昆蟲對環(huán)境低氧的適應：生理和分子機制研究進展

蘆 超，丁 玎，陳 兵*

(1. 河北大學生命科學學院，河北保定 071002；2. 中國科學院動物研究所，北京 100103)

氧是機體進行新陳代謝和維持生存的必要因素。人們了解氧對動物生命的至關重要性始于1774年，然而直到20世紀90年代，人們才開始探索氧缺少對動物的影響。世界上存在許多低氧分壓的環(huán)境，例如高海拔地區(qū)、深海，這類環(huán)境嚴重影響著動植物的生存與發(fā)展，同時低氧也是許多疾病發(fā)病過程中的一個重要的環(huán)境因素。許多野生動物都能夠在這樣的極端環(huán)境下長期很好的生存和繁殖，說明在世代居住的過程中動物都進化出了相同或者特異的方式去適應低氧環(huán)境。

無脊椎動物尤其是昆蟲因其較好的可操作性以及其本身生理特點，很早就被人類用于低氧適應的研究。昆蟲是世界上種類和數(shù)量最多的動物，其生活環(huán)境非常多樣。由于棲息地處于恒定低氧(如高海拔地區(qū)、寄主的胃部)和間斷低氧或無氧(如洪水淹沒和冰雪覆蓋地區(qū)、腐肉、果實或密閉的容器)的條件，它們發(fā)展出了各自的適應策略求得生存和繁榮壯大。長久以來對于昆蟲低氧的研究取得了一系列成果，在生態(tài)、進化和基礎醫(yī)學等領域都受到了廣泛的關注，本文就昆蟲在不同方面對于低氧環(huán)境的適應做了綜述。

1 昆蟲的呼吸和攜氧系統(tǒng)及其低氧適應

1.1 昆蟲的低氧耐受能力

由于昆蟲的廣泛分布，它們的棲息地包括陸地、水中以及高海拔地區(qū)，在這些棲息地中，昆蟲都會面臨不同的低氧環(huán)境。它們的種類涉及到了大部分昆蟲類群，包括鞘翅目Coleoptera、雙翅目Diptera、鱗翅目Lepidoptera、等翅目Isoptera、彈尾目Collembola和直翅目Orthoptera。在實驗室極度低氧或無氧條件下，這些昆蟲能夠存活數(shù)十分鐘、數(shù)天甚至數(shù)月(Hoback and Stanley, 2001)。

對于棲息在陸地的昆蟲，土壤、糞便、谷物堆，或被淹沒的洞穴等地方經(jīng)常產(chǎn)生低氧環(huán)境(Hoback and Stanley, 2001)，所以不同棲息地的昆蟲在其生命階段需要具有一些能夠應對環(huán)境低氧的適應能力，從而提高他們的生存率(Hoback, 2012; Campetal., 2014; Harrison, 2015)。如蜣螂生活在充滿糞便的洞穴當中，它們要面臨低氧和體內(nèi)二氧化碳過多的危害，因此蜣螂新陳代謝所需要的臨界氧分壓(partial pressure of oxygen,PO2)十分低(Holter and Spangenberg, 1997)。但同樣在洞穴中筑巢的蜜蜂Megachilerotundata的新陳代謝所需要的臨界PO2值與其他昆蟲相似(Owingsetal., 2014)。處于不同發(fā)育階段的昆蟲對于低氧的耐受能力也存在差異，比如煙草天蛾Manducasexta的蛹比其5齡幼蟲更容易在洪水中幸存(Woods and Lane, 2016)，但對于毛翅蠅Ironoquiaplattensis來說，它的蛹比幼蟲更容易受到洪水影響(Cavallaro and Hoback, 2014)。除此之外，蘋果蠹蛾的卵和成蟲在0.5%氧濃度的常壓低氧條件下只能存活1.25 h，而其滯育幼蟲卻能存活42 d，其原因可能是滯育期的幼蟲對代謝顯著抑制從而減少了耗氧(Soderstrometal., 1990)。

