血管活性腸肽在單眼視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中的表達(dá)*

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科，四川 南充 637100）

弱視是造成全世界兒童視力下降的主要疾病之一。近些年來，隨著分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等多學(xué)科在弱視研究上的廣泛應(yīng)用，其發(fā)病機(jī)制得到進(jìn)一步揭示。目前，已知弱視的發(fā)生、發(fā)展主要與視覺神經(jīng)系統(tǒng)（主要包括視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體及視皮層）的異常改變緊密相關(guān)。弱視患者的視網(wǎng)膜和視皮層中多種神經(jīng)遞質(zhì)的含量改變，如神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、營養(yǎng)神經(jīng)素及多巴胺等。血管活性腸肽（vasoactive intestinal polypeptide,VIP）作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，由28個氨基酸殘基組成，屬于分泌素-胰高血糖素家族，廣泛分布于中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)中，隨后被發(fā)現(xiàn)也存在外側(cè)膝狀體中[1]。早前有研究表明，視覺剝奪性弱視幼貓視皮層17區(qū)的VIP 含量減少，但在外側(cè)膝狀體中的變化還未探究[2]。本實驗通過觀察視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中VIP的表達(dá)，探討VIP 對視覺發(fā)育的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康3周齡幼貓30只（由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），雌雄、毛色不分，體重約290 ～360 g。排除屈光介質(zhì)混濁及眼底異常，經(jīng)檢測所有幼貓屈光度約+1.0 ～+2.0D。飼養(yǎng)在光照充足環(huán)境中，室內(nèi)溫度維持在（27±1）℃。5周齡前幼貓不能自主攝取固態(tài)食物，每日定時喂養(yǎng)貓奶粉、飲用水共8 次。5周齡后保持室內(nèi)存放充足食物及飲用水。本研究通過川北醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)并接受全程監(jiān)督。

1.1.2 主要試劑及儀器 檸檬酸（pH=6.0）抗原修復(fù)液（武漢Servicebio公司），VIP抗體（美國Fitzgerald公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（武漢Servicebio公司），免疫組織化學(xué)試劑盒DAB 顯色劑（武漢Servicebio公司），焦碳酸二乙酯（美國Amresco公司），兔抗地高辛抗體（美國Jackson公司），探針序列，正向引物：5’-DIGTGCATCCGAGTGGCGCTTGATTGG-DIG-3’；反向引物：5’-DIG-CTGGTTTCCATCTTTGTACC TTGCCAAGTAGTG-DIG-3’（武 漢Servicebio 公 司），動物針電極（北京高視遠(yuǎn)望科技有限責(zé)任公司），視覺電生理儀（重慶國特醫(yī)療設(shè)備有限公司），掌上離心機(jī)（武漢Servicebio公司），原位雜交用離心管（美國Axygen公司），成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型復(fù)制 30只幼貓隨機(jī)分為對照組和剝奪組，每組15只。用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉剝奪組幼貓后，于右眼眶周邊對稱做4個皮膚固定縫線，每個縫線上做1個小套環(huán)（遮蓋過程中套環(huán)一直存在），使用絲線穿過小套環(huán)，再穿過黑色眼罩的4個小孔，打結(jié)固定眼罩，保證眼罩不壓迫眼球。每周剪斷絲線行圖形視覺誘發(fā)電位（pattern visual evoked potential,PVEP）檢測。對所有幼貓行PVEP 檢測時，3 根動物針電極分別刺入前額正中，雙耳連線枕部正中及耳尖背部的皮下。相應(yīng)鏡片矯正屈光，調(diào)整頭位使視網(wǎng)膜后極部中央與屏幕中央在同一水平線上，PVEP 采用棋盤格反轉(zhuǎn)刺激，模式選用0.3 cpd，時間頻率為1 Hz，疊加64 次，分別測量剝奪組剝奪眼和未剝奪眼、對照組右眼。6周齡時，通過比較PVEP的P100波潛伏期及振幅，證實視覺剝奪組中單眼弱視形成。用戊巴比妥鈉深度麻醉剝奪組和對照組幼貓，分離出右側(cè)外側(cè)膝狀體，石蠟包埋切片，行免疫組織化學(xué)及原位雜交實驗研究。

