的測(cè)定方法：稱取適量青錢柳供試品，用石油醚進(jìn)行脫脂處理后，加80%乙醇回流2 h，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇洗滌后抽濾，濾液用Sevage法除蛋白，加入無(wú)水乙醇過夜醇沉，離心。棄上清液，沉淀依次用95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮各洗滌2次，殘?jiān)稍镏梁阗|(zhì)量，即為青錢柳多糖。取青錢柳多糖和D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加蒸餾水分別配制濃度為0.15 mg/mL的青錢柳多糖溶液和1.001 mg/mLD-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取青錢柳試樣2.0 g，精確稱量，置于圓底燒瓶中，加入80%乙醇50 mL，在90 ℃水浴回流1 h，趁熱抽濾，濾渣中加入80 mL蒸餾水，于90 ℃水浴回流 1 h，趁熱抽濾，濾液使用離心機(jī)于常溫、5 000 r/min離心10 min，上清液用蒸餾水定容至500 mL。取上述多糖溶液、D-無(wú)水葡萄糖溶液和供試品溶液各 2 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加0.6 mL苯酚與5 mL 98%硫酸，在100 ℃水中顯色 20 min，冷卻至室溫，在488 nm處測(cè)定其吸光度。測(cè)得青錢柳多糖與D-無(wú)水葡萄糖間的換算因子f=2.654。根據(jù)吸光度和換算因子，計(jì)算供試品中多糖含量。

1.3.2 總?cè)坪繙y(cè)定方法 通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和全波段掃描，確定樣品中總?cè)坪康臏y(cè)定方法：取適量脫脂的青錢柳供試品，精確稱量，加70%乙醇溶液25 mL，超聲提取60 min，取續(xù)濾液和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.2 mL，分別置于10 mL試管中，蒸干后各加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸溶液0.8 mL，在60 ℃水浴中加熱15 min，取出冷卻后加入4 mL冰醋酸，用70%乙醇定容至 10 mL，在546.5 nm處測(cè)定其吸光度。以齊墩果酸計(jì)，計(jì)算樣品中總?cè)坪俊?/p>

1.3.3 槲皮素和山柰素含量測(cè)定方法 通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和全波段掃描，確定樣品中槲皮素和山柰素含量的測(cè)定方法：精確稱量適量青錢柳供試品，加入80%甲醇50 mL，加熱回流1 h，冷卻，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精確量取續(xù)濾液25 mL，精確加入37.5%鹽酸4 mL后置90 ℃水浴中加熱水解 1 h，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，在流動(dòng)相為甲醇 ∶0.4%磷酸(65 ∶35)、進(jìn)樣量10 μL、流速1 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm的色譜條件下，以槲皮素和山柰素為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定樣品中的含量。

1.3.4 方法學(xué)考察 以“1.3.1”“1.3.2”“1.3.3”節(jié)的優(yōu)化條件處理樣品，進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果見表1，上述3種測(cè)定過程中， 樣品在一定時(shí)間范圍內(nèi)穩(wěn)定，儀器精密度良好，重現(xiàn)性高，樣品中待測(cè)物質(zhì)與儀器響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，加樣回收符合測(cè)定要求，所以方法穩(wěn)定、可行。

表1 青錢柳中多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰素測(cè)定的方法學(xué)考察

注：x為濃度，y為峰面積。測(cè)定波長(zhǎng)同“1.3”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)“1.3.1”“1.3.2”“1.3.3”節(jié)的方法，測(cè)定不同干燥溫度和不同生長(zhǎng)年限下的青錢柳樣品中多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰素的含量，結(jié)果見表2。

表2 青錢柳樣品中多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰素含量的測(cè)定結(jié)果

表2(續(xù))

對(duì)青錢柳中的多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰?種成分進(jìn)行主成分分析。根據(jù)主成分分析的原理[23]，結(jié)合特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率，考慮到更為全面地評(píng)價(jià)干燥溫度和生長(zhǎng)年限對(duì)青錢柳質(zhì)量的影響，選擇前2個(gè)主成分，方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá) 83.028%，其特征值分別為2.335、0.987，結(jié)果見表3。

表3 主成分總方差分析

根據(jù)主成分系數(shù)矩陣(表4)，2個(gè)主成分的線性擬合方程為

F1=0.348X1-0.071X2+0.371X3+0.406X4；

F2=0.104X1+0.998X2+0.008X3+0.078X4。

表4 主成分系數(shù)矩陣

由于所測(cè)得的4個(gè)指標(biāo)可以由F1和F2進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)2個(gè)主成分線性擬合中的系數(shù)作加權(quán)平均，對(duì)指標(biāo)權(quán)重進(jìn)行歸一化處理，得綜合評(píng)分模型如下，結(jié)果見表5。

F=0.252X1+0.225X2+0.241X3+0.282X4。

通過對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行方差分析，生長(zhǎng)年限F=8.721，P=0.000<0.05，干燥溫度F=17.106，P=0.000<0.05，兩者對(duì)結(jié)果有顯著影響，結(jié)果見表6。

