血清miR-15b、miR-29a和CysC在妊娠高血壓疾病腎臟損害中的臨床診斷價(jià)值

朱怡，秦艷，何玨

妊娠高血壓疾病(HDCP)是婦科常見病，一般發(fā)生在妊娠20周左右，常常伴有并發(fā)癥的發(fā)生，發(fā)生率在9.4%～10.4%[1-2]，首先出現(xiàn)受累的器官是腎臟，也是威脅孕婦和圍產(chǎn)兒安全的重要因素，其病死率高達(dá)27.5%[3]。因此，早期發(fā)現(xiàn)和診斷妊娠高血壓腎功能損害，早期干預(yù)和治療是改善妊娠結(jié)局的關(guān)鍵。胱抑素C(CysC)是具有早期診斷腎功能損傷的指標(biāo)，但單個(gè)指標(biāo)的敏感度和特異度仍不高[4-5]。微小RNAs(miRNAs)是人體內(nèi)的一種19～25個(gè)核苷酸的RNAs，在妊娠高血壓和腎功能損害的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用?，F(xiàn)已知在急性腎損傷的研究中發(fā)現(xiàn)外周血miR-29a表達(dá)明顯降低，而在HDCP中的研究較少[6]；miR-15b在血管的形成過程中具有重要意義，是否與HDCP患者腎功能損害具有相關(guān)性，仍不清楚。本研究通過聯(lián)合檢測HDCP患者血清miR-15b、miR-29a和CysC水平，觀察其在HDCP發(fā)生發(fā)展和腎功能損害中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2018年12月在上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科診治的HDCP患者108例作為HDCP組，平均年齡22～38(29.34±3.75)歲；平均孕周28～36(32.94±1.38)周；平均孕次1～3(2.15±0.17)次；初產(chǎn)婦39例，經(jīng)產(chǎn)婦69例。根據(jù)病情的嚴(yán)重程度分為妊娠高血壓組39例，子癇前期輕度組35例，子癇前期重度組34例。根據(jù)HDCP患者腎小球?yàn)V過率(eGFR)分為腎功能正常組(eGFR≥80 ml/min)67例和腎功能異常組(eGFR<80 ml/min)41例，腎功能異常組根據(jù)KDIGO制定急性腎損傷標(biāo)準(zhǔn)分為1期17例，2期13例和3期11例。同時(shí)選擇同期正常妊娠在醫(yī)院行產(chǎn)前體檢孕婦30例為正常妊娠組，孕周28～36(31.86±1.26)周；年齡22～38(29.81±4.38)歲；孕次1～3(2.09±0.24)次；初產(chǎn)婦12例和經(jīng)產(chǎn)婦18例。選擇同期在醫(yī)院行健康體檢女性30例為健康對照組，其年齡22～38(28.94±5.16)歲。HDCP組排除標(biāo)準(zhǔn)：冠心病、糖尿病和原發(fā)性高血壓等慢性疾?。幻庖咝院湍[瘤性疾??；肝炎、結(jié)核和肺部感染等急性和慢性感染；內(nèi)分泌和血液性疾病。3組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入選者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測指標(biāo)與方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測：采集患者入院后、體檢者當(dāng)日清晨空腹肘靜脈血10 ml，在4℃的條件下放置30 min，1 800 r/min離心20 min，取上清液，將其保存在-70℃冰箱中待測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定CysC和β2-MG。

1.2.2 miRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)miRNeasy提取試劑盒的說明書提取miRNA，并通過紫外分光度計(jì)將吸光度比值在1.8～2.0之間的標(biāo)本保存用于后續(xù)檢測，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，標(biāo)本保存在-70℃的冰箱中。

