轉化生長因子-β1與乳腺病變彈性特征的相關性

張孟珂，王知力，劉愿，何艷

解放軍總醫(yī)院超聲診斷科，北京 100853；*通訊作者 王知力 wzllg@sina.com

乳腺癌居我國女性惡性腫瘤的首位，嚴重危害女性健康。乳腺癌早期診斷的5年生存率可達95%[1]，因而早期診斷成為迫切需求。多項研究表明，剪切波彈性成像在乳腺病變良、惡性鑒別診斷中發(fā)揮重要作用[2-3]；前期研究亦表明，乳腺良、惡性病變的彈性模量值存在差異，且彈性模量值與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中的膠原纖維、彈性纖維含量等密切相關[4-5]，證實ECM 在調控乳腺病變彈性特征的過程中發(fā)揮重要作用。而ECM 成分及結構的變化主要是由轉化生長因子-β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）調控，TGF-β1的異常表達可促進ECM 中膠原蛋白及纖維蛋白過度沉積，并抑制ECM的降解[6-7]，造成ECM 硬度增加。因此，TGF-β1、ECM、彈性特征之間存在著密切聯(lián)系。然而，TGF-β1與乳腺病變的彈性特征是否具有相關性目前鮮有報道。本研究擬探討轉化生長因子-β1與乳腺病變彈性特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年4—10月于解放軍總醫(yī)院超聲診斷科接受超聲引導下穿刺活檢、旋切活檢或手術切除的130例女性患者共135個乳腺病變，患者年齡18～73歲，平均（44±12）歲；病變最大徑0.4～5.5 cm，平均（1.6±0.8）cm。所有病變在進行活檢或手術切除前均進行剪切波彈性成像檢查，并以病理結果為“金標準”。本研究經我院倫理委員會批準，所有納入患者均簽訂書面知情同意書。

納入標準：①病理診斷結果明確；②未接受過新輔助化療或放療；③穿刺活檢、旋切活檢或手術切除；④臨床、病理及預后隨訪信息全面；⑤簽訂書面知情同意書。排除標準：①接受過新輔助化療或放療者；②臨床、病理及預后隨訪信息缺失者。

1.2 剪切波彈性成像 采用SuperSonic Imagine 公司的AixPlorer 實時剪切波彈性成像超聲診斷儀，使用L15-4線陣探頭，探頭頻率為4～15 MHz。首先在病變處行常規(guī)超聲檢查，然后轉換成剪切波彈性成像模式，探頭與皮膚保持垂直緩慢平穩(wěn)移動以尋找病灶，于病灶處不施壓靜置3 s 使圖像穩(wěn)定后，凍結并存儲圖像，繼而使用機器自配的定量測量軟件選取感興趣區(qū)測量彈性值。選取感興趣區(qū)時應使取樣框盡可能覆蓋整個病灶大小，尤其是最硬的區(qū)域。于病灶的3個不同切面定位測量，分別記錄最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值，并測量取樣框所置病灶處與周圍同等深度正常乳腺組織的彈性模量比值，計算這3組數據中最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值的均值，并記錄病變邊緣有無“硬環(huán)征”現(xiàn)象出現(xiàn)。

1.3 TGF-β1 檢測 病變組織經福爾馬林固定及石蠟 包埋后切成4 μm 厚的切片，然后采用免疫組化法檢測TGF-β1。免疫組化染色結果使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析。每張切片于400 倍視野下取5個感興趣區(qū)并拍照，測量集成光密度及面積，計算平均光密度（集成光密度/面積），用平均光密度評價TGF-β1的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件，計量資料以表示，計數資料以百分率（%）表示。采用獨立樣本t檢驗比較乳腺良、惡性病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值、TGF-β1表達水平及有無“硬環(huán)征”的病變TGF-β1表達水平等的差異；采用χ2檢驗比較良、惡性病變“硬環(huán)征”的發(fā)生率；以病理結果為“金標準”，對最大彈性模量值、平均彈性模量值、最小彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值、TGF-β1 水平、“硬環(huán)征”等分別繪制受試者工作特征（ROC）曲線，以曲線下面積（AUC）評估其對乳腺病變良惡性的鑒別診斷效能，并分析截斷值、敏感度、特異度，采用Z檢驗比較各AUC 之間的差異；采用Pearson 相關分析評估TGF-β1表達水平與乳腺病變彈性參數的相關性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺病變病理結果 135個乳腺病變中，病理結果顯示良性84個（62.2%），其中纖維腺瘤32個，腺病40個，導管內乳頭狀瘤3個，炎性病變8個，良性葉狀腫瘤1個；惡性51個（37.8%），其中浸潤性癌46個，導管內癌3個，黏液癌2個。

