受體光漂白FRET技術(shù)的實(shí)踐與優(yōu)化

劉雙雙，王 君，尹 偉，婁繪芳

（1.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái)，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué) 浙江大學(xué)校醫(yī)院，浙江 杭州 310058）

蛋白質(zhì)間的相互作用是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者，對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)具有重要意義。許多經(jīng)典的生物化學(xué)方法用于闡明這種相互作用，如免疫共沉淀、酵母雙雜交等，但這些方法卻無法檢測(cè)細(xì)胞中發(fā)生的較弱或瞬態(tài)相互作用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)克服了光學(xué)分辨率的限制，能夠精確檢測(cè)蛋白質(zhì)間的相互作用。具體是指當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離小于10 nm 時(shí)，基團(tuán)之間的能量通過偶極-偶極耦合作用，以非輻射方式從供體傳遞給受體的現(xiàn)象。所以FRET 技術(shù)適合研究幾納米內(nèi)相鄰兩個(gè)分子之間的相互作用[1]。

利用顯微鏡建立的FRET 技術(shù)的4 種方法為光譜成像法、受體光漂白法、敏化發(fā)射法和熒光壽命法。其中受體光漂白法不受光滲透的影響，可重復(fù)性高，是建立FRET 技術(shù)的常用方法[2-3]。但此方法對(duì)圖像采集和漂白效率具有嚴(yán)格的要求，只有通過優(yōu)化設(shè)置，才能檢測(cè)到蛋白質(zhì)之間微弱的相互作用。本文利用Olympus FV1000 共聚焦顯微鏡介紹受體光漂白法FRET 技術(shù)的實(shí)現(xiàn)方式及優(yōu)化方法，并詳細(xì)闡述了圖像展示和數(shù)據(jù)分析的具體方法。

1 FRET 熒光對(duì)的選擇

理想的FRET 體系需要樣本標(biāo)記一對(duì)熒光基團(tuán)，這對(duì)熒光基團(tuán)通常稱為供體-受體熒光對(duì)，需同時(shí)滿足以下條件：①供體熒光團(tuán)的發(fā)射光譜與受體熒光團(tuán)的激發(fā)光譜具有重疊（＞30%）且供體的激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)受體無影響。②供體和受體的熒光團(tuán)彼此緊密相鄰（通常為1～10 nm）。③供體和受體的偶極子電極方向大致平行[4-5]。

由熒光團(tuán)和傳感域組成的FRET 生物傳感器廣泛用來監(jiān)測(cè)鄰近分子的變化。根據(jù)兩個(gè)熒光團(tuán)是否連接到同一分子上，將FRET 生物傳感器分為兩大類：①分子內(nèi)類型，供體和受體熒光團(tuán)與同一分子相連，分子中構(gòu)象變化誘導(dǎo)產(chǎn)生FRET 現(xiàn)象，可用來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+、cAMP 活性和激酶活性。②分子間類型，供體和受體熒光團(tuán)融合到不同的分子上，當(dāng)兩個(gè)分子非常接近時(shí)產(chǎn)生FRET 現(xiàn)象，如檢測(cè)受體的寡聚化。選擇高性能的生物傳感器是建立FRET 體系的關(guān)鍵[6-7]。

FRET 生物傳感器中的熒光團(tuán)主要有3 種類型：熒光蛋白、小型有機(jī)染料和量子點(diǎn)（QDs）。目前，遺傳編碼的熒光蛋白是高分辨率成像的最佳選擇之一，已有多種基因改造的熒光蛋白用做FRET 熒光對(duì)，通過轉(zhuǎn)染或者病毒感染的方式進(jìn)入到體內(nèi)或體外細(xì)胞，通過顯微鏡檢測(cè)FRET 效率，應(yīng)用較多的有ECFP-EYFP、GFP-RFP 等[8]。但熒光蛋白發(fā)射光譜的半高寬為60 nm，甚至超過100 nm，容易產(chǎn)生受體和供體無法分離的重疊現(xiàn)象。因此，熒光蛋白的光譜分布限制了其應(yīng)用。相比之下，許多合成染料的發(fā)射光譜半高寬度為30～40 nm，在測(cè)量受體熒光時(shí)，供體的串色干擾較少。尤其是紅色激發(fā)染料（如CY3-CY5）不僅具有更高的光子記數(shù)，而且時(shí)間壽命長(zhǎng)，在生物研究中同樣具有較高的應(yīng)用價(jià)值。但是染料在沒有抗體幫助的情況下，不具有標(biāo)記感應(yīng)域的能力。量子點(diǎn)可用于標(biāo)記膜成分以檢查質(zhì)膜外部的現(xiàn)象，這些探針無法穿透膜，因此在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如核、線粒體、高爾基體）中很少使用[9]。