水生昆蟲比陸地昆蟲更容易受到低氧環(huán)境的影響，因為氧氣在水中的溶解度極低，并且消耗或者產(chǎn)生氧氣都會迅速導致水中的PO2值劇烈變化，在較小的水體中這一現(xiàn)象更加明顯。使這一情況更加惡劣的另一個原因就是氧氣在水體中擴散平衡所需要的時間更多(Dejours, 1975; Verberketal., 2011)。對石蠶蛾Hydropsycheangustipennis的研究表明，它們通過改變自身行為活動時間來克服低氧環(huán)境，如增加了自身通氣時間以提高體內(nèi)含氧量，同時降低了捕食等其他活動的時間來減少自身對于氧氣的消耗量(Van der Geest, 2007)，在羽搖蚊Chironomusplumosus的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象(Walshe, 1950)。不同水生昆蟲在低氧環(huán)境下的生存能力有很大差異，有些僅耐受輕微低氧而有些可以耐受極度低氧。有趣的是，即使是親緣關系很近的水生昆蟲，它們的耐低氧能力也存在差異(van der Geest, 2007; Verberk and Bilton, 2013)。在這些昆蟲中，那些具有耐極端低氧的類群，就更容易建立生存優(yōu)勢(Hamburgeretal., 1994)。

生活在高海拔地區(qū)的昆蟲，隨著海拔升高空氣密度降低，PO2值也逐漸降低。高海拔低氧可能是影響個體生長和大小的重要原因，但目前相關研究較少(Harrisonetal., 2018)。在許多高海拔地區(qū)沒有蜜蜂的分布，原因之一可能就是氧氣濃度過低無法維持蜜蜂飛行過程的能量代謝(Joosetal., 1997)。但是生活在西藏高原的飛蝗與平原的飛蝗相比對于低氧的耐受性更強，低氧下線粒體損傷較小，電子轉運催化效率更高，這些都為飛蝗在高原低氧環(huán)境中維持能量代謝提供直接幫助(Zhouetal., 2008)。

儲藏物昆蟲也是一類特殊的經(jīng)常遭遇低氧環(huán)境的昆蟲。對豆象甲Callosobruchuschinensis在低氧(2% O2)和常氧(20% O2)條件下的代謝譜研究表明，豆象甲在低氧條件下會通過改變自身的代謝途徑來提高自身低氧耐受性，如激活乙醛酸循環(huán)將脂肪酸轉發(fā)為碳水化合物用于能量代謝(Cuietal., 2017)。儲藏物昆蟲在不同發(fā)育階段低氧耐受性不同，比如煙草甲Lasiodermaserricorne的幼蟲能夠忍受氧氣濃度低于1.0%～1.3%的極端低氧情況，而其成蟲則不能(Imai and Fukazawa, 2012)。綠豆象Callosobruchusmaculatus則卵是對缺氧最敏感的，特別是在早期，而3齡、4齡幼蟲是最耐受性最強的，可以在低氧條件下存活15 d(Chengetal., 2015)。

另外也有一些昆蟲所具有的無氧耐受能力與棲息地的環(huán)境并無關系，例如沙漠飛蝗Schistocercagregaria，雖然世代生活在常氧環(huán)境中，卻能在無氧條件下生存長達8 h(Hochachkaetal., 1993)，這些預示著昆蟲對低氧或無氧的耐受能力可能是普遍存在的。

1.2 昆蟲的呼吸系統(tǒng)—氣管系統(tǒng)

昆蟲的氣管系統(tǒng)是連續(xù)不斷遍布全身的由上皮細胞構成的管狀網(wǎng)絡。在氣管的末端不斷分支和細化，深入組織內(nèi)部直接為組織輸送氧氣。在胚胎時期，氣管系統(tǒng)的一些基礎組織開始發(fā)育，該發(fā)育過程主要受遺傳因素傳控制。在幼蟲期間氣管系統(tǒng)成為可塑性組織，可以根據(jù)機體對氧氣的需求生長和分支。

關于昆蟲氣管系統(tǒng)對氧氣響應的研究主要是以果蠅為模型進行操作的。在發(fā)育過程中，果蠅早期氣管原基的形成是在胚胎中期開始的，調(diào)控該過程的基因為trachealess，該基因編碼的蛋白Trh調(diào)控一系列基因的轉錄從而促進氣管的發(fā)育(Isaac and Andrew, 1996)。隨后氣管原基形成囊泡，并向上生長，氣管細胞隨即向上遷移形成六條原始的氣管分支(Vincentetal., 1997)。隨著分支的不斷生長和擴張并逐漸形成網(wǎng)絡(Vincentetal., 1997)。纖維原細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFR；在果蠅中FGFR的類似物被稱作Breathless (Btl))在氣管分支和生長過程中發(fā)揮了很重要的作用。FGFR在所有氣管細胞中均有表達，而在目標組織，其配體Branchless(Bnl)可引導表達FGFR的氣管細胞向其移動，一旦氣管細胞移動到含有Bnl的細胞簇，該過程會停止并開始下一輪調(diào)控，該過程的不斷重復使得氣管不斷延伸(Sutherlandetal., 1996)。

