ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與急性腦梗死的相關(guān)分析

張廣煒，劉 丹

腦梗死是中老年人常見病、多發(fā)病，是全球中老年人長期殘疾的首要原因。盡管診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但大部分患者仍遺留有不同程度的后遺癥，針對腦梗死進(jìn)行積極有效的預(yù)防治療，可降低腦梗死的發(fā)生[1,2]。ABCG1是ABCG家族的跨膜半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可在多個(gè)組織中高表達(dá)，同時(shí)也可參與脂質(zhì)代謝過程，在巨噬細(xì)胞膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)中間過程中，ABCG1可以防止過多的脂質(zhì)聚集，減少動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的形成，可起到保護(hù)血管避免動(dòng)脈粥樣硬化損傷的作用。

DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,與胞嘧啶的C5位結(jié)合形成甲基胞嘧啶的化學(xué)修飾過程[3]。有研究提示，ABCG1的啟動(dòng)子區(qū)甲基化后，抑制了ABCG1的血管保護(hù)作用，使得AS的形成增加，同時(shí)也加重了動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的心腦血管疾病的發(fā)生。據(jù)此，本課題主要研究ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與急性腦梗死之間的相關(guān)性，為腦梗死的基因診治提供一定的理論支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組為隨機(jī)篩選2017年7月-2018 年11月我院神經(jīng)內(nèi)科就診的急性腦梗死患者，均為漢族 ,彼此無親緣關(guān)系，共計(jì)84例;對照組為2017年7月-2018 年11月我院診治的非腦梗死患者，共計(jì)90例。

病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18 歲；(2)發(fā)病時(shí)間≤7 d；(3)腦梗死診斷符合1996年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)部CT或MRI檢查證實(shí)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往曾有腦出血病史或CT顯示存在腦出血；(2)有明顯的心、肝、腎功能不全及惡性腫瘤；(3)存在心房顫動(dòng)等嚴(yán)重心律失常；(4)心源性栓塞所致的卒中、腔隙性腦梗死及無癥狀性腦梗死。

1.2 方法與分組 病例組與對照組于入院次日清晨采集肘靜脈血共計(jì)2 ml，用抗凝管留置并編號，置-20 ℃低溫冰箱保存。進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA和基因組DNA純化回收，甲基化特異性PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)檢測和瓊脂糖凝膠電泳判定甲基化結(jié)果，同時(shí)行血常規(guī)、生化等常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查，以及頸部血管彩超、CT、MRI等相關(guān)檢查。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對照組的一般資料和臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對比 經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示年齡、性別、空腹血糖、TC、TG、LDL-C的組間P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而收縮壓、舒張壓、抽煙史、飲酒史、HDL-C的組間P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 ABCG1基因甲基化特異性PCR檢測結(jié)果 采用甲基化和非甲基化特異性引物擴(kuò)增被亞硫酸氫鹽修飾轉(zhuǎn)化后的對照組和病例組DNA時(shí)，ABCG1甲基化引物與非甲基化引物擴(kuò)增得到預(yù)期大小的擴(kuò)增片段。在檢測的病例組樣本中，ABCG1因子啟動(dòng)子區(qū)有66人顯示甲基化陽性，甲基化陽性率為78.6%；對照組中有43人顯示甲基化陽性，甲基化陽性率為47.78%,P<0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 病例組與對照組一般資料、臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性分析 分別對病例組與對照組和年齡、性別、抽煙、飲酒、血壓、血脂及ABCG1基因甲基化情況進(jìn)行Pearson線性相關(guān)或Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示：急性腦梗死與抽煙(r=0.349,P<0.01)、飲酒(r=0.162,P=0.033)、收縮壓(r=0.259,P=0.001)、ABCG1基因啟動(dòng)子甲基化陽性情況(r=0.318，P<0.01)均為正相關(guān)，而與HDL-C(r=-0.255,P=0.001)為負(fù)相關(guān)，表明抽煙、飲酒、高血壓、ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化均為急性腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素，HDL-C為保護(hù)因素。而年齡、性別、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、病例組和對照組未見明顯相關(guān)(見表2)。

