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    皖北地區(qū)腌制菜中具高抗氧化能力乳酸菌的篩選

    2020-03-11 10:50:34蔣家璇張凱迪姚沛琳
    農(nóng)產(chǎn)品加工 2020年3期
    關(guān)鍵詞:亞鐵螯合乳酸菌

    黃 煜,蔣家璇,張凱迪,姚沛琳

    (宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽宿州 234000)

    0 引言

    乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB) 是可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌不僅可以提高營養(yǎng)價(jià)值,改善食品的風(fēng)味,還可以提高食品保鮮和附加值,而且還具有特殊的生理活性。大量研究表明,乳酸菌可以降低血清膽固醇、控制內(nèi)毒素、制造營養(yǎng)物質(zhì),從而對機(jī)體的營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、衰老過程等產(chǎn)生作用。由于乳酸菌具有諸多益生作用,人們對此加以重視并開發(fā)利用[2]。

    氧化是肌膚衰老的最大威脅,還可引發(fā)心血管、關(guān)節(jié)炎、癌癥等疾病[3]。飲食不健康、日曬、環(huán)境污染、壓力等都可以讓機(jī)體內(nèi)自由基泛濫,從而使肌膚產(chǎn)生各種氧化現(xiàn)象??寡趸镔|(zhì)就是以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)的物質(zhì),其可以直接作用在自由基上,也可以間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì),防止發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)[4]。人體中的抗氧化物質(zhì)一部分由自身合成,另外一部分由食物供給。乳酸菌作為一種研究較多的益生菌,能夠降低自由基的生成[5],作為一種天然抗氧化劑具有較大的研究價(jià)值。

    從皖北地區(qū)腌制咸菜(宿州農(nóng)貿(mào)市場采購的腌制雪菜、豆角、白菜等)中分離出來的20株乳酸菌的基礎(chǔ)上,測定其菌體及無細(xì)胞提取物的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力、螯合亞鐵離子能力這4個(gè)抗氧化指標(biāo),比較它們之間抗氧化活性的差異,篩選出具有高抗氧化活性的菌株,為后續(xù)研究提供優(yōu)良的菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)菌株

    20株乳酸菌,從皖北地區(qū)采集的腌制菜中篩選得到。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    MRS培養(yǎng)基:魚粉蛋白胨10 g/L,酵母粉5/L,牛肉浸膏10 g/L,葡萄糖20 g/L,乙酸鈉5 g/L,檸檬酸氫二銨2 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸錳0.25 g/L,硫酸鎂0.58 g/L,吐溫-80 1 mL/L,于121℃下高壓蒸汽滅菌15 min。

    1.1.3 主要試劑

    焦性沒食子酸、七水合硫酸亞鐵、六水合三氯化鐵、六氰合鐵(III)酸鉀、水楊酸、DPPH試劑等,均購置于國藥集團(tuán)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 菌株的活化

    20株乳酸菌菌株保存于含30%(V/V) 甘油的MRS培養(yǎng)基中,于-80℃下保存,使用前按2%(V/V) 接種量接于MRS液體培養(yǎng)基中,于37℃下培養(yǎng)20 h,連續(xù)活化2次[6]。

    1.2.2 乳酸菌無細(xì)胞提取物的制備

    參考Liu C等人[7]的方法,并稍作修改。收集活化后的乳酸菌(4℃,以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min),用PBS清洗2次后,重懸于PBS中,超聲破碎。超聲破碎條件設(shè)置為:功率60 W,工作3 s停8 s,共15 min。將超聲后的破碎液以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心20 min后取其上清液,經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾后得到無細(xì)胞提取物。

    1.2.3 乳酸菌DPPH清除率的測定

    取樣品1 mL,濃度0.2 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液1 mL,依次加入試管中,二者充分混勻后,于37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h,隨后立即于波長517 nm處測定制品的吸光度值,該方法用蒸餾水做空白對照[8]。自由基清除率計(jì)算方法如下:

    式中:A1——空白管的吸光度;

    A2——樣品管的吸光度。

    1.2.4 乳酸菌羥自由基清除能力的測定

    1,10- 菲羅啉 2.5 mmol/L溶液、PBS(pH 值 7.4)和樣品溶液各加入1 mL,再加1 mL濃度2.5 mmol/L FeSO4溶液。充分混合后,加入1 mL濃度20 mmol/L的H2O2溶液。反應(yīng)混合物在37℃水浴中保持1.5 h。離心收集的上層清液是以轉(zhuǎn)速6 000 r/min離心10 min,其波長為536 nm。同時(shí),按照上述方法,用1 mL PBS代替混合物中1 mL的樣品溶液作為空白對照組,測定536 nm處的吸光度[9]。自由基清除率計(jì)算方法如下:

    式中:A1——對照組在波長536 nm處測得的吸光度;

    A2——樣品管在波長536 nm處測得的吸光度。

    1.2.5 乳酸菌還原能力的測定

    取樣品0.5 mL,加入1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL后PBS(pH值6.6)?;旌显?0℃恒溫水浴20 min。從水浴中取出后,迅速在冰浴中冷卻。加入10%三氯乙酸溶液0.5 mL,混合離心,取上清液(以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min)。取上清液1 mL,加入0.1%氯化鐵溶液1 mL,拌勻。10 min后,以鹽酸半胱氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品,于波長700 nm處測定吸光度。同時(shí),用蒸餾器代替混合物中的樣品于波長700 nm處測量水的吸光度[10]。吸光度越高,待測樣品的還原能力越強(qiáng)。

