杜比亞蟑螂共生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性

單體江，段志豪*，吳春銀，李志強(qiáng)，王 松，毛子翎**

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；2. 廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣州 510260)

杜比亞蟑螂Blapticadubia又名度比亞大蠊、度比亞蟑螂，屬蜚蠊目Blattaria、蜚蠊科Blattidae碧蠊屬Blaptica卵胎生昆蟲(Wuetal., 2013)，主要分布于中美洲、南美洲，屬于衛(wèi)生害蟲(Alameretal., 2014a; 2014b)。杜比亞蟑螂體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量豐富，現(xiàn)多用于爬行動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的活體飼料，為開發(fā)潛力較大的資源昆蟲之一 (Yietal., 2013；Tianetal., 2016)。杜比亞蟑螂產(chǎn)生的幾丁質(zhì)、抗菌肽和殼聚糖等已用于生產(chǎn)醫(yī)藥保健品、化妝品等(章敏等，2012)。隨著昆蟲體內(nèi)微生物研究方法的不斷改善，其體內(nèi)大量的共生真菌不斷被人們所認(rèn)知(戈惠明等，2009；Teeetal., 2015)。昆蟲體內(nèi)微生物參與到昆蟲生活的許多方面，包括昆蟲的生理和進(jìn)化，協(xié)助腸道消化食物，改善宿主營(yíng)養(yǎng)，有利于種間種內(nèi)通訊，抵御捕食者、病原菌以及寄生蟲的入侵等(Crottietal., 2012；Engeletal., 2013)。昆蟲共生真菌及其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物類型豐富、結(jié)構(gòu)新穎、抗性較好，是目前國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)(汪福源等，2017)。從棉蝗腸道菌Phomasp.中分離得到化合物epoxydon 6-methylsalicylateester，具有中等的免疫抑制活性和較強(qiáng)的除草活性(張應(yīng)烙等，2010)；從菜粉蝶腸道中分離得到的共生真菌Alternariasp.，發(fā)酵培養(yǎng)后得到7種對(duì)酪氨酸激酶具有不同程度抑制活性的次生代謝產(chǎn)物(郭玲芝等，2014)。

目前關(guān)于蜚蠊科共生真菌的研究報(bào)道較少，從德國(guó)小蠊Blattellagermanica腸道和糞便中分離出22株具有抗真菌活性和產(chǎn)鐵能力的菌株，表明腸道菌群對(duì)保護(hù)蟑螂免受真菌侵染和定植有重要作用(Zhangetal., 2018)。從美洲大蠊Periplanetaamericana體內(nèi)分離出假絲酵母、曲霉和紅曲霉等23種真菌(Kassirietal., 2018)，此外，美洲大蠊的甲醇提取物含有甾醇類和具有抗細(xì)菌活性的異黃酮類化合物(尹衛(wèi)平等，2012)。然而尚未見杜比亞蟑螂共生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究。杜比亞蟑螂體內(nèi)是否存在共生真菌，共生真菌種類以及共生真菌次生代謝產(chǎn)物的生物活性等問題值得研究和探討。本論文以杜比亞蟑螂為研究對(duì)象，分離并鑒定其中的共生真菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)提取共生真菌的次生代謝產(chǎn)物，并測(cè)定其抗菌和抗氧化活性，以期為杜比亞蟑螂及其共生真菌的綜合開發(fā)與利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

杜比亞蟑螂Blapticadubia于2016年11月30日購(gòu)自青島連萬(wàn)家杜比亞專賣店。

1.2 儀器與試劑

SW-CJ-2G型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；LRH系列生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ZF-2型三用紫外儀(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HQ45恒溫?fù)u床(中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠)；BCD-280W醫(yī)用冷藏箱(海爾生物醫(yī)療有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀OSB-2100(東京理化器械株式會(huì)社)；DSX-280KB30手提式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；Exceed-C超純水機(jī)(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；JA2003N分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DIS-2012R全溫振蕩搖床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；LC-16高效液相色譜(日本島津)；Thermo VarioskanTMLUX 多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、二氯甲烷等均為分析純(天津富宇精細(xì)化工廠)；分析純甲醇(天津富宇精細(xì)化工廠)；色譜純甲醇(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；升汞(廣逸化工有限公司)；GF254薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)；羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)生物顯色劑(Amresco公司)；硫酸鏈霉素(美國(guó)Sigma公司，99%)。

