草莓干燥過程中酯類香氣化合物及相關(guān)酶活性的變化

張莉會，汪 超，廖 李，安可婧，胡建中，喬 宇,*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430064；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510642）

草莓的香氣是重要的品質(zhì)屬性，對消費者的可接受性有重大影響，其主要以酯類、醇類、醛類、酮類及含硫化合物等香氣化合物為主。各種香氣類型的芳香物質(zhì)相互作用，并以不同的配比結(jié)合，形成了草莓果實的不同風味。一些芳香物質(zhì)，如長鏈羧酸、醛類等，雖然在果實中的相對含量比較高，但由于香氣值比較小，不能作為草莓果實的特征芳香物質(zhì)，而酯類化合物雖然在果實中的含量很少，但由于具有很高的香氣值，是草莓果實的特征芳香物質(zhì)[1]。通常，在許多情況下，深加工和收獲處理后忽略了風味屬性對于更好外觀或更長保質(zhì)期的重要性。

干燥草莓香氣的形成是一個動態(tài)過程，在干燥過程中，食品中大部分基本組分和非基本組分都會發(fā)生一定程度的降解，從而產(chǎn)生種類繁多的氣味化合物。干燥過程中，細胞發(fā)生破碎，當不同細胞區(qū)室中分離的酶和有機底物相互作用時，揮發(fā)物通常從新鮮產(chǎn)品組織中釋放出來[2-3]。此階段草莓內(nèi)各種脂肪酸、氨基酸及碳水化合物作為香氣前體物質(zhì)，在一些關(guān)鍵酶的作用下被催化形成不同的揮發(fā)性化合物，各種揮發(fā)物共同作用形成了干燥草莓特有的香氣[4-5]。干燥過程中氣味的產(chǎn)生和變化一般分為以下幾類：1）由氨基化合物和羧基化合物兩者之間發(fā)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的新的氣味；2）酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的氣味；3）熱降解所產(chǎn)生的氣味等[6-7]。

近年來關(guān)于香氣代謝途徑的研究主要集中在酶與果實香氣物質(zhì)形成之間的聯(lián)系上，其中研究的重點主要集中在酯類合成途徑過程中相關(guān)酶的作用機理。酯類香氣代謝途徑中的關(guān)鍵酶醇?；D(zhuǎn)移酶、醇脫氫酶及脂氧合酶成為熱點研究對象[8-9]。醇酰基轉(zhuǎn)移酶和醇脫氫酶在酯類化合物的生物合成過程中起關(guān)鍵作用，氨基酸、糖類和脂質(zhì)首先轉(zhuǎn)化為酸、醛或醇類化合物，然后再轉(zhuǎn)化為酯類化合物，其中，酸和醇類化合物可以直接在醇?；D(zhuǎn)移酶的作用下進行轉(zhuǎn)化，而醛則必須先轉(zhuǎn)化為酸或醇后才能再轉(zhuǎn)化為酯類化合物[10]。在醛與醇的轉(zhuǎn)化過程需要有醇脫氫酶的參與，其存在于醇和醛之間的內(nèi)在轉(zhuǎn)換，并為酯類化合物和其他的合成提供前體[11]。因此關(guān)鍵酶活性不僅影響水果中各種物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化，也會直接影響其種類和數(shù)量，進而對香味物質(zhì)的形成產(chǎn)生影響[12]。

本實驗采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜檢測酯類化合物以及關(guān)鍵酶活性，探究草莓干燥過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化差異，并結(jié)合主成分分析探究干燥過程中草莓香氣物質(zhì)變化規(guī)律，通過相關(guān)性分析，明確酶活性與酯類香氣物質(zhì)間的作用關(guān)系，揭示酯類香氣化合物與脂氧合酶、醇?；D(zhuǎn)移酶、乙醇脫氫酶活性之間的機制，以期探明草莓干燥過程中風味的變化，為今后脫水草莓的加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓品種為天仙醉，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所提供；采收于2018年4月20日，七八成熟，采收后置于4 ℃冰箱進行預(yù)冷。