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇熒光對(duì)的主要標(biāo)準(zhǔn)是F?rster半徑r0，是指發(fā)生50% FRET 效率時(shí)熒光對(duì)的特征距離，根據(jù)供體-受體的光譜和偶極子定向參數(shù)計(jì)算得出，其范圍約為3～8 nm。FRET 效率隨著F?rster 半徑、光譜重疊、供體的量子產(chǎn)率、受體的消光系數(shù)增加而增大。此外還受到水溶性、抗干擾能力等方面的影響。表1 列出了常用FRET 對(duì)的特性[5]。除了待測(cè)樣本標(biāo)記符合要求的熒光對(duì)外，還需要設(shè)定嚴(yán)格的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以確保顯微鏡系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

表1 常用FRET 對(duì)及其特性

2 受體光漂白FRET 技術(shù)的建立

受體光漂白法是由發(fā)生FRET 現(xiàn)象時(shí)，抑制供體發(fā)射熒光的事實(shí)建立起來的方法。對(duì)受體進(jìn)行光漂白，能量轉(zhuǎn)移受到抑制，供體的熒光信號(hào)增強(qiáng)[1]。通過檢測(cè)供體熒光的增強(qiáng)計(jì)算FRET 效率。本文以供體為CFP、受體為YFP 的熒光對(duì)為例，利用Olympus FV1000 共聚焦顯微鏡建立FRET 技術(shù)，操作流程和步驟如圖1 所示。

2.1 設(shè)置圖像采集參數(shù)

采集圖像的原則是在保證圖像質(zhì)量的基礎(chǔ)上，盡量減少采集時(shí)間。在FV10-ASW 軟件主界面下，從染料庫(kù)（dyelist）里選擇熒光對(duì)，設(shè)置熒光光路。通過focus X2 或者focus X4 預(yù)掃描圖像，適當(dāng)調(diào)節(jié)激光通過率，光電倍增管電壓值HV 和增益offset 等參數(shù)，使圖像達(dá)到最佳信噪比狀態(tài)。為了得到高質(zhì)量圖像，可通過“Ctrl+H”快捷鍵切換到HiLo 模式，查看圖像信號(hào)強(qiáng)度，信號(hào)過強(qiáng)或過弱都無法得到理想結(jié)果。

2.2 設(shè)置光刺激參數(shù)

刺激參數(shù)是否合適是FRET 技術(shù)成敗的關(guān)鍵。設(shè)置流程如下：打開“刺激（Stimulation）”窗口，選擇主掃描器，設(shè)置刺激區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)細(xì)胞內(nèi)畫出的感興趣區(qū)域，刺激速度為10 μs/pix、刺激光透過率為80%～ 100%。選擇刺激程序（Activation in Series），通過“采 集—刺激—刺激后采集”的方式實(shí)現(xiàn)受體漂白程序，設(shè)置刺激前采集圖像3～5 張，刺激時(shí)間3～10 s。

圖1 光漂白FRET 技術(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖

完整的FRET 圖像采集需要使用共聚焦顯微鏡的時(shí)間序列掃描功能，在時(shí)間序列掃描時(shí)，設(shè)置時(shí)間間隔及獲取的圖像張數(shù)。其方法如下：在軟件主界面下，點(diǎn)擊“Image Acquisition”下面的“Time”按鈕進(jìn)行時(shí)間序列掃描，設(shè)置圖像采集幀數(shù)20 張，時(shí)間間隔為“Freedom”。然后點(diǎn)擊“Capture”按鈕運(yùn)行上述程序。軟件將會(huì)按照“刺激前采集圖像3～5 張—光刺激3～ 10 s—刺激后采集圖像15～17 張”的程序運(yùn)行，結(jié)束后點(diǎn)擊“Series Done”按鈕獲得FRET 序列圖像。

3 受體光漂白FRET 技術(shù)的優(yōu)化

為了得到真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)，獲取FRET 圖像時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)：首先，受體發(fā)生光漂白的同時(shí)不會(huì)降低供體熒光強(qiáng)度；其次，受體漂白后熒光值達(dá)到初始值的10%；最后，受體和供體的熒光信號(hào)不宜過強(qiáng)或過弱。如果圖像采集或者光刺激設(shè)置不當(dāng)，將檢測(cè)不到FRET 現(xiàn)象，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)和探索，通過在以下方面進(jìn)行優(yōu)化，建立了一套穩(wěn)定實(shí)用的方法。