昆蟲氣管系統(tǒng)受到氧氣濃度調(diào)控的現(xiàn)象最早是在獵椿中發(fā)現(xiàn)的(Wigglesworth, 1954)。隨后又發(fā)現(xiàn)，昆蟲在感受氧氣濃度及調(diào)控氣管發(fā)育過程中，低氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)起到了核心的作用。在果蠅中，HIF-α亞基的同源蛋白Sima通過調(diào)控Btl的表達來調(diào)節(jié)氣管的分支和生長(Centaninetal., 2008)。

1.3 昆蟲的攜氧系統(tǒng)—呼吸蛋白

因為昆蟲具有發(fā)達的氣管系統(tǒng)，最初認為呼吸蛋白對于昆蟲的氧氣傳遞不是必需的(Rubinetal., 2000; Willmeretal., 2009)。然而隨后的研究發(fā)現(xiàn)事實并非如此，在生活于馬胃部的膚蠅幼蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的血紅蛋白(Hemoglobin)，血紅蛋白的存在有利于增強氧氣的攝取和輸送(Hoback and Stanley, 2001)。隨后在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內(nèi)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白，果蠅血紅蛋白的合成主要與氣管系統(tǒng)和脂肪體有關，這表明昆蟲體內(nèi)的氧氣供應可能比之前想象的要復雜，除了簡單的擴散外，還可能依賴于血紅蛋白介導的氧氣運輸和儲存(Hankelnetal., 2002)。

隨后在一些昆蟲中還發(fā)現(xiàn)另一種攜氧蛋白即血藍蛋白(Hemocyanin)(Hagner-Holleretal., 2004)。對石蠅Perlamarginata的研究表明，具有氧結合特性的血淋巴包含血藍蛋白(Hagner-Holleretal., 2004)。與之相類似，飛蝗Locustamigratoria在胚胎時期，氣管系統(tǒng)發(fā)育之前，蝗卵和胚胎大量表達血藍蛋白，血藍蛋白的缺失會嚴重影響飛蝗的胚胎發(fā)育(Chenetal., 2015)。血藍蛋白廣泛存在于非完全變態(tài)昆蟲中這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，暗示血藍蛋白對昆蟲呼吸可能存在著潛在的意義(Burmester, 2001; Burmester and Hankeln, 2007; Picketal., 2008; Picketal., 2010)，這與血紅蛋白在昆蟲中可能起到輔助運輸氧氣的推測吻合。

血藍蛋白的表達僅限于胚胎中晚期和1齡若蟲，如在杜比亞蟑螂Blapticadubia和美洲沙漠蝗Schistocercaamericana的胚胎中就是這樣，這意味著血藍蛋白可能進化出一種胚胎中與氣體交換或儲存相關的特殊功能(Sánchezetal., 1998; Picketal., 2010)。低氧下培養(yǎng)飛蝗胚胎可以大量誘導血藍蛋白的表達上調(diào)，進一步說明血藍蛋白與環(huán)境可獲得氧密切相關(Chenetal., 2017)。卵可能是通過胚胎表面轉移氧氣來調(diào)節(jié)氧氣供應，或者給呼吸組織或局部儲存氧氣。同時，血藍蛋白還可能具有與氧轉運有關的其他功能，如緩沖胚胎的供氧，控制供氧的時間和強度，或作為向卵殼輸出信號的低氧傳感器，增加其通氣量或增加流入胚胎的氧氣量(Chenetal., 2015)。

