低溫環(huán)境下秸稈降解菌的篩選與性能檢測(cè)*

張國(guó)盛，顏婉茹，陳春亮，李掌印，李亞男，何新超

（哈爾濱理工大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

秸稈是我國(guó)東北地區(qū)農(nóng)田中隨處可見(jiàn)的廢棄物，據(jù)有關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2017年我國(guó)秸稈理論資源量為8.84億t，2018年秸稈理論資源量預(yù)計(jì)達(dá)8.86億t左右。黑、吉、遼三省作為我國(guó)糧食主產(chǎn)地年秸稈資源量較大，而常見(jiàn)的露天焚燒等原始處理方法不但造成資源浪費(fèi)，更會(huì)引發(fā)空氣污染、火災(zāi)等嚴(yán)重后果。秸稈堆腐還田技術(shù)在我國(guó)南方等地早有應(yīng)用，但由于東北地區(qū)冬季寒冷，此項(xiàng)技術(shù)一直無(wú)法開(kāi)展[1]。

本研究以農(nóng)田廢棄的秸稈為主要原料，進(jìn)行了低溫環(huán)境下秸稈降解菌的篩選與特性研究，以期為低溫下農(nóng)田廢棄物的有效治理提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與方法

1.1.1 菌落及樣品來(lái)源 取樣地址位于哈爾濱市平房區(qū)某玉米農(nóng)田，室外平均溫度為10℃，取玉米根部5～8cm處濕潤(rùn)土壤1000g，經(jīng)浸泡、富集、篩選、馴化，得到所需的低溫纖維素降解菌，并對(duì)其肥力進(jìn)行檢測(cè)。秸稈廢棄物樣品來(lái)源為玉米田收獲后殘余秸稈。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集液體培養(yǎng)基：蛋白胨5g，K2HPO40.5g，Na2CO32.5g，MgSO4·7H2O 0.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.008g，MnSO40.025g，酵母膏 5g，定容至 500mL，調(diào)pH值為6.0；

初篩（剛果紅）培養(yǎng)基：CMC-Na 5g，（NH4）2SO40.5g，MgSO4·7H2O 0.125g，KH2PO20.25g，NaCl 0.125g，剛果紅 0.05g，瓊脂 5g,，定容至250mL，調(diào)pH 值為7.2；

復(fù)篩（濾紙條崩解）培養(yǎng)基：（NH4）2SO41g，Mg－SO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，酵母膏 0.1g，定容至1000mL；

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（g·L-1）：CMC-Na 15g，NaCl 5g，KH2PO41g，MgSO40.2g，蛋白胨 10g，酵母粉 5g，瓊脂 18g，調(diào)pH 值為 7.2；

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母5g，NaCl 10g，pH值為7.0，定容至1L，再加入15g瓊脂。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2g，蛋白胨10g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，瓊脂 20g，定容至 1L。

1.1.3 試劑

0.1 mol·L-1HAc-NaAc緩沖溶液（pH 值為4.6）：將 49.0mL 0.2mol·L-1NaAc 溶液和 51.0mL 0.2mol·L-1HAc溶液混合后定容至100mL。

3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱(chēng)取 6.3g 3，5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21g NaOH，182g酒石酸鉀鈉，加水500mL，加熱溶解后再加入5.0g重蒸酚和5.0g NaNO2，攪拌溶解，冷卻，定容至1000mL，存于棕色瓶中，放置7d后使用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0mg·mL-1）：稱(chēng)取 1.000g 葡萄糖（AR）（105℃干燥至恒重）用蒸餾水溶解后定容至1000mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

羧甲基纖維素溶液：稱(chēng)2.0g CMC-Na溶于200mL蒸餾水中，加HAc緩沖溶液100mL，混合均勻后存于冰箱內(nèi)備用，配后隔天使用。

HAc-NaAc 緩沖溶液：將 49.0mL 0.2mol·L-1醋酸鈉溶液和51.0mL 0.2mol·L-1醋酸溶液混合后定容至1L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 秸稈降解菌的篩選馴化 將所取土樣均分成4份，每份各60g于1000mL燒杯中加入蒸餾水，NaCl 1g，牛肉膏1g，蛋白胨2g于20℃下培養(yǎng)1d。取出后曝氣30min，同樣溫度培養(yǎng)1d。加入富集培養(yǎng)基90mL，在15℃的溫度下培養(yǎng)2d，兩天后降溫至10℃，繼續(xù)培養(yǎng) 3d，再升溫 15、20℃各培養(yǎng) 2d，溫度升降反復(fù)循環(huán)2次，馴化期間保證富集培養(yǎng)基量不少于90mL。