1.2.2 實驗方法 免疫組織化學(xué)：石蠟切片，常規(guī)脫蠟，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，分別加入一抗、二抗，DAB 顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析陽性細(xì)胞和陽性細(xì)胞平均光密度值。原位雜交：石蠟切片，常規(guī)脫蠟，消化，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，預(yù)雜交，雜交，雜交后洗滌，滴加封閉液，滴加兔抗地高辛抗體，DAB 顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，顯微鏡檢，圖像采集分析陽性細(xì)胞和陽性細(xì)胞平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PVEP 結(jié)果

對照組幼貓隨著年齡增加，P100波潛伏期逐漸縮短，振幅逐漸提高。測試時控制電阻，可見各組典型PVEP 波形（見圖1）。6周齡時，對照組右眼、剝奪組右眼和剝奪組左眼潛伏期比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；剝奪組右眼較對照組右眼及剝奪組左眼的潛伏期延長（P＜0.05）。對照組右眼、剝奪組右眼和剝奪組左眼振幅比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），剝奪組右眼較對照組右眼及剝奪組左眼振幅降低（P＜0.05）。在進(jìn)行單眼遮蓋3周后（即6周齡時），剝奪組幼貓右眼已形成單眼視覺剝奪性弱視。見表1。

圖1 各組幼貓PVEP 波形圖

表1 各組P100 波潛伏期和振幅比較（n =15，±s）

表1 各組P100 波潛伏期和振幅比較（n =15，±s）

組別 P100 波潛伏期/ms P100 振幅/u對照組右眼 96.89±4.48 12.39±1.98剝奪組右眼 121.31±8.44 9.63±0.84剝奪組左眼 99.70±2.29 12.09±1.05 F 值 38.872 8.428 P 值 0.000 0.003

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

對每張切片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析?？梢妰山M幼貓外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中VIP 呈陽性表達(dá)，位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色-淡黃色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。對照組大部分呈強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞數(shù)較多，剝奪組大部分呈中等陽性到弱陽性，陽性細(xì)胞數(shù)較少，可見兩組VIP 蛋白表達(dá)存在差異（見圖2）。兩組陽性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），剝奪組較對照組少。兩組陽性細(xì)胞平均光密度值比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），剝奪組較對照組低。視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中VIP 蛋白表達(dá)較正常幼貓降低。見表2。

圖2 6周齡外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中VIP 蛋白的表達(dá)（DAB×200）

2.3 原位雜交結(jié)果

對每張切片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組幼貓外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中均有VIP mRNA 陽性表達(dá)，位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色-淡黃色，同時與藍(lán)染的細(xì)胞核重疊。對照組大部分呈強(qiáng)陽性，陽性細(xì)胞數(shù)較多，剝奪組大部分呈中等陽性到弱陽性，陽性細(xì)胞數(shù)較少，可見兩組VIP mRNA表達(dá)存在差異（見圖3）。兩組陽性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），剝奪組較對照組少。兩組平均光密度值比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），剝奪組較對照組低見表3。視覺剝奪性弱視幼貓外側(cè)膝狀體中VIPmRNA 轉(zhuǎn)錄水平較正常幼貓下降。見表3。

表2 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 免疫組織化學(xué)結(jié)果比較（n =15，±s）

表2 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 免疫組織化學(xué)結(jié)果比較（n =15，±s）

組別 陽性細(xì)胞數(shù)/個 光密度值對照組 121.78±13.32 4 116.47±1 122.24剝奪組 53.44±40.98 2 138.07±1 765.78 t 值 4.758 2.837 P 值 0.000 0.000