對于昆蟲呼吸蛋白的研究主要集中在胚胎時期，而且呼吸蛋白的存在也主要在昆蟲的胚胎時期，這主要可能是因為胚胎時期的昆蟲幼蟲由于沒有成熟的呼吸系統(tǒng)—氣管系統(tǒng)來運輸氧氣，所以在漫長的進化過程中選擇了呼吸蛋白來輔助呼吸。相反的，當昆蟲進入成蟲期時，氣管系統(tǒng)逐漸成熟，無論是效率還是實用性都高于呼吸蛋白，所以在昆蟲成蟲時期不再表達呼吸蛋白?；诖耍惐热颂岢隽伺咛テ谘{蛋白表達和氣管系統(tǒng)發(fā)育的互補模型(Chenetal., 2017)，該模型很好解釋了昆蟲胚胎呼吸的機制。該發(fā)現(xiàn)也說明昆蟲的不同發(fā)育階段應對低氧環(huán)境的方式可能是具有差異的?；谖鞑仫w蝗與平原飛蝗胚胎中血藍蛋白的比較研究進一步揭示了血藍蛋白在低氧適應中的作用，該研究表明，西藏飛蝗胚胎血藍蛋白含量遠遠高于平原飛蝗。雖然低氧誘導可以顯著提高平原種群和高原種群胚胎的血藍蛋白表達，但高原種群在低氧刺激下血藍蛋白表達更為穩(wěn)定(Chenetal., 2017)。因此，較高的血藍蛋白含量可能有助于西藏飛蝗胚胎在低氧高海拔地區(qū)更好地獲得充足和穩(wěn)定的氧氣供應。

2 昆蟲低氧研究體系與方法的發(fā)展

獲得耐低氧昆蟲品系是研究昆蟲低氧適應的前提和基礎，因此篩選具有耐低氧性的昆蟲品系是研究昆蟲低氧適應的一個重要步驟，這種篩選可以是實驗室人為選擇篩選出來的，也可以是在自然界低氧環(huán)境中長期自然選擇而篩選出來的。有研究者將黑腹果蠅D.melanogaster培養(yǎng)在逐步降低O2水平的環(huán)境中，經(jīng)繁殖超過200代后，通過這樣的人工篩選獲得了能夠忍受嚴重低氧的果蠅種群，其可以忍耐極端低氧的特性可以遺傳，即使在沒有低氧壓力的情況下，這種耐受性仍然存在(Zhouetal., 2011)。除此之外，青藏高原是天然的低氧環(huán)境，生活在青藏高原的昆蟲必然經(jīng)歷了長久的自然選擇。在對西藏飛蝗的研究中發(fā)現(xiàn)，西藏飛蝗的體型明顯小于平原飛蝗，更有利于氧氣的輸送；在低氧情況下，西藏飛蝗的呼吸頻率也明顯高于平原飛蝗；經(jīng)過極端低氧處理(1.6 kPaPO2)西藏飛蝗在極端低氧條件下的暈倒率遠遠低于平原飛蝗(Zhangetal., 2013)；種群分化歷史研究表明在10 000年前左右兩個種群的基因交流水平降到了最低值(Dingetal., 2018)。這些結果說明西藏飛蝗是經(jīng)歷自然選擇而得到的具有耐低氧性的昆蟲品系。

基因表達研究是昆蟲低氧適應研究中重要的一部分，通過基因表達研究，可以得到低氧處理后實時的基因表達變化，基因表達研究的方法有很多，包括DNA微陣列(DNA microarray)、轉錄組、代謝組等多種方法。有研究者使用DNA微陣列技術對人工培育出的耐極端低氧的果蠅品系進行了研究，得到了一系列受到抑制的代謝基因，并發(fā)現(xiàn)作為代謝開關的hairy基因(詳見5)(Zhouetal., 2008)。該方法同樣被應用在飛蝗L.migratoria當中，推測出在極端低氧下飛蝗受到的主要威脅不是能量危機，而是氧化損傷(詳見3.3)(Zhaoetal., 2012)。轉錄組研究能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本序列信息。如使用轉錄組技術比較了果蠅暴露于輕度低氧(4～5 kPaPO2)和嚴重低氧(1.5～0 kPaPO2)下1～6 h后的轉錄反應，證明昆蟲在重度低氧時主要轉向損傷控制(Lietal., 2013)。代謝組學是對生物體內(nèi)所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，也被廣泛應用于昆蟲低氧適應研究。有研究者通過對棲息于高山地區(qū)的小金蝠蛾Thitarodesxiaojinensis代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)其通過引起體內(nèi)氧濃度下降來實現(xiàn)熱應激反應(詳見5)(Zhuetal., 2019)。