采用稀釋法將富集培養(yǎng)液接種于CMC培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平等樣，放入10℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并記錄各平板菌株生長(zhǎng)狀況，反復(fù)使用平板劃線法分離純化后，從中篩選出長(zhǎng)勢(shì)較好的39株纖維素降解菌。

1.2.2 剛果紅初篩 將分離純化后的每個(gè)菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)3d。測(cè)量各菌株菌落直徑（d）及其產(chǎn)生的透明圈直徑（D）大小，以D/d值作為判斷依據(jù)，進(jìn)行初篩，留下D/d值較大菌株進(jìn)一步研究[1]。最終選擇7株菌進(jìn)行復(fù)篩及其他秸稈降解效果測(cè)定。

1.2.3 濾紙條復(fù)篩 將上述實(shí)驗(yàn)中效果較好的7株菌株分別接種至加入新華濾紙條的崩解培養(yǎng)基中，以不接種菌只加濾紙條的崩解培養(yǎng)基作為對(duì)照，15℃培養(yǎng)2周，觀察濾紙條的潰爛和崩解情況，根據(jù)濾紙條的降解重量來(lái)判斷菌株降解纖維素能力的強(qiáng)弱[2]。

1.2.4 秸稈降解效果測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量為10g的玉米秸稈，將其粉碎，向其中加入20mL無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液，并攪拌均勻，將其平鋪于淺盤(pán)中，向其中接種0.3%的菌液48mL，蓋上濕布，恒溫20℃培養(yǎng)15d，期間保持蓋布濕潤(rùn)。15d后將殘留物置于105℃烘箱中烘干至恒重，并稱(chēng)量其的質(zhì)量，按下面公式計(jì)算其秸稈降解率。

1.2.5 生化特性測(cè)定實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 淀粉水解能力測(cè)定 在以2%可溶性淀粉為唯一碳源的淀粉培養(yǎng)基上分別接種7株菌株，置于15℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。在平板上滴入碘液，根據(jù)水解圈的有無(wú)與大小，初篩淀粉酶產(chǎn)生菌。通過(guò)計(jì)算水解圈面積與接種菌落面積之比，判斷淀粉酶降解能力。

1.2.5.2 濾紙條酶活能力測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取25mL具塞刻度試管6支，加入1.0mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，加蒸餾水 2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0mL，加DNS試劑1.5mL，混勻后在沸水浴中加熱5min，取出立即用冷水冷卻，定容至25mL，搖勻，測(cè)吸光度A，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）待測(cè)酶液制備 將酶液倒入離心試管中，離心5min，用移液槍吸取1mL上清液移至比色管中。

（3）準(zhǔn)備 待用濾紙放入干燥器中平衡24h；將平衡后的濾紙制成寬1cm、質(zhì)量為（50±5）mg的濾紙條，折成M備用。

（4）測(cè)定 取0.5mL稀釋酶液，加入HAc-NaAc緩沖溶液1mL。再加入折好濾紙于50℃保溫酶解反應(yīng)1h。再加入DNS顯色劑3mL，放入沸水浴中10min，流水冷卻后，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。同時(shí)用100℃煮沸10min后失活的酶液作對(duì)比，扣除本底值[3]。

1.2.5.3 CMC酶活能力測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 繪制方法如1.2.5.2（1）。

（2）待測(cè)酶液制備 制備方法如1.2.5.2（2）。

（3）測(cè)定 取1.5mL CMC-Na溶液與0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液于25mL試管中，40℃水浴保溫30min后即加1.5mL DNS顯色劑，沸水煮沸5min，取出即冷卻，定容至25mL，在540mm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 秸稈降解菌的篩選

2.1.1 秸稈降解菌的初篩 經(jīng)過(guò)土壤富集及CMC培養(yǎng)基篩選后，篩選出7株降解纖維素的細(xì)菌，并將這些菌株進(jìn)一步培養(yǎng)觀察，在CMC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 在CMC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Olony morphology on CMC medium

在15℃下，剛果紅培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后測(cè)定水解圈直徑和菌落直徑，照片見(jiàn)圖2，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

圖2 在剛果紅培養(yǎng)基上的水解圈Fig.2 Hydrolysis circle on Congo red medium

表1 纖維素-剛果紅水解實(shí)驗(yàn)Tab.1 Hydrolysis experiment of cellulose Congo red

由圖1，2可見(jiàn)，7株菌均能在剛果紅培養(yǎng)基中的進(jìn)行水解，水解程度不同，水解圈大小不同，由水解圈的直徑與菌落的直徑的比值，可表明該菌株對(duì)纖維素降解能力的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)表明，7株菌在低溫下都能利用纖維素為唯一碳源生長(zhǎng)，其中1#的菌株產(chǎn)生的水解圈直徑與菌落直徑的比值最大，顯示出其對(duì)纖維素降解效果最為明顯，其次為7#菌株。