結(jié)合綜合得分排序，80 ℃時(shí)，各生長(zhǎng)年限下的青錢柳綜合得分最高。在80 ℃條件下，7年生的綜合得分最高。

在青錢柳的產(chǎn)地加工研究過程中，生長(zhǎng)年限較短的青錢柳，葉片薄而色澤淺，用傳統(tǒng)的炒茶機(jī)容易加工成型，成品外觀性狀佳；而生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)的青錢柳，葉片厚而色澤深，在加工過程中，葉片容易碎裂，成品性狀較差[24]。在干燥的過程，溫度過低，干燥所需要的時(shí)間較長(zhǎng)，會(huì)造成葉片顏色加深及有效成分降低，并且效率低下，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，而高溫會(huì)使葉片炭化，破壞有效成分。通過本研究，得出最佳的干燥溫度是80 ℃，最佳的生長(zhǎng)年限為7年。

3 討論

在以往青錢柳相關(guān)的研究中，都是以一個(gè)指標(biāo)性成分或一類有效物質(zhì)進(jìn)行其質(zhì)量的評(píng)價(jià)，本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選確定了青錢柳樣品處理?xiàng)l件和測(cè)定方法。對(duì)60批不同干燥溫度和不同生長(zhǎng)年限下的青錢柳進(jìn)行多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰素指?biāo)的含量測(cè)定，全面確定青錢柳最佳的生長(zhǎng)年限和最優(yōu)的炮制工藝。

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，青錢柳的采收期已有研究報(bào)道[25]，而產(chǎn)地加工及生長(zhǎng)年限對(duì)其品質(zhì)的影響無(wú)研究報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)黔產(chǎn)青錢柳中多糖、總?cè)?、槲皮素、山柰素含量進(jìn)行主成分分析并結(jié)合隨機(jī)區(qū)組的試驗(yàn)方差分析，確定青錢柳的最佳干燥溫度為80 ℃，生長(zhǎng)年限在7年左右為宜。

表5 青錢柳樣品主成分因子及品質(zhì)綜合得分

表5(續(xù))

表6 綜合評(píng)分的方差分析結(jié)果

4 結(jié)論

青錢柳是我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一，具有很高的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。但是，現(xiàn)有的青錢柳資源主要是天然林，不僅數(shù)量少，而且多零星分布于深山老林和一些自然保護(hù)區(qū)中[26-27]。目前，青錢柳葉的主要食用方式是制成茶，其制法和飲法都與綠茶類似，人們從20世紀(jì)八九十年代開始就以青錢柳葉為原料制成了系列茶產(chǎn)品，其銷售額呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。但青錢柳茶實(shí)質(zhì)上為單純的水浸出劑，雖能將青錢柳葉中的大部分多糖溶出，但不能將其中三萜、黃酮等其他對(duì)人體有益的有效成分溶出，由此造成大量原材料的浪費(fèi)。隨著青錢柳茶市場(chǎng)份額的不斷擴(kuò)大，缺乏統(tǒng)一的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法客觀評(píng)價(jià)青錢柳茶的質(zhì)量，制約了其后續(xù)開發(fā)利用。

現(xiàn)今，貴州省建立了青錢柳種植基地，通過對(duì)該基地的考察可知，當(dāng)?shù)氐牟墒占竟?jié)為清明節(jié)前后，此時(shí)葉片較為柔軟，容易加工，成品性狀較佳，但加工方式也只有簡(jiǎn)單的傳統(tǒng)炒茶機(jī)，沒有對(duì)溫度的控制。由于設(shè)備簡(jiǎn)單，造成了大量稀有資源的浪費(fèi)。本研究成果可以用于指導(dǎo)青錢柳加工設(shè)備關(guān)鍵參數(shù)的設(shè)置及幼苗移栽后的最佳采摘年限，并可為以青錢柳為原料的特醫(yī)食品、保健食品的開發(fā)提供技術(shù)指導(dǎo)，最大程度地保留青錢柳的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，確保其保健功能。

為了改變青錢柳茶市場(chǎng)混亂的局面，出臺(tái)青錢柳的地方或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行，這就需要以青錢柳的前期基礎(chǔ)研究作為依據(jù)，利用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)青錢柳，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)為黔產(chǎn)青錢柳資源科學(xué)合理的開發(fā)利用提供參考[28]。本研究采用主成分分析法，客觀分析黔產(chǎn)青錢柳生長(zhǎng)年限、采摘時(shí)間、炮制工藝、提取方法等幾個(gè)方面對(duì)其質(zhì)量的影響，以期為黔產(chǎn)青錢柳提供更多發(fā)展可能，在初制產(chǎn)品基礎(chǔ)上向提取保健成分與開發(fā)保健食品、化妝品、藥品延伸，向中成藥多樣化、天然飲料、天然食品、天然療養(yǎng)、體驗(yàn)、休閑旅游等方面發(fā)展。既可提高青錢柳產(chǎn)業(yè)的效益，又橫縱向拓展了該產(chǎn)業(yè)空間，拓寬了視野，開拓了思路，營(yíng)造了良好的發(fā)展氛圍，實(shí)現(xiàn)資源共享，有利于最大限度地開發(fā)利用青錢柳[29]。