3.1 圖像采集優(yōu)化措施

圖像采集時(shí)優(yōu)化方式：①采集圖像時(shí)，掃描速度盡量快以減少長(zhǎng)時(shí)間照射對(duì)供體的光漂白，所以掃描尺寸設(shè)為512×512 pix，掃描速度為2 μs/pix。②供體的激發(fā)光能量盡量低，激光設(shè)置在5%以內(nèi)，以減少采集圖像過程中供體發(fā)生的光漂白現(xiàn)象。③為防止受體漂白后供體熒光值達(dá)到飽和，采集圖像時(shí)，供體的在熒光強(qiáng)度保持在1 000～2 000 范圍內(nèi)最佳。受體YFP熒光強(qiáng)度在2 000～4 000 范圍內(nèi)最佳，在這個(gè)范圍內(nèi)進(jìn)行光刺激后，如有FRET 現(xiàn)象，供體的熒光增強(qiáng)將更加明顯。④選擇數(shù)值孔徑較大的物鏡。物鏡對(duì)于圖像的分辨率具有較大的影響，不同物鏡的數(shù)值孔徑不一致，光子匯聚能力也不一樣。數(shù)值孔徑大的物鏡，受體的漂白效率高，供體信號(hào)增強(qiáng)也更明顯。⑤適當(dāng)增大針孔，每個(gè)鏡頭對(duì)應(yīng)的針孔大小不一致，但都有一個(gè)最佳推薦值，建議將針孔增大到推薦值的2 倍及以上，增大針孔后，對(duì)應(yīng)的供體和受體的熒光信號(hào)增強(qiáng)。為了達(dá)到合適的熒光強(qiáng)度，需要降低供體和受體激發(fā)光的透過率，不僅可減少隨時(shí)間變化產(chǎn)生的供體光漂白，而且可增加待測(cè)樣品z軸的熒光信息（即增加采樣厚度），使FRET 現(xiàn)象更加明顯。

3.2 受體光刺激優(yōu)化措施

受體光刺激時(shí)優(yōu)化方式如下：①配合物鏡，選擇充分發(fā)揮物鏡分辨率的ZOOM 值掃描圖像，不僅可以增加圖像分辨率，還可以在同樣的刺激時(shí)間內(nèi)增加受體漂白效率。以60XO（60 倍油鏡）為例，ZOOM 值推薦為2。②為防止供體熒光受刺激光的影響，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)拇碳す饽芰浚炔划a(chǎn)生過漂白（漂白效率達(dá)100%）也不會(huì)使漂白效率太低。如發(fā)生過漂白，供體容易受到刺激光的影響，信號(hào)變?nèi)?；如漂白效率過低，供體的信號(hào)變化也不明顯。漂白效率達(dá)90%為佳。③受體光漂白FRET 技術(shù)適合用于固定細(xì)胞樣品，由于強(qiáng)激光能量對(duì)活細(xì)胞具有高毒性，同時(shí)活細(xì)胞容易發(fā)生漂白后恢復(fù)現(xiàn)象，所以不適合在活細(xì)胞中應(yīng)用。

4 圖像展示和分析

FRET 現(xiàn)象通過顯微圖像或者FRET 效率進(jìn)行展示。FRET 效率E是指能量從供體轉(zhuǎn)移到受體的百分比，與蛋白間距離的關(guān)系滿足式（1）。其中r是供體和受體偶極之間的距離，r0是F?rster 半徑[10-11]。

4.1 FRET 圖像展示

待測(cè)樣本進(jìn)行受體光漂白后，如有FRET 現(xiàn)象發(fā)生，供體不再發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，圖像上表現(xiàn)出受體熒光明顯增強(qiáng)的現(xiàn)象。HECK293 細(xì)胞共同轉(zhuǎn)染CFF 和YFP質(zhì)粒（表示為CFP+YFP），CFP 和YFP 分別表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)的不同位置，因距離較遠(yuǎn)，受體光漂白后，供體熒光信號(hào)沒有明顯增加（見圖2），無FRET 現(xiàn)象產(chǎn)生，通常作為陰性對(duì)照。HECK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染由CFP 和YFP 組成的構(gòu)建體（表示為CFP-YFP），因CFP 和YFP緊密連在一起，符合共振能量轉(zhuǎn)移的條件，在受體感興趣區(qū)域漂白后供體的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（見圖3），產(chǎn)生FRET 現(xiàn)象，通常作為陽(yáng)性對(duì)照。圖2(a)和3(a)分別為共轉(zhuǎn)染和構(gòu)建體轉(zhuǎn)染受體漂白后供體的熒光圖像，圖2(b)和3(b)分別為共轉(zhuǎn)染和構(gòu)建體轉(zhuǎn)染光漂白受體感興趣區(qū)域，圖2(c)和3(c)分別為共轉(zhuǎn)染和構(gòu)建體轉(zhuǎn)染受體光漂白后供體的偽彩色圖像，供體熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象在偽彩色圖像中更加明顯。