圖3 6周齡外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中VIP mRNA的表達(dá)（DAB×200）

表3 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 原位雜交結(jié)果比較（n =15，±s）

表3 兩組外側(cè)膝狀體中VIP 原位雜交結(jié)果比較（n =15，±s）

組別 陽性細(xì)胞數(shù)/個 光密度值對照組 61.00±20.30 3 061.76±1 595.64剝奪組 35.00±13.40 1 307.08±623.24 t 值 3.024 2.897 P 值 0.009 0.012

3 討論

本實驗通過PEVP來確定剝奪組弱視的形成，然后用免疫組織化學(xué)和原位雜交來檢測VIP在外側(cè)膝狀體中的表達(dá)變化。通過實驗發(fā)現(xiàn)，幼貓在視覺發(fā)育敏感期內(nèi)，由于雙眼視覺信息的不對等輸入，導(dǎo)致外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)降低；而VIP表達(dá)下降又對外側(cè)膝狀體正常表達(dá)的生理功能造成負(fù)面影響，從而影響視覺發(fā)育，促進(jìn)弱視的發(fā)生、發(fā)展。

VIP 最早于1970年由豬小腸的甲醇抽提液中經(jīng)過分離得到，其具有血管舒張活性，最初被認(rèn)為是一種候選胃腸激素。后來發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于大腦皮質(zhì)、眼內(nèi)組織中[3-6]，隨后證明在外側(cè)膝狀體中也廣泛存在[1]。VIP 主要作為神經(jīng)遞質(zhì)起作用[7]，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂，增加神經(jīng)細(xì)胞突起的數(shù)量[8]；同時促進(jìn)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化，提高成熟神經(jīng)元的數(shù)量[9]。VIP 還影響血漿中胰多肽、脂聯(lián)素及胰島素等代謝調(diào)節(jié)激素的表達(dá)水平，進(jìn)而影響細(xì)胞代謝[10]。以往學(xué)者認(rèn)為，外側(cè)膝狀體僅僅作為視網(wǎng)膜神經(jīng)傳遞的接受體，將來自視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維束換能后傳遞至視皮層，其并不參與視覺功能的編碼，視皮層才是弱視主要的神經(jīng)系統(tǒng)受損部位。但后來發(fā)現(xiàn)外側(cè)膝狀體并不是單純的神經(jīng)傳導(dǎo)中繼站，其參與方向性等精細(xì)視覺的形成[11]。在單眼剝奪性弱視中，與剝奪眼同側(cè)的外側(cè)膝狀體被觀察到存在神經(jīng)元活動減弱[12]和神經(jīng)元萎縮[13]的現(xiàn)象，同時經(jīng)弱視側(cè)的外側(cè)膝狀體投射到視皮層17區(qū)、18區(qū)的神經(jīng)元體積也減小[14]。而且單眼剝奪性弱視中，剝奪側(cè)的外側(cè)膝狀體中細(xì)胞大小的改變與同側(cè)視皮層第4 層中眼優(yōu)勢柱寬度的減少密切相關(guān)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，外側(cè)膝狀體與視皮層一樣，在成年動物中仍然具有經(jīng)驗依賴的可塑性，其部分功能可以在弱視后得以恢復(fù)，提示外側(cè)膝狀體在弱視治療中也應(yīng)得到重點關(guān)注[16-18]?？梢娡鈧?cè)膝狀體在視覺神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中不僅有神經(jīng)傳導(dǎo)作用，還有功能編輯作用。研究異常視覺體驗對外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)的影響可以論證VIP在視覺發(fā)育中扮演的重要地位。