1.2.3 qRT-PCR檢測：根據(jù)GenBank中的miR-15b、miR-29a和U6的序列號，并用Premier Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-15b引物序列：上游5’-GCCGGCTAGCAGCACATCATGG-3’，下游5’-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3’； miR-29a的引物序列：上游5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATCTGAA-3’，下游5’-CTCAACTGGTGTGGTGGA-3’；U6引物序列：上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。qRT-PCR的總反應(yīng)體系為25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(其濃度為10 μmol/L)，cDNA為0.8 μl，RNaseH2O為12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM10 ml。反應(yīng)條件為：預(yù)變性溫度95℃10 min，95℃和60℃分為5 s和60 s，總共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在60℃下用ABI7700軟件收集熒光信號進(jìn)行溶解曲線分析，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行復(fù)孔，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt，公式中ΔΔCt=試驗(yàn)組(Ct目標(biāo)基因-CtU6)-對照組(Ct目標(biāo)基因-CtU6)。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比較 HDCP組血清miR-15b、CysC和β2-MG水平明顯高于正常妊娠組、健康對照組(P<0.01)，正常妊娠組高于健康對照組(P<0.01)；而HDCP組血清miR-29a表達(dá)水平明顯低于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，正常妊娠組明顯低于健康對照組(P<0.01)，見表1。

2.2 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平與HDCP嚴(yán)重程度的關(guān)系 血清miR-15b、CysC和β2-MG水平隨著HDCP嚴(yán)重程度升高而升高(P<0.01)，而血清miR-29a表達(dá)水平隨著HDCP嚴(yán)重程度升高而降低(P<0.01)，見表2。

2.3 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平與腎功能損害的關(guān)系 HDCP患者腎功能異常亞組血清miR-15b、CysC和β2-MG水平明顯高于腎功能正常亞組(P<0.01)，而血清miR-29a表達(dá)水平明顯低于腎功能正常亞組(P<0.01)，見表3。

2.4 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平與HDCP腎功能損害嚴(yán)重程度的關(guān)系 HDCP腎功能異常組血清miR-15b、CysC和β2-MG水平隨著腎功能分期升高而升高(P<0.01)，而血清miR-29a表達(dá)水平隨著腎功能分期升高而降低(P<0.01)，見表4。

表1 各組血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比較

注：與健康對照組比較，aP<0.01；與正常妊娠組比較，bP<0.01

表2 不同HDCP嚴(yán)重程度患者血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比較

注：與妊娠高血壓亞組比較，aP<0.01；與子癇前期輕度亞組比較，bP<0.01

表3 不同腎功能損害患者血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比較

表4 不同HDCP腎功能分期患者血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG水平比較

注：與1期比較，aP<0.01；與2期比較，bP<0.01

2.5 血清miR-15b、miR-29a和CysC、β2-MG診斷HDCP腎功能損害的效能 血清miR-15b，miR-29a和CysC表達(dá)水平診斷HDCP腎功能損害的效能明顯高于β2-MG(z=2.391，P<0.01；z=2.285，P<0.05；z=2.276，P<0.05)，而各指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對血清miR-15b、miR-29a和CysC進(jìn)行二元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(miR-15b、miR-29a和CysC)的AUC為0.993，敏感度為95.1%，特異度為100%，明顯優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)miR-15b(z=2.744，P<0.01)、miR-29a(z=3.590，P<0.01)和CysC(z=3.151，P<0.01)的檢測，見表5、圖1。

3 討 論

HDCP是妊娠期婦女特有的疾病，其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚， HDCP患者出現(xiàn)全身小血管痙攣、動脈血壓升高，引起其他臟器灌注不足，而臟器灌注不足導(dǎo)致病理生理改變，常常危及孕婦和圍產(chǎn)兒的安全。最常累及的器官為腎臟，常引起腎臟損害和腎功能障礙。血肌酐和蛋白尿的檢測常運(yùn)用于腎損傷的診斷和病情判斷，但由于其敏感度低，影響對病情的判斷。β2-MG是用于判斷腎損傷的常見指標(biāo)，由于其敏感度和特異度仍不高，逐漸被其他檢測指標(biāo)所替代[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，HDCP組血清CysC水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組，并且隨著HDCP病情嚴(yán)重程度的加重而升高，說明CysC參與了HDCP的發(fā)生發(fā)展過程，是反映HDCP病情的重要指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HDCP腎功能異?；颊哐錍ysC水平明顯高于腎功能正常組，并且隨著腎功能分期進(jìn)展而升高，說明CysC也是反映HDCP腎臟損害程度的重要指標(biāo)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[8]。CysC是一種相對分子量較小的非糖化多肽鏈，在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不受性別、年齡和飲食結(jié)構(gòu)的影響，腎小球的濾過功能與血清CysC水平密切相關(guān)，輕微的腎小球損害即會引起血清CysC水平的升高，是診斷急性腎損傷的有效指標(biāo)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)CysC在診斷腎臟損傷的效能方面明顯優(yōu)于β2-MG，當(dāng)其>1.832 mg/L，其敏感度68.3%，特異度94.0%，AUC為0.897，說明在診斷HDCP腎損傷方面具有較高的敏感度和特異度。