乙醇脫氫酶測試盒 南京建成生物工程研究所；亞油酸鈉、乙酰輔酶A（均為分析純） 酷爾化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1000冷凍干燥機 東京理化器械株式會社；DHG-9123A電熱恒溫鼓風箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；UV-3802分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 草莓片的制備

將草莓用自來水清洗干凈后，切成5～6 mm的薄片，然后置于-40 ℃冷凍48 h，再進行真空冷凍干燥（冷阱溫度-60 ℃，絕對壓力10 Pa），當草莓水分質(zhì)量分數(shù)為30%時取出，采用熱風干燥（溫度60 ℃，風速1.5 m/s），直到水分質(zhì)量分數(shù)為8%左右，結(jié)束干燥。經(jīng)前期預(yù)實驗得出，草莓干燥15 h水分質(zhì)量分數(shù)為（30f4）%，再采用熱風干燥1 h水分質(zhì)量分數(shù)達到8%以下，因此本實驗分別在干燥0、5、10、15、16 h取樣，進行測定。

1.3.2 頂空氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

稱取2 g樣品于20 mL螺口樣品瓶中，加入0.5 g NaCl和2 mL蒸餾水，于40 ℃水浴鍋中加熱平衡10 min后，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，頂空吸附40 min后，將萃取頭插入氣相色譜進樣口，解吸5 min。

氣相色譜條件：H P-5彈性石英毛細管柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；He流量1.0 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；起始柱溫40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升溫到250 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～350 u[13]。

1.3.3 酶活性測定

1.3.3.1 脂氧合酶測定

稱取5 g草莓果肉置于研缽中，加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的提取緩沖液，在冰浴條件下研磨勻漿，然后轉(zhuǎn)入離心管于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液待酶活性測定用。取2.75 mL 0.1 mol/L、pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液，加入50 μL 0.1 mol/L亞油酸鈉溶液，在30 ℃保溫10 mL，再加入200 μL粗酶液，混勻，以蒸餾水為參比調(diào)零，于波長234 nm處測定吸光度，在反應(yīng)15 s后開始記錄，為初始值，然后每隔30 s記錄1 次[14]，結(jié)果以比活力表示（mU/mg）。

1.3.3.2 醇?；D(zhuǎn)移酶測定

稱取3 g鮮果樣品研磨，按照每克樣品加入0.75 mL蛋白提取液（0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0、0.1%（V/V）Triton X-100、0.3 mg交聯(lián)聚維酮），冰浴提取20 min，10 000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提液。酶活性檢測：反應(yīng)液由以下成分組成：2.5 mL 5 mmol/L MgCl2溶液（0.5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl中含5 mol/L MgCl2）、150 μL乙酰輔酶A溶液（0.5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl中含5 mmol/L 乙酰輔酶A）50 μL丁醇溶液（0.5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl中含200 mmol/L丁醇），150 μL酶提取液，將以上組分混合后置于35 ℃水浴15 min，然后添加100 μL 10 mmol/L 5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)在室溫下放置 10 min，于412 nm波長處比色，用不含酶提取液的反應(yīng)液為空白，每樣品重復(fù)3 次。酶活力單位（U）以1 min吸光度增加值計算，結(jié)果以比活力表示（mU/mg）[15]。

1.3.3.3 乙醇脫氫酶測定

采用乙醇脫氫酶試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)實驗的平均值，用SPSS 19.0軟件進行多重差異顯著性分析，采用Duncan法，P＜0.05，差異顯著；XL-STAT 2016軟件進行主成分分析和相關(guān)性分析；采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓酯類香氣成分分析