1.3 共生真菌的分離和純化

共生真菌的分離參照Shan等(2012)的方法。將活體杜比亞蟑螂用清水清洗20 min，晾干。先用75%乙醇處理30 s，再用0.2%氯化汞處理20 min，而后用無(wú)菌水沖洗3次，每次5 min，最后置于無(wú)菌濾紙上晾干。去除杜比亞蟑螂的翅、足和頭胸部，將蟑螂的腹部剖開后放置在PDA培養(yǎng)基平板中(含500 μg/mL的硫酸鏈霉素)，在28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)。待共生真菌長(zhǎng)出后，從每個(gè)菌落的邊緣挑取少量菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基上，連續(xù)純化多次，直至菌落形態(tài)均勻一致為止。將分離純化得到的杜比亞蟑螂共生真菌依次編號(hào)為Bdf-1～Bdf-5。將純化好的共生真菌接種到PDA斜面上，4℃保存，備用。共生真菌分離頻率(CF)的計(jì)算公式如下：

1.4 共生真菌的鑒定

1.4.1共生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將共生真菌菌株接種于PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)5～10 d，觀察、記錄菌落形態(tài)并拍照，并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)和產(chǎn)孢情況，記錄菌絲有無(wú)隔膜以及孢子的大小等。

1.4.2共生真菌的分子生物學(xué)鑒定

參照宋慧云等(2018)的方法對(duì)分離到的共生真菌進(jìn)行鑒定。將純化后的菌株(在PDA平板上生長(zhǎng)5 d)接種到PDB培養(yǎng)基中，于28℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)6～7 d，減壓抽濾后獲得其菌絲。用液氮將菌絲充分研磨至粉末狀，采用試劑盒法(上海生工DNA抽提取試劑盒)提取其DNA。使用真菌通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3′)擴(kuò)增其ITS序列，PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×TaqPCR Master Mix(含染料)25 μL，ITS4(10 μmol/L)1 μL，ITS5(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(10 ng/μL)2 μL，雙蒸水21 μL，混勻。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min 20 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列使用DNAMAN軟件進(jìn)行互補(bǔ)拼接，將正向與反向引物互補(bǔ)序列兩端加上引物序列拼接成完整序列，所得的rDNA-ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得其登錄號(hào)。

將擴(kuò)增所得的rDNA-ITS序列在NCBI網(wǎng)站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性檢索，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，通過MAFTT version 7處理后，使用MEGA 7.0.26軟件采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中Bootstrap method中重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)置500，模式為General Time Reversible Model。

1.5 共生真菌次生代謝產(chǎn)物的制備

采用PDB培養(yǎng)基對(duì)分離鑒定后的共生真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過減壓抽濾分別得到菌絲和菌液。菌絲經(jīng)乙酸乙酯冷浸提取3次，每次7 d，菌液直接采用乙酸乙酯萃取3次，分別將提取液和萃取液減壓濃縮，得到菌絲和菌液次生代謝產(chǎn)物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 抗細(xì)菌活性的測(cè)定

采用薄層層析(TLC)-噻唑藍(lán)(MTT)-生物自顯影法測(cè)定共生真菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性(歐陽(yáng)錦逵等，2017)。供試細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichiacoli，G-)、黃瓜角斑病菌(Pseudomonaslachrymans，G-)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonasvesicatoria，G-)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，G+)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum，G-)、根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens，G-)和溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus，G+)。將提取物用丙酮溶解，在薄層層析板上用直徑0.5 mm的毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5 μL。采用二氯甲烷和甲醇的混合溶液作為展開劑進(jìn)行薄層層析，濃度為0.2 mg/mL硫酸鏈霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。向滅菌的LB半固體培養(yǎng)基中加入菌液(45 mL LB + 5 mL菌液)，調(diào)其濃度約為108CFU/mL，振蕩均勻。用噴樣器將菌液均勻快速地噴灑到硅膠板上，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將硅膠板置于培養(yǎng)皿中于4℃冰箱中放置4 h，以利于抗菌成分的擴(kuò)散；再將硅膠板置于28℃下保濕培養(yǎng)，12 h后取出硅膠板，均勻噴灑0.5 mg/mL MTT，靜待幾分鐘后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。有抗菌活性成分處，供試細(xì)菌由于受到活性成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無(wú)抗菌活性成分處，供試細(xì)菌正常生長(zhǎng)，噴灑MTT后顯藍(lán)紫色。通過抑菌斑的遷移率(即Rf值)來(lái)初步評(píng)價(jià)樣品中抗菌化合物的極性，根據(jù)抑菌斑的大小和多少來(lái)初步評(píng)價(jià)活性化合物的抑菌活性和數(shù)量。Rf值計(jì)算公式如下：