miRNAs是一類長度為20個(gè)核苷酸左右的RNA分子，屬于非編碼RNA，無法翻譯形成蛋白質(zhì)，但對DNA的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。隨著對miRNAs的深入研究，其與妊娠和循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，越來越多的研究表明，miRNAs與妊娠相關(guān)性病變具有密切聯(lián)系，同時(shí)參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，HDCP組血清miR-15b表達(dá)水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組，并且隨HDCP嚴(yán)重程度升高而升高，說明miR-15b參與了HDCP疾病的發(fā)生發(fā)展過程?，F(xiàn)已知miR-15b位于3q25.33，在一項(xiàng)缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，其在心肌細(xì)胞中的表達(dá)明顯出現(xiàn)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-15b通過抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[12]。在心血管疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-15b通過使線粒體變性，導(dǎo)致細(xì)胞ATP水平下降，從而影響心肌的代謝，并認(rèn)為miR-15b參與了心血管病變的發(fā)生發(fā)展過程[13]。妊娠期高血壓是否對miR-15b表達(dá)有影響，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究證實(shí)HDCP腎功能異常組血清miR-15b表達(dá)明顯高于腎功能正常組，并且隨著腎功能分期升高而升高，說明miR-15b在腎功能損害的過程中具有重要作用。在診斷腎功能損害的效能方面，當(dāng)血清miR-15b>2.697，其敏感度為85.4%，特異度85.1%，AUC為0.904，明顯優(yōu)于β2-MG，說明miR-15b表達(dá)水平在診斷HDCP腎功能損害具有較高效能。

表5 血清miR-15b、miR-29a、CysC和β2-MG在診斷HDCP腎功能損害的效能

miR-29a是miR-29家族中的一員，在纖維化疾病中研究較多，主要在心肌梗死后纖維化、全身動脈硬化和肺纖維化等疾病中起到抗纖維化的作用[14-17]，是多種細(xì)胞外膠原合成的關(guān)鍵因子，對膠原蛋白的合成起到抑制作用。而在妊娠高血壓疾病中的研究未見報(bào)道[18-19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，HDCP腎功能異常患者血清miR-29a表達(dá)水平明顯低于腎功能正常組，并且隨著腎功能分期升高而降低，說明miR-29a是腎功能異常的保護(hù)因子。在診斷HDCP腎功能異常的效能方面，當(dāng)血清miR-29a表達(dá)水平≤1.031，其敏感度為80.5%，特異度為86.6%，AUC為0.888，說明miR-29a表達(dá)水平對HDCP腎功能損傷具有較高的診斷效能。本研究通過聯(lián)合miR-15b、miR-29a和CysC檢測，發(fā)現(xiàn)其AUC為0.993，明顯高于單個(gè)指標(biāo)的檢測，并且說明各個(gè)指標(biāo)診斷HDCP腎功能損害具有一定的互補(bǔ)性，但其確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

總之，miR-15b、miR-29a和CysC參與了妊娠高血壓疾病腎臟損害的發(fā)生發(fā)展過程，聯(lián)合miR-15b、miR-29a和CysC指標(biāo)診斷HDCP腎損害具有較高的敏感度和特異度。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

朱怡：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫；秦艷：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;何玨：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改