酯類香氣化合物具有特殊的甜香，是草莓果實中的重要的特征芳香物質(zhì)[16]。酯類是由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸與醇之間相互作用產(chǎn)生的[17]，其中短鏈脂肪酸酯（C1～C10）具有水果的甜香味，而長鏈脂肪酸酯有輕微油脂味[18-19]。如表1所示，在新鮮草莓（0 h）中檢測到己酸甲酯、乙酸己酯、戊酸乙酯、辛酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、十六烷酸乙酯、油酸乙酯7 種酯類香氣成分，其中，乙酸己酯具有甜蘋果香；在干燥5 h的草莓中檢測到己酸乙酯、乙酸乙酯、十六烷酸甲酯3 種新鮮樣品中沒有檢測到的酯類化合物，其中，乙酸乙酯似醚氣味，己酸乙酯具有菠蘿-香蕉型水果香氣類似的甜的味道[20]，且己酸甲酯、乙酸己酯的峰面積高于新鮮樣品（0 h），但未檢測出戊酸乙酯、12-甲基十四烷酸甲酯和油酸乙酯；干燥10 h的草莓中檢測到13 種酯類化合物，且總峰面積最高，其中己酸乙酯的峰面積較高，且生成了丙酸乙酯、辛酸乙酯、草酸二乙酯、煙酸甲酯、4-羥基-3-甲基-辛內(nèi)酯、丙位十二內(nèi)酯、十四酸乙酯、十六酸甲酯、十六酸乙酯等新的酯類化合物，其中丙酸乙酯具有青蘋果氣味；草莓經(jīng)真空冷凍干燥15 h后，檢測出15 種酯類化合物，其中，乙酸己酯和辛酸甲酯的峰面積較高，較鮮樣增加了11 種酯類化合物，同時損失了4 種酯類化合物，新生成的2-甲基丁基乙酸酯具有香蕉和蘋果的氣味[21]；真空冷凍干燥溫度較低，理論上應(yīng)不易導(dǎo)致風味化合物發(fā)生變化，但是由于干燥時間較長導(dǎo)致物料在真空低溫狀態(tài)下放置較長時間，可能會引發(fā)部分化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致物料中原有的特征香氣物質(zhì)的損失，并產(chǎn)生其他新的香氣組分[22]。干燥16 h后，草莓中檢測到13 種酯類化合物，以己酸乙酯和辛酸甲酯為主，還新生成乙酸辛酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等水果特有的酯類化合物，其中，癸酸乙酯有近似于葡萄的水果香，丁酸乙酯呈甜蘋果香。有關(guān)香蕉片干燥中研究表明，一些揮發(fā)物的保留，包括異丁醇乙酸酯，取決于表面的快速干燥，以去除水分和鎖定香蕉片內(nèi)的大量揮發(fā)物。這種作用減少了主要香氣化合物的總體消耗，有助于保留揮發(fā)性香蕉香氣化合物[23]。在低水分含量下?lián)]發(fā)性增加，表明產(chǎn)品可能容易受到生物動力學(xué)反應(yīng)的影響，從而導(dǎo)致干燥后產(chǎn)品化學(xué)性質(zhì)的一些變化[24]?？傮w來說，干燥過程中草莓片酯類風味發(fā)生明顯變化，隨著干燥時間的延長，水分降低，重新生成了新的酯類香氣化合物，同時也有相應(yīng)的酯類化合物損失。

表1 草莓片干燥過程中酯類物質(zhì)的變化Table 1 Changes in ester contents in strawberry slices during drying