2.1.2 秸稈降解菌的復(fù)篩 利用濾紙條崩解培養(yǎng)基在15℃下培養(yǎng)2周，觀察濾紙崩解情況，濾紙崩解實(shí)驗(yàn)前后對(duì)比見(jiàn)圖3，并記錄濾紙前后重量。表2為濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

圖3 濾紙崩解實(shí)驗(yàn)前后對(duì)比Fig.3 Comparison of filter paper disintegration experiments

表2 濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)Tab.2 Disintegration test of filter strip

結(jié)果顯示，濾紙崩解實(shí)驗(yàn)2周后，各供試濾紙均有5%以上的失重率，其中5#和7#試樣菌株降解前后濾紙質(zhì)量變化最大，達(dá)到14%以上的失重率，其次是6#和3#試樣，失重率達(dá)10%以上。

2.2 秸稈降解效果測(cè)定

以農(nóng)田秸稈粉碎物為樣品，進(jìn)行秸稈低溫條件下降解實(shí)驗(yàn)，來(lái)測(cè)定各菌株其對(duì)秸稈的降解能力。

表3 秸稈降解效果測(cè)定Tab.3 Determination of straw degradation effect

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各菌株在低溫條件下，對(duì)秸稈均有一定的降解能力，反應(yīng)15d后，7#菌和1#菌的降解率都在4%以上，其次是4#菌。

2.3 生化特性的測(cè)定

2.3.1 淀粉水解能力測(cè)定 淀粉有遇碘變藍(lán)的特性，在淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中滴入碘液可使培養(yǎng)基變色。而具有淀粉降解能力的細(xì)菌在分解淀粉時(shí)會(huì)產(chǎn)生葡萄糖或者是麥芽糖，破壞掉淀粉的結(jié)構(gòu)，形成水解圈，淀粉被水解，此時(shí)滴入碘液后則不變色。菌株對(duì)淀粉的分解能力越強(qiáng)，水解圈越大，所以可通過(guò)水解圈D與菌落直徑d的比值來(lái)確定細(xì)菌對(duì)淀粉的水解能力的大小。

表4 淀粉水解能力的測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of starch hydrolysis ability

實(shí)驗(yàn)表明，篩選出的7株菌對(duì)淀粉均有一定的降解能力，其中7#菌的菌落的淀粉降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)要大于其他菌落，其次是4#菌、1#菌和2#菌。

2.3.2 濾紙條酶活能力測(cè)定 分別對(duì)在15和30℃下培養(yǎng)的菌液進(jìn)行濾紙條酶活測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 濾紙條酶活能力測(cè)定Tab.5 Determination of enzyme activity of filter paper

實(shí)驗(yàn)表明，7株菌在15和30℃下，均具有濾紙酶活，且在15℃下酶的活性明顯高于30℃下酶的活性，顯示出良好的低溫特性。其中，1#菌、5#菌在15和30℃條件下酶的活性好于其它菌株，4#菌、7#菌在15℃時(shí)酶的活性也比較好。

2.3.3 CMC酶活能力測(cè)定 采用DNS法分別對(duì)在15和30℃下培養(yǎng)的7株菌液進(jìn)行CMC酶活測(cè)定。

表6 CMC酶活測(cè)定Tab.6 CMC enzyme activity determination

測(cè)定結(jié)果表明，7株菌在15和30℃下，均有CMC酶活，且在15℃下酶的活性明顯高于30℃下酶的活性，顯示出良好的低溫特性。2#菌在15℃下對(duì)羧甲基纖維素的降解效果更為突出，為23U·mL-1，30℃最大值為 2#菌株的 0.13U·mL-1。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)東北地區(qū)春、秋、冬季節(jié)寒冷的特點(diǎn)，在低溫條件下，經(jīng)過(guò)馴化和富集，剛果紅培養(yǎng)基初步篩選得到低溫秸稈降解菌7株。利用濾紙條復(fù)篩，通過(guò)計(jì)算失重率得知5#和7#菌株降解纖維素能力最強(qiáng)。在秸稈降解效果測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，5#和7#菌株降解秸稈的效果相比之下也最為明顯。

對(duì)篩選出來(lái)的7株菌株進(jìn)行了生化特性的測(cè)定。淀粉水解能力最強(qiáng)的是7#菌株，D/d為15，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌株。在濾紙條酶活和CMC酶活實(shí)驗(yàn)中，7株菌在15℃下酶的活性明顯高于30℃下酶的活性，顯示了它們顯著的低溫菌的特性。

在實(shí)際的秸稈降解過(guò)程中，更多的是多種菌的協(xié)同作用，所以需要進(jìn)一步進(jìn)行混合菌群的實(shí)效研究，來(lái)提高秸稈類(lèi)農(nóng)田廢棄物的降解效率。