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      基于對照制劑和UPLC的牛黃清胃丸中黃柏的質(zhì)量評價

      2020-03-10 03:24:36查祎凡聶黎行于健東馬雙成
      食品與藥品 2020年1期
      關(guān)鍵詞:牛黃小檗制劑

      查祎凡,聶黎行,于健東,張 毅,戴 忠,馬雙成

      (1.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050;2.中國藥科大學(xué),江蘇 南京 211198;3.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶 401121)

      牛黃清胃丸收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第一冊》,由牛黃、大黃、菊花、麥冬、薄荷、石膏、梔子、玄參、番瀉葉、黃芩、甘草、冰片等17味中藥組成,具有清胃瀉火、潤燥通便的作用,用于心胃火盛,頭暈?zāi)垦?,口舌生瘡,牙齦腫痛,乳蛾咽痛,便秘尿赤[1]?,F(xiàn)行標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第一冊》,除性狀外,僅收載了顯微鑒別項。制劑中的黃柏為臣藥,輔助牛黃清瀉胃熱的功效,鹽酸小檗堿是其主要活性成分[2-4]。本文創(chuàng)新性地將對照制劑引入中成藥的質(zhì)量評價,建立了超高效液相色譜(UPLC)測定牛黃清胃丸中鹽酸小檗堿含量的方法,同時研制了牛黃清胃丸對照制劑,對其在生產(chǎn)過程中黃柏的轉(zhuǎn)移進行了考察,提出了相對客觀、可行的限度,可望為含黃柏原粉制劑的質(zhì)量優(yōu)劣區(qū)分提供示范和參考。

      1 儀器與試藥

      1.1 儀器

      AE240(十萬分之一)電子天平,F(xiàn)X-200(萬分之一)電子天平(瑞士Mettle Toledo公司);ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀,Empower工作站(美國Waters公司);Milli-Q型超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

      1.2 材料

      分析純甲醇,鹽酸(北京化學(xué)試劑公司);硅藻土(北京化學(xué)試劑公司)。乙腈(色譜純,德國 Merck 公司);水為超純水;鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-201814),人工牛黃對照藥材(批號:121197-201204),大黃對照藥材(批號:120902-201311),菊花對照藥材(批號:121384-201504),麥冬對照藥材(批號:121013-201310),薄荷對照藥材(批號:120916-201310),梔子對照藥材(批號:120986-201610),玄參對照藥材(批號:121008-201609),番瀉葉對照藥材(批號:120996-201205),黃芩對照藥材(批號:120955-201309),甘草對照藥材(批號:120904-201620),桔梗對照藥材(批號:121028-201612),連翹對照藥材(批號:120908-201216),冰片對照品(批號:111688-201602),牽牛子對照藥材(批號:121024-201606),枳實對照藥材(批號:120936-201606,中國食品藥品檢定研究院);石膏(北京華邈藥業(yè)),由中國食品藥品檢定研究院聶黎行副研究員鑒定為石膏;牛黃清胃丸對照制劑由中國食品藥品檢定研究院按大生產(chǎn)規(guī)模自行研制,其中黃柏原料來自北京同仁堂潤豐醫(yī)藥有限公司;煉蜜(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠)。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

      色譜柱:AQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);檢測波長:265 nm;柱溫:35 ℃;流速:0.2 ml/min;進樣量:2 μl;流動相:乙腈-水(每100 ml加十二烷基硫酸鈉0.2 g)(50:50,v/v,用磷酸調(diào)pH至2)。上述色譜條件下,理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計應(yīng)不少于5000,與相鄰峰分離度應(yīng)>1.5。

      2.2 溶液的制備

      2.2.1 對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿對照品適量,精密稱定,加1 %鹽酸甲醇制成每1 ml含0.12 mg的溶液,作為對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液適量,逐級稀釋制得濃度分別為0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mg/ml的系列對照品溶液。

      2.2.2 供試品溶液制備 取牛黃清胃丸1.0 g,精密加入1 %鹽酸甲醇50 ml,85 ℃加熱回流1 h,放冷,用1 %鹽酸甲醇溶液補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