續(xù)表1

2.2 干燥過程中酯類香氣物質(zhì)的主成分分析

表2 特征值及方差貢獻率Table 2 Eigenvalues and contribution to variance

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal component loading matrix

為進一步探究干燥過程中酯類香氣物質(zhì)變化規(guī)律，以干燥時間及酯類香氣物質(zhì)為原始變量，利用XL-STAT軟件進行主成分分析后得出4 個獨立的主成分及其特征值，如表2所示。表3可反映各主成分對干燥過程中草莓酯類化合物和酶活性的影響程度。由表2、3可知，前3 個主成分累計方差貢獻率達到88.178%，反映原變量的信息；第1主成分的特征值為10.943，貢獻率為36.476%，代表了全部信息的36.476%，主要反映己酸甲酯、己酸乙酯、乙酸己酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、草酸二乙酯、煙酸甲酯、4-羥基-3-甲基-辛內(nèi)酯、丙位十二內(nèi)酯以及十四酸乙酯等的含量；第2主成分的特征值為8.902，貢獻率為29.672%，主要代表2-甲基丁酸乙酯、己酸己酯、乙酸乙酯、異戊酸正辛酯、戊酸甲酯、十六酸甲酯和丁位十一內(nèi)酯等的含量；第3主成分的特征值為6.612，貢獻率為22.039%，主要反映乙酸辛酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁位辛內(nèi)酯的含量。

圖1 干燥過程中酯類物質(zhì)在第1、2主成分上的散點圖Fig. 1 Scatter plots of principal components 1 versus 2 for esters in strawberry during drying

表4 主成分得分Table 4 Scores of the fi rst two principal components

如圖1所示，其中干燥15 h的草莓片在第1、2主成分上呈正向分布，2-甲基丁酸乙酯、己酸甲酯、己酸己酯、乙酸己酯、異戊酸正辛酯、戊酸甲酯、辛酸乙酯、十六酸甲酯、十六酸乙酯和丁位十一內(nèi)酯等也在第1、2主成分上呈正向分布，由此可見，這些酯類化合物和干燥15 h的草莓均與第1、2主成分呈正相關(guān)；干燥16 h的草莓片分布在第2象限，表明其與第1主成分成負相關(guān)，與第2主成分成正相關(guān)，而乙酸辛酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、油酸乙酯和丁位辛內(nèi)酯以及(S)-3-羥基丁酸甲酯也分布在第2象限，由此可見，這些是干燥16 h的草莓片中主要酯類化合物。干燥0 h和5 h的草莓片與第1、2主成分均呈負相關(guān)，戊酸乙酯、辛酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、十六烷酸乙酯和十六烷酸甲酯在第1、2主成分上均呈負向分布，表明干燥0 h和5 h草莓以這些酯類化合物為主；而干燥10 h的草莓處于第4象限，與第1主成分呈正相關(guān)，與第2主成分呈負相關(guān)，己酸乙酯、丙酸乙酯、草酸二乙酯、煙酸甲酯、丙位十二內(nèi)酯和十四酸乙酯位于第4象限，由此可見，干燥10 h的草莓以這些酯類香氣物質(zhì)為主。從表4可以看出，干燥過程中草莓的酯類化合物綜合得分排名由高到低依次為干燥15 h＞干燥16 h＞干燥10 h＞干燥5 h＞干燥0 h。

2.3 關(guān)鍵酶活性分析

表5 草莓干燥過程中酶活性變化Table 5 Changes in ester-related enzymatic activities during strawberry drying

脂肪酸是合成大多數(shù)直鏈酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)，脂肪有多種氧化途徑[25]，其中脂氧合酶氧化途徑參與了果實風味物質(zhì)的合成[26]。脂氧合酶催化亞油酸和亞麻酸反應(yīng)生成氫過氧化物，通過β-氧化形成醛類或稀酸類化合物，然后在乙醇脫氧酶作用下反應(yīng)生成醇類物質(zhì)。此后，醇類物質(zhì)作為受體，最后在醇酰基轉(zhuǎn)移酶作用下合成相應(yīng)的酯類物質(zhì)[27]。如表5所示，新鮮草莓脂氧合酶比活力較低，干燥初期逐漸被激活，干燥過程中，脂氧合酶比活力隨著干燥時間的延長逐漸升高，而乙醇脫氫酶比活力隨著干燥時間的變化呈先下降后上升的趨勢，在16 h時達到最大值，此時乙醇脫氫酶比活力為17.08 mU/mg；而醇?；D(zhuǎn)移酶比活力在0～10 h時增大，在10 h時達到最大值，其比活力為44.57 mU/mg。這可能是因為干燥過程中溫度使酶結(jié)構(gòu)組分達到了一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，從而抵消了長時間干燥的作用[28]。與此同時，草莓片中酯類物質(zhì)含量與其脂氧合酶、醇脫氫酶、醇?；D(zhuǎn)移酶活性有關(guān)[29-30]。