對于幼貓，視覺剝奪的影響程度在出生后1個月達(dá)到峰值，到3個月齡時，視覺剝奪對視覺發(fā)育的影響幾乎為零[19]。本實驗在視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)進(jìn)行單眼視覺剝奪，通過PVEP 檢測弱視的形成，這與目前普遍認(rèn)為的弱視形成機(jī)制和診斷方式相一致。對照組右眼、剝奪組左眼與剝奪組右眼的P100波潛伏期和振幅比較有差異，說明實驗組單眼弱視已形成，其中P100波潛伏期延長更能提示視路的傳導(dǎo)存在問題；同時創(chuàng)新性的遮蓋方式降低因傳統(tǒng)眼瞼縫合而增加皮損處感染的風(fēng)險，避免定期PVEP 檢測對眼瞼皮膚的反復(fù)縫合造成諸如角膜刺激、縫線斷裂等影響測試的不良后果。

本文分別從蛋白和基因?qū)用孀C實視覺剝奪對外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)的影響。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，在幼貓視覺發(fā)育敏感期內(nèi)的視覺剝奪，使外側(cè)膝狀體接受視網(wǎng)膜的視覺傳入信號減弱，致使外側(cè)膝狀體中表達(dá)VIP的神經(jīng)元得不到足夠的視覺刺激信號，導(dǎo)致神經(jīng)元的功能發(fā)育異常，蛋白表達(dá)能力降低。原位雜交實驗結(jié)果則證明，視覺剝奪還影響外側(cè)膝狀體內(nèi)源性VIP的產(chǎn)生，使神經(jīng)元的細(xì)胞器編碼、加工蛋白質(zhì)的能力減弱。已知VIP 參與細(xì)胞內(nèi)一系列磷酸化偶聯(lián)反應(yīng)，與受體結(jié)合后，通過環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine mono phosphate,cAMP）依賴的蛋白激酶途徑，促進(jìn)葡萄糖的磷酸化和糖原分解，增強(qiáng)神經(jīng)元的營養(yǎng)代謝。VIP 還可以促進(jìn)腺苷酸環(huán)化酶的活化從而增加cAMP的作用[20]。在大腦皮層中，VIP和去甲腎上腺素相互協(xié)同，刺激皮層中cAMP的合成；同時VIP 還加速皮層神經(jīng)元放電[21]。cAMP 作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，是參與細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能和物質(zhì)代謝的重要物質(zhì)，其含量降低會影響細(xì)胞內(nèi)磷酸化等多種胞內(nèi)活動；同時VIP 缺乏導(dǎo)致視交叉上核神經(jīng)元活動節(jié)律紊亂[22]。由此推測，視覺剝奪通過影響外側(cè)膝狀體中神經(jīng)元的發(fā)育，致使VIP表達(dá)下降，而VIP 減少又使神經(jīng)元的信號通路發(fā)生障礙，細(xì)胞內(nèi)的能量代謝、糖代謝等活動均受到影響；同時神經(jīng)元間的電傳導(dǎo)受阻。所以VIP表達(dá)下降會導(dǎo)致外側(cè)膝狀體神經(jīng)元功能發(fā)育不良，而代謝異常的神經(jīng)元又影響外側(cè)膝狀體功能表達(dá)，從而促進(jìn)弱視的形成。

綜上所述，弱視的神經(jīng)系統(tǒng)病理改變也發(fā)生在外側(cè)膝狀體；VIP在視覺發(fā)育中扮演著不可或缺的角色；異常視覺體驗導(dǎo)致外側(cè)膝狀體中VIP表達(dá)下降是弱視的重要發(fā)病機(jī)制之一。此結(jié)果為下一步對VIP 外源性干預(yù)視覺剝奪性弱視幼貓，探索VIP 治療弱視的藥理效果提供實驗基礎(chǔ)。由于方法和實驗條件的限制，本實驗只研究VIP在外側(cè)膝狀體中表達(dá)的變化，而外側(cè)膝狀體中神經(jīng)元的微觀改變有待進(jìn)一步觀察。研究神經(jīng)元相關(guān)細(xì)胞器的變化可以進(jìn)一步明確VIP 對弱視形成的影響。