2.4 急性腦梗死發(fā)病危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 以急性腦梗死的發(fā)生情況為因變量，以抽煙、飲酒、收縮壓、HDL-C、ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與ACI發(fā)病相關(guān)的指標(biāo)為自變量，采用二元Logistic回歸分析的進(jìn)入法進(jìn)行分析，在校正其他危險(xiǎn)因素后，結(jié)果顯示：抽煙史、收縮壓、HDL-C、ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且從上述指標(biāo)的OR值可以看出收縮壓、抽煙史、ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是ACI發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這些指標(biāo)每升高一個(gè)單位，ACI發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分別為原來的1.028倍、3.449倍、3.047倍(收縮壓:OR=1.028,95%CI1.009～1.046,P<0.01;抽煙史OR=3.449,95%CI1.631～7.293,P<0.01；ABCG1:OR=3.047,95%CI1.439～6.454,P<0.01)，而HDL-C是急性腦梗死發(fā)病的保護(hù)性因素，該指標(biāo)每升高一個(gè)單位，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為原來的0.211倍(HDL-C:OR=0.211,95%CI0.067～0.665,P<0.01)(見表3)。

表1 病例組和對照組的一般資料與臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對比

病例組與對照組比較*P<0.05,**P<0.01

表2 病例組與對照組臨床檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的相關(guān)分析

病例組與對照組比較r為相關(guān)系數(shù)*P<0.05，**P<0.01

表3 急性腦梗死發(fā)病危險(xiǎn)因素的Logistic 回歸分析

3 討 論

本研究選取急性腦梗死患者84例(病例組)與同期來我科就診的非腦梗死患者90例(對照組)，檢測病例組與對照組外周血中的ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的表達(dá)情況，同時(shí)探討其與腦梗死的相關(guān)性。結(jié)果顯示：一般資料對比顯示，病例組相較對照組，血壓、吸煙史、空腹血糖以及HDL-C之間，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。病例組的ABCG1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率為78.6%;對照組甲基化陽性率為47.8%，前者明顯升高。腦梗死與吸煙、血壓、空腹血糖、ABCG1基因啟動(dòng)子甲基化陽性均呈正相關(guān)，而與HDL-C呈負(fù)相關(guān)。并且Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)：抽煙史、收縮壓、ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性是腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HDL-C為腦梗死發(fā)病的獨(dú)立保護(hù)因素。其中ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化每增加一倍，急性腦梗死發(fā)病率可增加2.959倍(OR=3.047;95%CI1.439～6.454;P=0.004)。

高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙等是腦梗死發(fā)病的常見危險(xiǎn)因素[4～10]，其中，由于動(dòng)脈粥樣硬化(AS)所導(dǎo)致的大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死是腦梗死中常見且重要的一種類型，而血脂代謝異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)：當(dāng)各種理化因素使血管內(nèi)皮受損后，血液中的低密度脂蛋白可以滲入血管內(nèi)皮下，并且在血管內(nèi)膜酶類的作用下發(fā)生氧化，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的激活，從而調(diào)節(jié)單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)皮下，分化成巨噬細(xì)胞[11]，吞噬修飾后的脂蛋白顆粒，最終形成充滿脂肪顆粒的泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化的形成[12]?？刂蒲惓Ｓ兄陬A(yù)防腦梗死的發(fā)生，因此對于如何調(diào)控血脂代謝異常仍是腦梗死防治的研究要點(diǎn)。

目前，對于血脂異常的調(diào)控，大量的研究集中在基因水平，其中有報(bào)道顯示ABCG1參與了血脂代謝的過程，可能對血脂異常起到調(diào)控作用。ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesferol，HDL-C)呈負(fù)相關(guān)，ABCG1能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇流出，并與HDL-2、HDL-3、成熟HDL-C和其他富含脂質(zhì)的載脂蛋白結(jié)合，在去除多余膽固醇的過程中起著重要的作用。ABCG1通過增加細(xì)胞內(nèi)、外層之間膽固醇的運(yùn)動(dòng)來增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的趨化性，最終使 HDL-C的作用加強(qiáng)從而促進(jìn)AS的逆轉(zhuǎn)，所以可以通過改變DNA甲基化的狀態(tài)調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，從而減緩 AS形成。