2.4 酶活性與酯類香氣化合物相關(guān)性分析

由表6可知，總酶活與己酸甲酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸辛酯呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與十六酸乙酯呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），但與辛酸甲酯和十六烷酸乙酯呈顯著負相關(guān)。乙醇脫氫酶與乙酸辛酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯間均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），還與己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、十六酸乙酯、(S)-3-羥基丁酸甲酯呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與辛酸甲酯呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；有類似研究表明，在還原酶（乙醇脫氫酶）催化作用下反應(yīng)生成乙醇，再合成某酸乙酯[31]。由此可見，乙醇脫氫酶與草莓中己酸乙酯、十六酸乙酯等的合成有關(guān)。

表6 相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis

醇?；D(zhuǎn)移酶與己酸甲酯、乙酸己酯呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與乙酸辛酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯以及十六酸乙酯呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而與十六烷酸乙酯呈極顯著負相關(guān)；研究表明，糖的正常有氧代謝能產(chǎn)生酯類化合物的合成前體物，無氧發(fā)酵產(chǎn)生大量的乙醛和乙醇，從而促進乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯等乙醇基酯含量的增加，從而在醇?；D(zhuǎn)移酶催化下生成乙酸某酯[15]；這與Ueda[32]和Shalit[33]等對草莓、香蕉以及甜瓜的研究結(jié)果一致，醇?；D(zhuǎn)移酶與乙酸某酯的合成有關(guān)。這表明，草莓中醇酰基轉(zhuǎn)移酶與乙酸己酯、乙酸辛酯、乙酸乙酯的合成有關(guān)。

脂氧合酶與乙酸辛酯、乙酸己酯、己酸甲酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁位辛內(nèi)酯呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。研究表明，亞油酸在脂氧合酶和氫過氧化物裂解酶的作用下生成己醛，己醛在醇脫氫酶作用下生成己醇，己醇可進一步生成乙酸己酯，己醛可被氧化成己酸，并進一步生成己酸甲酯等酯類物質(zhì)[34]。本實驗進一步驗證了草莓中脂氧合酶能影響乙酸己酯、己酸甲酯等酯類化合物的合成。

3 結(jié) 論

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定草莓干燥過程中酯類香氣物質(zhì)的變化。結(jié)果表明：干燥過程中草莓的酯類香氣物質(zhì)會發(fā)生明顯變化，新生成了己酸乙酯、乙酸辛酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯類化合物，己酸甲酯、乙酸己酯、乙酸辛酯等含量增加，同時也有部分酯類化合物損失；脂氧合酶、乙醇脫氫酶酶活性在干燥16 h達到最大值，而醇?；D(zhuǎn)移酶活性在干燥10 h達到最大值。主成分分析顯示，干燥15 h的草莓片酯類香氣化合物綜合得分最高；相關(guān)性分析結(jié)果表明，乙醇脫氫酶與某酸乙酯以及乙酸辛酯、(S)-3-羥基丁酸甲酯等酯類香氣化合物呈顯著正相關(guān)；醇酰基轉(zhuǎn)移酶與乙酸某酯、己酸甲酯以及辛酸乙酯等呈顯著正相關(guān)；脂氧合酶與乙酸辛酯、乙酸己酯、己酸甲酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁位辛內(nèi)酯呈顯著正相關(guān)。