    1.2.6 乳酸菌螯合亞鐵離子的測定方法

    加入0.1 mL抗壞血酸、0.1 mL硫酸亞鐵和100 mL硫酸亞鐵。2 mol/L的氫氧化鈉溶液,在37℃恒溫水浴20 min后,三氯乙酸沉淀的蛋白質(zhì),以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min,取上清液0.2 mL,添加0.1%的鄰菲羅啉2 mL反應(yīng)10 min后,于510 nm處測量吸光度,OD值,同時(shí)做空白試驗(yàn)(PBS)[11]。

    式中:P0——PBS系統(tǒng)OD值;

    P1——樣品系統(tǒng)的OD值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳酸菌對DPPH自由基清除率的測定結(jié)果

    乳酸菌對DPPH自由基清除率結(jié)果見表1。

    DPPH自由基清除率的測定是一種使用很廣泛的評價(jià)和篩選抗氧化劑抗氧化能力的方法。DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)[12]。試驗(yàn)測定了20株乳酸菌的無細(xì)胞提取物對DPPH自由基的清除情況。20株菌株都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力??傮w而言,菌體細(xì)胞DPPH自由基清除率要比無細(xì)胞提取物強(qiáng)。其中,菌株4-1,3-3的無細(xì)胞提取物對DPPH自由基清除能力比較強(qiáng),分別為61.24%,60.85%;菌株3-1,3-3的菌體細(xì)胞對DPPH自由基清除率較強(qiáng),分別為56.98%,52.71%。

    2.2 乳酸菌清除羥自由基能力的測定

    表1 乳酸菌對DPPH自由基清除率結(jié)果

    乳酸菌清除羥自由基能力結(jié)果見表2。

    表2 乳酸菌清除羥自由基能力結(jié)果

    羥基自由基是一種體內(nèi)氧化能力較強(qiáng)的自由基,可對大分子造成損傷。因此,清除羥自由基的能力也是衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)[13]。研究測定了不同乳酸菌的無細(xì)胞提取物對羥基自由基的清除能力,各菌株均表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除能力??傮w看來,菌體和無細(xì)胞提取物清除羥自由基能力相差不大,其中菌株7-1和6-2的菌體對羥基自由基清除能力較強(qiáng),分別為48.80%,47.06%;菌株7-1和5-3的無細(xì)胞提取物對羥基自由基清除能力較強(qiáng),分別為50.93%,49.96%;菌株5-1的無細(xì)胞提取物對羥基自由基清除能力最低,為5.76%。

    2.3 乳酸菌還原能力的測定

    乳酸菌還原能力的測定結(jié)果見表3。

    抗氧化能力與還原能力直接相關(guān)[14],20株乳酸菌的菌體和無細(xì)胞提取物的還原能力測定結(jié)果均顯示乳酸菌具有一定的還原能力,無細(xì)胞提取物的還原能力相對于菌體的還原能力而言更強(qiáng)。其中,菌株1-2的菌體細(xì)胞的還原力相對較強(qiáng),為0.233,而菌株6-2的菌體細(xì)胞最弱,為0.086;菌株3-5的無細(xì)胞提取物的還原能力較強(qiáng),為0.248,而菌株3-1的還原能力最低,為0.035。

    2.4 乳酸菌螯合亞鐵離子的測定

    乳酸菌螯合亞鐵離子的結(jié)果見表4。

    表3 乳酸菌還原能力的測定結(jié)果

    表4 乳酸菌螯合亞鐵離子的結(jié)果

    由表4可知,20株乳酸菌均具有一定的螯合亞鐵離子的能力,但是菌體細(xì)胞和無細(xì)胞提取物對亞鐵離子的螯合能力基本上差別不大。其中,菌株10-1的無細(xì)胞提取物螯合亞鐵離子能力最強(qiáng),為65.56%,其次是6-2,為34.00%;菌株A-1的菌體細(xì)胞相對較好,為65.66%,而菌株4-1的則最差,為0.75%。

    3 結(jié)論

    乳酸菌的抗氧化作用與其對人體健康息息相關(guān)[15]。試驗(yàn)以羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力的測定、螯合亞鐵離子能力的測定為體外抗氧化能力評價(jià)指標(biāo),對20株分離于皖北地區(qū)不同腌制菜中的乳酸菌為篩選源,比較其菌體細(xì)胞和無細(xì)胞提取物的抗氧化活性。結(jié)果表明,20株菌株中,菌體細(xì)胞的DPPH自由基清除率要比無細(xì)胞提取物強(qiáng)要強(qiáng),而清除羥自由基能力和螯合亞鐵離子能力兩者相差不大,無細(xì)胞提取物的還原能力相對于菌體細(xì)胞的更強(qiáng)??傮w上,菌株7-1抗氧化能力較好。其中菌株7-1,3-3,A-1的菌體細(xì)胞抗氧化能力強(qiáng),菌株3-1,3-5,10-1的無細(xì)胞提取物抗氧化能力強(qiáng)。在今后的研究中,可以對抗氧化能力強(qiáng)的乳酸菌采用細(xì)胞模型或動物模型,對其體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)。

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