2.2 乳腺良、惡性病變彈性特征分析 乳腺惡性病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值及與周圍組織彈性比值明顯高于乳腺良性病變（P<0.001），但良、惡性病變的最小彈性模量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；74.5%（38/51）的乳腺惡性病變具有“硬環(huán)征”表現(xiàn)，顯著高于乳腺良性病變（4.8%，4/84；P<0.001），見表1及圖1、2。最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值及“硬環(huán)征”對乳腺良、惡性病變均具有很好的鑒別診斷效能，四者鑒別診斷效能比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05；圖3，表2）。

2.3 TGF-β1表達水平及與彈性特征的相關性 135個乳腺病變的TGF-β1表達水平為0.176±0.126，乳腺惡性病變的TGF-β1表達水平顯著高于乳腺良性病變（0.299±0.011比0.104±0.009，P<0.001），見圖1B、2B及表1。以TGF-β1表達水平對乳腺良、惡性病變進行鑒別診斷，其效能為0.934（0.878～0.970），以平均光密度=0.222為截斷值時，鑒別診斷乳腺病變良惡性的敏感度、特異度分別為88.2%、89.3%（圖3，表2）。TGF-β1表達水平與乳腺病變的最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值呈強正相關（r=0.879、0.821、0.741，P<0.001；圖4）。此外，表現(xiàn)為“硬環(huán)征”的乳腺病變TGF-β1表達水平顯著高于無“硬環(huán)征”的乳腺病變（0.308±0.010比0.115±0.010，P<0.001）。

表1 乳腺良、惡性病灶的彈性特征及TGF-β1表達水平（±s）

表1 乳腺良、惡性病灶的彈性特征及TGF-β1表達水平（±s）

指標 良性病灶（n=84） 惡性病變（n=51） t/χ2值 P值 最大彈性模量值（kPa） 58.2±50.5 161.9±79.5 9.276 ＜0.001 ＜0.001 最小彈性模量值（kPa） 15.4±12.9 20.6±19.5 1.434 0.154 平均彈性模量值（kPa） 35.9±26.4 99.6±51.9 9.433 ＜0.001 “硬環(huán)征”[例（%）]4（4.8） 38（74.5） 72.030 ＜0.001 病變與周圍組織彈性比值 2.1±1.7 6.0±4.1 7.625 TGF-β1表達水平 0.104±0.009 0.299±0.011 13.301 ＜0.001

圖1 女，29歲，乳腺浸潤性癌。剪切波彈性成像示彈性模量最大值為233.2 kPa，平均值為137.4 kPa，病變與周圍組織彈性比值為6.9，可見“硬環(huán)征”（箭）出現(xiàn)（A）；免疫組化染色示TGF-β1表達呈強陽性，平均光密度為0.314（×400，B）

圖2 女，26歲，乳腺纖維腺瘤。剪切波彈性成像示彈性模量最大值為19.6 kPa，平均值為15.8 kPa，病變與周圍組織彈性比值為0.7（A）；免疫組化染色示TGF-β1表達呈弱陽性，平均光密度為0.037（×400，B）

圖3 病變的彈性特征及TGF-β1 鑒別診斷乳腺良、惡性病變的ROC曲線

圖4 TGF-β1表達水平與病變彈性特征的相關性。A、B、C 分別為TGF-β1表達水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值的相關性（r=0.879、0.821、0.741）