1.7 抗氧化活性的測(cè)定

采用多孔板-DPPH顯色法測(cè)定共生真菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率，以IC50值來(lái)表示共生真菌次生代謝產(chǎn)物的抗氧化能力(Ouyangetal.，2018)。精密稱取DPPH 20.0 mg溶于100 mL無(wú)水乙醇中，振蕩搖勻，使其終濃度為0.2 mg/mL。陽(yáng)性對(duì)照BHT和各提取物的初始濃度為10.0 mg/mL，而后用DMSO依次對(duì)半稀釋成濃度為5 mg/mL～0.0390625 mg/mL的溶液。向96微孔板中加入80 μL濃度為0.2 mg/mL DPPH無(wú)水乙醇溶液，而后加入20 μL系列濃度的待測(cè)樣品溶液或陽(yáng)性對(duì)照溶液，震蕩搖勻。在37℃下水浴30 min，517 nm下測(cè)定吸光值。以20 μL DMSO溶液代替樣品溶液作為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，供試樣品對(duì)DPPH清除率的有效中濃度(IC50)計(jì)算公式如下：

所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行作圖分析，供試樣品濃度取對(duì)數(shù)(X)，清除率換算成機(jī)率值(Y)，初步求得抗氧化活性的回歸方程(Y=aX+b)和IC50值。

1.8 共生真菌次生代謝產(chǎn)物的高效液相分析

為進(jìn)一步探究杜比亞蟑螂共生真菌次生代謝產(chǎn)物的情況，本研究采用高效液相對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。將發(fā)酵得到的5株共生真菌菌絲和菌液提取物各10 mg，用1 mL色譜甲醇溶解后，再用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，待測(cè)。使用甲醇-水梯度洗脫，其色譜條件為：0～2 min使用20%甲醇等度洗脫；2～20 min，甲醇濃度由20%線性遞增到100%；20～25 min，使用100%甲醇進(jìn)行洗脫；25～30 min，使用20%甲醇對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，紫外檢測(cè)器設(shè)置為254 nm單通道采樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 共生真菌的分離和鑒定

從杜比亞蟑螂中總共分離得到13株共生真菌，通過菌落和顯微形態(tài)觀察，合并相同的菌株，最后得到5株形態(tài)各異的共生真菌，分別編號(hào)為Bdf-1～Bdf-5。其菌落和顯微形態(tài)如圖1所示。

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離到的所有菌株菌絲均為有隔菌絲，在正常培養(yǎng)條件下均有孢子產(chǎn)生。杜比亞蟑螂共生真菌形態(tài)學(xué)描述見表1。菌株Bdf-2、Bdf-3和Bdf-5均有曲霉屬真菌典型的分生孢子頭產(chǎn)生，但菌落形態(tài)卻存在較大差異，因此采用分子生物學(xué)方法對(duì)篩選出的形態(tài)各異的共生真菌進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

圖1 杜比亞蟑螂共生真菌菌落形態(tài)及其顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 The morphological characters of symbiotic fungi in Blaptica dubia

表1 杜比亞蟑螂共生真菌形態(tài)學(xué)描述

通過PCR擴(kuò)增、測(cè)序后，將拼接完整的ITS序列提交至GenBank，獲得其登錄號(hào)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)合菌落形態(tài)、顯微觀察以及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，杜比亞蟑螂共生真菌的最終鑒定結(jié)果如表2所示。5株共生真菌主要分布于青霉屬、曲霉屬和聚孢霉屬，其中曲霉屬的種類最多(3株)，說(shuō)明曲霉屬為優(yōu)勢(shì)種群，其余兩屬各有1株。青霉屬雖然只有1株Bdf-1，但其分離頻率高達(dá)30.77%，僅次于曲霉屬的Bdf-3(46.15%)。曲霉屬和青霉屬真菌雖多為腐生菌，但也常常作為昆蟲的共生真菌被報(bào)道。中華劍角蝗腸道共生真菌草酸青霉Penicilliumoxalicum產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)人體多種癌細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用(喻夢(mèng)嵐等，2014；鄭燕麗等，2014)。