三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類保守的跨膜蛋白,通過與ATP的結(jié)合、介導(dǎo)膽固醇從外周組織巨噬細(xì)胞中的流出。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 G1(ATP-binding cassette G1，ABCG1)是ABCG家族的跨膜半轉(zhuǎn)運(yùn)體[13,14]，ABCG1在巨噬細(xì)胞中高表達(dá),介導(dǎo)胞內(nèi)膽固醇(尤其是氧化固醇)向HDL轉(zhuǎn)運(yùn),維持細(xì)胞內(nèi)外脂質(zhì)的平衡[15]，最終使 HDL的作用加強(qiáng)從而促進(jìn)AS的逆轉(zhuǎn)，減緩AS形成。

DNA甲基化(DNA methylation)是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，不改變DNA序列的情況下，對生物體的基因組功能進(jìn)行調(diào)控，DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾，CpG 二核苷酸序列中的碳-5位置被甲基修飾,影響基因的表達(dá)，抑制調(diào)控基因的活性[16,17]。因此，ABCG1可能通過甲基化修飾來調(diào)節(jié)特異性基因的表達(dá)，引起動(dòng)脈粥樣硬化，從而導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生。本研究采用的DNA甲基化檢測方法為MSP法，相較于基因測序，該方法簡便、經(jīng)濟(jì)，適合大樣本檢測。

已有動(dòng)物研究表明，缺乏ABCG1的小鼠可出現(xiàn)膽固醇在巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞大量積累[18]。ABCG1在巨噬細(xì)胞中呈高表達(dá)，并在巨噬細(xì)胞的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起關(guān)鍵作用。12/15-LOX基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可調(diào)控大鼠的AS的形成[19]，而在AS的發(fā)生發(fā)展中，TFPI-2基因的甲基化修飾，可能導(dǎo)致斑塊的快速進(jìn)展，同時(shí)增加了斑塊的不穩(wěn)定性，進(jìn)而可導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生，維持膽固醇水平的平衡對于AS的發(fā)生發(fā)展都起到至關(guān)重要的作用[20,21]。

有證據(jù)顯示，ABCG1的表達(dá)可降低HDL和甘油三酯水平，而ABCG1啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能通過增加甘油三酯水平，進(jìn)而導(dǎo)致與血管阻塞相關(guān)疾病的發(fā)生[22],另外，肥胖及糖尿病均為腦梗死的危險(xiǎn)因素，而ABCG1啟動(dòng)子區(qū)甲基化與糖尿病發(fā)病呈正相關(guān)[23,24]。

在本研究中還發(fā)現(xiàn)抽煙史是ACI發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR3.449;95%CI1.631～7.293;P=0.001)，有可能是因?yàn)闊煵葜械哪峁哦?、一氧化碳及焦油?huì)使內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而加速AS的形成，從而引起急性腦梗死的發(fā)生。

綜上所述，在急性腦梗死患者中ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)存在DNA甲基化，且與急性腦梗死的發(fā)生有關(guān)。提示ABCG1基因可以引起脂質(zhì)代謝紊亂，同時(shí)還有可能成為急性腦梗死的發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為急性腦梗死的基因治療和預(yù)防提供了新思路。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處：在已知疾病中，如糖代謝異常、舒張壓的異常，均為腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素[25,26]，本課題未得出此結(jié)論，可能與患者通過藥物控制血壓、血糖等情況有關(guān)，亦或是樣本量少有關(guān)，并且血壓為非連續(xù)性檢測所得，僅為入院時(shí)兩次血壓結(jié)果的均值，因此，有可能會(huì)影響研究的結(jié)果，在今后的研究中，可以通過擴(kuò)大樣本量，完善研究方法，進(jìn)一步證明。