      2.2.3 陰性對照溶液 取人工牛黃、大黃、菊花、麥冬、薄荷、梔子、玄參、番瀉葉、黃芩、甘草、桔梗、連翹、牽牛子、枳實對照藥材,冰片對照品,石膏,按處方比例制備缺黃柏的陰性空白樣品,并按2.2.2項下方法制成陰性對照溶液。

      2.3 測定法

      取系列對照品溶液和供試品溶液,按2.1項下色譜條件進樣,標準曲線法測定供試品中鹽酸小檗堿的含量。

      2.4 專屬性試驗

      取2.2項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量,按2.1項下色譜條件進樣測定,記錄色譜,詳見圖1。結(jié)果表明,牛黃清胃丸在鹽酸小檗堿的保留時間處無其他成分干擾。

      圖1 UPLC色譜圖

      2.5 線性關(guān)系考察

      分別精密量取對照儲備液適量,逐級稀釋制得濃度分別為0.02,0.04,0.06,0.08,0.12 mg/ml的系列對照品溶液,進樣測定,以濃度為橫坐標x,峰面積為縱坐標y,繪制標準曲線,并進行線性回歸,結(jié)果鹽酸小檗堿在0.02~0.12 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程為y=2.42×107x-7.40×105,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9999。

      2.6 定量限與檢出限

      取精密量取濃度為1 mg/L的對照品溶液適量,稀釋至不同濃度,進樣測定,測得檢出限(信噪比3:1)為0.22 μg/ml,定量限(信噪比10:1)為0.90 μg/ml。

      2.7 精密度試驗

      精密吸取2.2.1項下對照品溶液,按2.1項下色譜條件重復(fù)進樣6次,測定鹽酸小檗堿的峰面積。結(jié)果,鹽酸小檗堿峰面積的RSD為2.23 %(n=6),表明儀器的精密度良好。

      2.8 穩(wěn)定性試驗

      取牛黃清胃丸樣品(批號:17013549)適量,按2.2.2項下方法制備供試品溶液,于室溫下放置,按2.2.2項下方法制備供試品溶液,于室溫下放置0,1,2,4,6,8 h,按2.1項下色譜條件進樣,測定鹽酸小檗堿的峰面積。結(jié)果,其峰面積的RSD為1.93 %(n=6),表明室溫條件下供試品溶液中的鹽酸小檗堿在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

      2.9 重復(fù)性試驗

      取牛黃清胃丸樣品(批號:17013549)適量,按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液,按2.1項下色譜條件進行含量測定。結(jié)果,鹽酸小檗堿的含量為1.46 mg/g,RSD為1.37 %(n=6),表明本方法的重復(fù)性良好。

      2.10 加樣回收率試驗

      取鹽酸小檗堿對照品適量,精密稱定,加1 %鹽酸甲醇制成每1 ml含0.93 mg的溶液,分成6份,每份1 ml,分別置于圓底燒瓶中,低溫揮干,取已知含量的牛黃清胃丸樣品(批號:17013549)內(nèi)容物約0.5 g,精密稱定6份,分別加入上述圓底燒瓶中,按2.2.2項下方法制得所需供試品溶液,再按2.1項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率,結(jié)果詳見表1。

      表1 牛黃清胃丸加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

      表2 牛黃清胃丸樣品含量測定結(jié)果(n=2)

      2.11 樣品含量測定

      取49批牛黃清胃丸和1批對照制劑各適量,分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液,并按2.1項下色譜條件進樣,測定鹽酸小檗堿的峰面積,采用標準曲線法計算含量,每批樣品平行操作2次,結(jié)果詳見表2。

      2.12 基于對照制劑的等級限度制訂

      根據(jù)《中國藥典》的規(guī)定、對照制劑和實測樣品的含量,對18個廠家、49批樣品進行等級評定。為直觀顯示不同廠家各批次樣品鹽酸小檗堿的含量差異,做圖2。