2.2 共生真菌的抗細(xì)菌活性

采用TLC-MTT-生物自顯影法測(cè)定了杜比亞蟑螂共生真菌菌液和菌絲提取物對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性(表3)。結(jié)果表明，5種共生真菌菌液和菌絲提取物均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但同一提取物對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性存在一定的差異。其中Bdf-1菌絲提取物對(duì)黃瓜角斑病菌未表現(xiàn)出抑制活性，而Bdf-3菌絲提取物對(duì)枯草芽孢桿菌未表現(xiàn)出抑制活性。所有菌株菌液提取物抑菌斑的Rf值范圍明顯大于菌絲提取物，說(shuō)明菌液中含有更多的抗菌活性化合物。Rf值主要與化合物的極性有關(guān)，Rf值越小，化合物極性越大，Bdf-1、Bdf-3和Bdf-4菌液提取物Rf值在0.0～0.5之間均有分布，說(shuō)明三株菌的菌液中具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物其極性為中等偏大。Bdf-1和Bdf-3菌絲提取物Rf值主要分布在0.35～0.60之間，說(shuō)明兩菌的菌絲中具有抗菌活性的物質(zhì)主要為中等極性的次生代謝產(chǎn)物，而Bdf-4菌絲提取物Rf值主要分布在0.0～0.12之間，說(shuō)明抗菌活性物質(zhì)的極性偏大。Bdf-2和Bdf-5菌液提取物抑菌斑的Rf值范圍完全覆蓋菌絲提取物，說(shuō)明菌液提取物中具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物更為豐富。從抑菌斑的最大直徑來(lái)看，Bdf-4和Bdf-5菌液提取物對(duì)所有供試細(xì)菌的抑菌斑最大直徑均超過10 mm，而菌絲提取物要明顯弱于菌液，抑菌斑最大直徑一般在5～10 mm之間，其中Bdf-4菌絲提取物對(duì)黃瓜角斑病菌和大腸桿菌抑菌斑的最大直徑要大于10 mm。除黃瓜角斑病菌外，Bdf-2菌液提取物對(duì)其他供試細(xì)菌的抑菌斑的最大直徑也超過10 mm，且菌絲提取物弱于菌液提取物。Bdf-1和Bdf-3對(duì)不同供試細(xì)菌的抑制活性要弱于Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5，但也表現(xiàn)一定的抗菌活性，抑菌斑的最大直徑多集中于5～10 mm之間。

表2 杜比亞蟑螂共生真菌鑒定結(jié)果

圖2 依據(jù)杜比亞蟑螂共生真菌rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of symbiotic fungi isolated from Blaptica dubia based on the rDNA-ITS sequence

綜上所述，菌株Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5表現(xiàn)出較好的抗菌活性，且菌液提取物的抗菌活性要強(qiáng)于菌絲，說(shuō)明杜比亞蟑螂共生真菌產(chǎn)生的活性次生代謝產(chǎn)物主要分泌到胞外，為極性偏大的化合物，這與抑菌斑的Rf值偏小的結(jié)果相一致。

2.3 共生真菌的抗氧化活性

采用DPPH法測(cè)定了5株杜比亞蟑螂共生真菌菌液和菌絲提取物的抗氧化活性(表4)。結(jié)果表明，Bdf-4和Bdf-5菌液和菌絲提取物在供試濃度下均未表現(xiàn)出任何抗氧化活性。Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3的菌液提取物均表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，IC50值分別為0.26±0.01 mg/mL、2.20±0.99 mg/mL和0.75±0.16 mg/mL；而菌絲提取物的IC50值均大于5 mg/mL。說(shuō)明Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3中具有抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物主要分布于菌液中。

表4 杜比亞蟑螂共生真菌不同提取物對(duì)DPPH的清除力

注：“B”表示菌液提取物； “M”表示菌絲提取物。
Note: “B” was the crude extract from broth; “M” was the crude extract from mycelia.