圖2 CFP 和YFP 共轉(zhuǎn)染受體光漂白FRET 圖像

圖3 CFP-YFP 構(gòu)建體轉(zhuǎn)染受體光漂白FRET 圖像

4.2 計(jì)算FRET 效率

通過量化受體漂白前后供體熒光強(qiáng)度的變化計(jì)算FRET 效率E，即E=1-(Ipre/Ipost)，其中Ipre和Ipost分別是光漂白前后供體的熒光強(qiáng)度。這是一種非常典型的方法，不依賴于圖像采集參數(shù)的變化，也不依賴供體和受體量子產(chǎn)率和光譜滲透的干擾，因此不需要校正[12]。HECK293 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染CFP 和YFP 后測(cè)得的FRET 效率為0.035，轉(zhuǎn)染CFP-YFP 構(gòu)建體后測(cè)得的FRET 效率為0.208（見圖4）。

圖4 FRET 效率計(jì)算結(jié)果

FRET 效率計(jì)算可通過 ImageJ、cellSense 和Metamorph 等圖像處理軟件實(shí)現(xiàn)。以下為利用ImageJ軟件測(cè)量FRET 效率的具體實(shí)現(xiàn)方法。

（1）測(cè)量供體通道中背景熒光強(qiáng)度：用ImageJ 選擇工具選擇無細(xì)胞信號(hào)的背景區(qū)域并測(cè)量熒光強(qiáng)度。

（2）去掉供體通道中的背景：在Process 菜單下選擇Math-Subtract，減去第一步中得到的背景熒光強(qiáng)度。

（3）測(cè)量漂白前后供體感興趣區(qū)域（ROI）的熒光強(qiáng)度：用ImageJ 選擇工具選擇供體內(nèi)感興趣區(qū)域，即受體所對(duì)應(yīng)的光漂白區(qū)域；利用ImagJ 的插件Time Series Analyzer 測(cè)量光漂白前后供體ROI 內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。

（4）計(jì)算FRET 效率：漂白后供體熒光強(qiáng)度減去漂白前供體熒光強(qiáng)度；然后用漂白后熒光強(qiáng)度做歸一化處理，得到FRET 效率；最后從多個(gè)ROI 區(qū)域得到不同的FRET 效率后，求出平均值。

（5）作為對(duì)照，選擇細(xì)胞內(nèi)沒有漂白區(qū)域的同樣大小的ROI，測(cè)量熒光強(qiáng)度。設(shè)置多個(gè)對(duì)照區(qū)域的ROI，求出FRET 效率平均值。

（6）評(píng)價(jià)漂白區(qū)域是否有FRET 現(xiàn)象產(chǎn)生：當(dāng)FRET 現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，得到的FRET 效率結(jié)果在10%～ 40%。

5 結(jié)語(yǔ)

1946 年，熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論首次被Theodor F?rster 闡明，所以也稱F?rster 能量轉(zhuǎn)移，20 世紀(jì)80年代，F(xiàn)RET 技術(shù)成功運(yùn)用到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中。在過去十年中，由于顯微鏡技術(shù)的發(fā)展和優(yōu)化的熒光蛋白及其衍生物的增加，F(xiàn)RET 技術(shù)已在生物大分子相互作用、核酸結(jié)構(gòu)功能檢測(cè)、免疫分析等方面具有廣泛的應(yīng)用[13-15]。

利用顯微鏡建立FRET 技術(shù)有多種方法，其中受體光漂白法僅需要目標(biāo)樣本，不需要大量的校準(zhǔn)樣本，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果可重復(fù)性高，方法簡(jiǎn)單可靠，應(yīng)用廣泛。主要缺點(diǎn)是光漂白具有破壞性，每個(gè)細(xì)胞只能使用一次，光漂白是一個(gè)相對(duì)緩慢的過程，通常需要幾秒鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，活細(xì)胞漂白后容易發(fā)生熒光恢復(fù)現(xiàn)象，因此較少應(yīng)用于活細(xì)胞動(dòng)態(tài)測(cè)量實(shí)驗(yàn)。此外，如果受體-供體熒光對(duì)的偶極子電極方向不同或它們不位于F?rster 半徑內(nèi)，則FRET 效率明顯降低。例如，如果兩個(gè)標(biāo)記的蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用，但熒光標(biāo)簽位于復(fù)合物的對(duì)立面，則可能無法檢測(cè)到FRET 現(xiàn)象。在實(shí)際操作中，這種假陰性現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生[16]。所以，在檢測(cè)到足夠可靠的FRET 信號(hào)之前，需要進(jìn)行多種標(biāo)記策略，多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。