      圖2 牛黃清胃丸樣品含量測定結(jié)果

      《中國藥典》2015年版一部規(guī)定黃柏“含小檗堿以鹽酸小檗堿計,不得少于3.0 %”,其中水分項規(guī)定“不得超過12.0 %”[5]。取牛黃清胃丸對照制劑投料用黃柏,依法測定鹽酸小檗堿含量,結(jié)合對照制劑中鹽酸小檗堿含量及黃柏在處方中所占比例,計算得到牛黃清胃丸對照制劑中鹽酸小檗堿在生產(chǎn)過程中的轉(zhuǎn)移率為98 %。根據(jù)牛黃清胃丸中的黃柏藥材含量折算相對應(yīng)的鹽酸小檗堿理論含量,得二等制劑的鹽酸小檗堿限度為0.74 mg/g,即使用符合藥典規(guī)定的藥材足量投料應(yīng)達到的含量。暫定對照制劑鹽酸小檗堿含量的70 %(1.34 mg/g)為一等限度,即使用優(yōu)質(zhì)藥材足量投料達到的含量。按上述擬定限度判斷,所有批次樣品都達到二等限度,29批次樣品達到一等限度。

      3 討論

      3.1 提取溶劑的選擇

      根據(jù)黃柏藥材與其他含黃柏的中成藥中鹽酸小檗堿含量測定的文獻[6-9],采用甲醇、1 %甲酸和1 %鹽酸甲醇作為提取溶劑。結(jié)果表明,采用1 %鹽酸甲醇溶液作為提取溶劑時,提取效率最高,故選定1 %鹽酸甲醇溶液為本試驗的提取溶劑。

      3.2 提取方式的考察

      對超聲和熱回流兩種提取方式進行考察,結(jié)果顯示熱回流提取效率更高。對不同熱回流時間30,45,60,75 min進行考察,75 min的提取效率相比60 min的提取效率不再顯著增加。故選擇熱回流60 min作為本試驗的提取方式。對熱回流溫度進行考察,結(jié)果顯示85 ℃下,提取溶劑能保持微沸狀態(tài),冷凝管回流液體滴速適中。

      3.3 測定方法的選擇

      與傳統(tǒng)的HPLC相比,UPLC具有分離度高、檢測速度快、溶劑消耗少、靈敏度高的特點。由于本試驗只測定一種成分的含量,故選擇UPLC,有利于減少分析時間與溶劑消耗,建立快速的測定方法。

      3.4 色譜柱的選擇

      因牛黃清胃丸處方量較大,成分干擾較多,參考其他文獻[10],采用親水作用色譜對鹽酸小檗堿進行含量測定。但由于提取溶劑酸性較強,導(dǎo)致親水作用色譜下鹽酸小檗堿色譜峰出現(xiàn)分叉,故無法選用。改用適用于較大pH范圍的反相色譜柱。

      3.5 流動相的選擇

      參考文獻[11],選用0.5 %甲酸乙腈-0.5 %甲酸水作為流動相,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿峰形拖尾嚴重。參考文獻[12],選用乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(用磷酸調(diào)pH至3)作為流動相,在鹽酸小檗堿峰附近,基線不平穩(wěn)。參考文獻[13],選用乙腈-水(每100 ml加十二烷基硫酸鈉0.2 g)(用磷酸調(diào)pH至3)作為流動相,基線平穩(wěn),峰形較好,調(diào)整pH為2,分離效果最佳。

      3.6 對照制劑的意義

      中藥對照制劑作為中藥標準物質(zhì)的新形式,系指采用道地、優(yōu)質(zhì)、規(guī)范加工的原料藥材(飲片)和輔料,嚴格按照制法和生產(chǎn)工藝規(guī)程,并遵循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范制備的實物對照,主要用于中成藥的質(zhì)量控制,評價產(chǎn)品投料的真實性(是否投正確的原料)和投料量的可靠性(是否按處方量投料)[14]。將對照制劑引入中成藥等級評價限度的制訂,可得到藥材有效成分轉(zhuǎn)移率及相對優(yōu)質(zhì)制劑的含量等關(guān)鍵信息,保證限度設(shè)置的合理性。

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