圖3 杜比亞蟑螂共生真菌的菌絲和菌液不同提取物HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms for different crude extracts of symbiotic fungi isolated from Blaptica dubia

2.4 共生真菌次生代謝產(chǎn)物的高效液相分析

采用HPLC對(duì)分離得到的5株杜比亞蟑螂共生真菌菌絲和菌液提取物進(jìn)行分析，其色譜圖如下所示(圖3)。HPLC分析結(jié)果表明，在波長(zhǎng)為254 nm的檢測(cè)條件下，5株共生真菌都含有一定量的次生代謝產(chǎn)物，其中菌株Bdf-1、Bdf-3以及Bdf-5菌液次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量要高于其菌絲，且主要差異均表現(xiàn)在化合物極性偏大的區(qū)域，即保留時(shí)間在20 min之前的區(qū)域，通過前面的研究發(fā)現(xiàn)，菌株Bdf-1和Bdf-3菌液提取物表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，而Bdf-5菌液提取物表現(xiàn)出較好的抗菌活性，是否與這些成分有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。此外，菌株Bdf-2和Bdf-4菌液中的化合物種類與菌絲差異不大，但其紫外吸收明顯弱于菌絲，說(shuō)明次生代謝產(chǎn)物主要分布于菌絲中，而菌株Bdf-2和Bdf-4菌絲提取物的抗菌活性要弱于菌液，說(shuō)明254 nm下含量較高的化合物其抗菌活性并不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)所得到的高效液相色譜圖，可以為杜比亞蟑螂共生真菌活性次生代謝產(chǎn)物的分離和純化提供參考。

3 結(jié)論與討論

本研究采用組織塊分離法從杜比亞蟑螂中分離鑒定出5株共生真菌，分屬于青霉屬、曲霉屬和聚孢霉屬，其中青霉屬和曲霉屬菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，可能與杜比亞蟑螂生活的環(huán)境有關(guān)。青霉屬和曲霉屬真菌作為常見的昆蟲和植物共生菌以及腐生菌，也能夠產(chǎn)生多種活性次生代謝產(chǎn)物，且生活環(huán)境不同，共生真菌所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物和生物活性也大不相同。從南海紅樹林中分離得到的鮮紅青霉，能夠產(chǎn)生對(duì)葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶具有不同程度抑制活性的化合物(Huangetal., 2011)。Aspergillusnomius是巴西堅(jiān)果中黃曲霉毒素的重要生產(chǎn)者(Olsenetal., 2008)。從吉蘭泰鹽田沉積物中分離出Penicilliumcitrinum，并從該菌的發(fā)酵物中得到兩個(gè)桔霉素二聚體化合物，對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出一定的清除活性(Luetal., 2008)。本研究所采用的供試材料為人工飼養(yǎng)的杜比亞蟑螂，生活環(huán)境相對(duì)單一，且并不是所有的共生真菌均能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所以分離到的共生真菌種類和數(shù)量偏少。本論文分別提取共生真菌菌絲與菌液的次生代謝產(chǎn)物，進(jìn)而比較共生真菌胞內(nèi)(菌絲)和胞外(菌液)次生代謝產(chǎn)物在抗細(xì)菌和抗氧化活性方面的差異。其中菌液提取物的抗細(xì)菌和抗氧化活性要強(qiáng)于其菌絲提取物，菌株Bdf-2、Bdf-4和Bdf-5菌液提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，而Bdf-1，Bdf-2和Bdf-3的菌液提取物均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。其中Bdf-4鑒定為Clonostachyssp.，Roberti等(2008)發(fā)現(xiàn)從感染鐮刀菌的小麥冠中分離出的粉紅螺旋聚孢霉Clonostachysrosea，可以抑制谷物的種傳鐮刀菌病害。杜比亞蟑螂共生真菌次生代謝產(chǎn)物是否具有抗真菌、抗腫瘤和酶抑制活性還有待于進(jìn)一步研究，此外，這些次生代謝產(chǎn)物對(duì)杜比亞蟑螂的抗病性和環(huán)境適應(yīng)性等的影響也是接下來(lái)研究的重點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步分離杜比亞蟑螂共生真菌中的抗菌和抗氧化活性成分奠定了基礎(chǔ)，為杜比亞蟑螂及其共生真菌的綜合開發(fā)與利用提供了新的思路。