3 討論

乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷是有效治療的關鍵。目前，剪切波彈性成像在乳腺病變診斷中的重要作用已得到證實[8-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，ECM 中的膠原蛋白及彈性蛋白是決定病變彈性的重要因素[4,10]，乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中伴隨著ECM 成分及結構的異常變化[11]，而TGF-β1 作為調節(jié)ECM 變化的主要因素，其與乳腺病變的彈性特征是否相關目前較少研究。

本研究表明，乳腺惡性病變的最大彈性模量值、平均彈性模值、病變與周圍組織彈性比值顯著高于良性病變，與既往研究一致[3,12]。這可能是因為乳腺惡性病變在生長過程中癌細胞無限增殖，且不斷向周圍侵襲乳腺間質及脂肪組織，導致復雜的ECM 反應，進而引起復雜的結締組織增生及纖維化反應，導致病變硬度增加[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值及“硬環(huán)征”均具有很好的鑒別診斷乳腺病變良惡性的效能，進一步證實剪切波彈性成像在診斷乳腺病變中具有重要價值。

TGF-β1 作為TGF-β 超家族中的一員，廣泛分布于人體內，可調控組織及器官纖維化、細胞癌變、細胞增殖等多個過程，作用顯著[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺惡性病變的TGF-β1表達水平顯著高于良性病變，這可能是由于惡性病灶在生長過程中癌細胞大量增殖使得TGF-β1 大量活化，TGF-β1表達水平亦大幅提升，而大量表達的TGF-β1 又反過來影響癌細胞的生長，促進其轉變成與形成癌癥相關的肌成纖維細胞[16-17]，加快病灶生長，從而使TGF-β1表達水平進一步升高。本研究結果還表明TGF-β1 對乳腺良、惡性病變的鑒別診斷效能較佳，提示TGF-β1可能是乳腺癌鑒別診斷的一個新的切入點，為診斷乳腺病變提供新思路。

既往研究表明，乳腺癌病灶生長過程中大量表達的TGF-β1 一方面可促進癌細胞轉變成肌成纖維細胞，進而促進膠原蛋白、纖維蛋白等的合成及分泌，從而導致ECM 成分的過度堆積[6,16]，造成ECM 硬度增加；另一方面還可刺激膠原蛋白、彈性蛋白、粘連蛋白等ECM 主要成分的合成及交聯(lián)重排，并抑制其降解，導致ECM 硬度增加[14,18]，從而使病變“變硬”。此外，TGF-β1 亦可通過促進癌細胞合成并分泌多種蛋白酶類，提高細胞黏附性，使得癌細胞與周圍乳腺間質及脂肪組織粘連，導致病變活動性降低，增加病變硬度[19]。本研究顯示，TGF-β1表達水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值及病變與周圍組織彈性比值均呈強正相關，提示TGF-β1 對乳腺病變的硬度有一定的調控作用。

Insana 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當乳腺癌細胞在不斷向周圍侵襲乳腺間質及脂肪組織導致結締組織增生及纖維化反應時，TGF-β1 亦不斷誘導癌細胞轉化為肌成纖維細胞，并促使其不斷向病灶生長的邊緣生長，根據膠原纖維、彈性纖維堆積程度和數目及纖維化反應程度，病灶對其周圍組織施予不同程度的拉力[21]。而彈性蛋白和纖維蛋白在拉伸狀態(tài)下會變硬[22]，從而使得病灶周圍組織的硬度增加2～10 倍，因而造成“硬環(huán)征”的出現(xiàn)。本研究結果發(fā)現(xiàn)乳腺惡性病變“硬環(huán)征”的發(fā)生率高于良性病變，且具有“硬環(huán)征”的乳腺病變TGF-β1表達水平顯著高于無“硬環(huán)征”的病變，提示TGF-β1與“硬環(huán)征”具有相關性。

總之，乳腺病變的TGF-β1表達水平與最大彈性模量值、平均彈性模量值、病變與周圍組織彈性比值、“硬環(huán)征”等均具有相關性，提示TGF-β1可能在乳腺病變彈性特征的調控過程中發(fā)揮重要作用。