全基因組重測序是現(xiàn)今比較常用的遺傳變異研究方法，如通過比較不同種群的基因組發(fā)現(xiàn)種群間的遺傳差異；對基因組的多態(tài)性和雜合度的分析，確定種群是否受到自然選擇壓力；分析固定指數(shù)和雜合度等指標確定種群中與低氧適應相關的受選擇基因；對這些基因進行功能富集和信號通路富集，從而獲得與低氧適應相關的富集通路。這一系列分析方法可以很恰當?shù)慕鉀Q所要研究的低氧適應遺傳機制。有研究者就通過對西藏蝗蟲和平原蝗蟲進行基因組重測序發(fā)現(xiàn)，胰島素通路中蛋白酪氨酸磷酸酶非受體1型(Tyrosine protein phosphatase non-receptor type 1, PTP1B)在西藏蝗蟲中受到選擇，與低氧代謝適應相關(詳見6.1)(Dingetal., 2018)。也有研究者比較了非洲東部棲息于不同海拔的同種蜜蜂的基因組，發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)蜜蜂基因組中7號染色體和9號染色體上有區(qū)域受到了正向選擇，從而影響其低氧行為適應(詳見6.3)(Wallbergetal., 2017)。

3 低氧適應的生理機制

3.1 氣體交換模式的改變

氣孔是位于昆蟲體表調(diào)控氧氣進出機體的小孔，在面對低氧環(huán)境時，氧氣含量調(diào)控了昆蟲氣孔的閉合頻率和持續(xù)時間。研究表明當周圍氧氣濃度降低時，氣孔會延長張開時間、增加張開頻率。同時氣孔也是機體排出二氧化碳的氣管，因此低氧也會造成暫時性的二氧化碳和呼吸作用產(chǎn)的水排放增多等特點(Frazieretal., 2001)。后續(xù)又有研究者報道，氣孔在進行氣體交換調(diào)控時可分為3種狀態(tài)：開啟狀態(tài)(大量釋放二氧化碳)、閉合狀態(tài)、煽動狀態(tài)(少量釋放二氧化碳)。在面對低氧環(huán)境時，氣孔閉合狀態(tài)持續(xù)時間明顯縮短，同時煽動狀態(tài)時二氧化碳排放量增加。除此之外，閉合狀態(tài)的持續(xù)時間與周圍氧分壓成正比，這個結論進一步證明調(diào)控氣孔開閉頻率與持續(xù)時間是周圍環(huán)境的氧分壓而非氣管系統(tǒng)本身的氧分壓(Hetz and Bradley, 2005)。

3.2 通氣量的改變

低氧環(huán)境中機體的通氣量會顯著增加，然而過高的氧氣含量對通氣量無明顯影響。已有的研究認為低氧環(huán)境中通氣量的增加可能是由于二氧化碳增加導致的，另外一個原因也可能是活性氧積累(Deanetal., 2004)。在對黃粉蟲Tenebriomolitor的研究發(fā)現(xiàn)，在15%和10.5%氧濃度的常壓低氧條件下，氣管橫截面積分別增長了40%和120%，以此來增加自身通氣量來適應低氧環(huán)境(Hoback and Stanley, 2001)。但是長期處于低氧環(huán)境中，通氣量調(diào)控的敏感度則顯著降低，有研究發(fā)現(xiàn)長期處于不同氧氣濃度(PO2分別為：5、10、21、40 kPa)環(huán)境中飼養(yǎng)的蝗蟲的通氣之間無明顯差別，與此同時，測量發(fā)現(xiàn)腹部呼吸的幅度和頻率也無明顯差異(Harrisonetal., 2006)。而將處于低氧環(huán)境中飼養(yǎng)的蝗蟲放置在正常氧濃度環(huán)境下測量，其通氣量則顯著降低。這個結果表明為了適應長期低氧環(huán)境，蝗蟲顯著的降低了自身的通氣量。

3.3 抗氧化損傷能力改變

與哺乳動物或鳥類不同，昆蟲可以在無氧條件下存活數(shù)小時甚至數(shù)天之久，同時只會對機體造成輕微的損傷。在脊椎動物中低氧會導致機體分解三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)的能力減弱，從而影響后續(xù)輸氧后的恢復。而在飛蝗的飛行肌的研究中發(fā)現(xiàn)無氧環(huán)境下其細胞內(nèi)ATP依然可分解為磷酸腺苷(Adenosine monophosphate, AMP)，而且只有很少一部分會轉化成次黃嘌呤、黃嘌呤或者尿酸等副產(chǎn)物(Weyel and Wegener, 1996)。此外，昆蟲體內(nèi)的海藻糖對于其抵抗無氧環(huán)境的壓力也起到了重要作用，在無氧環(huán)境中海藻糖具有防止蛋白變性，保護細胞等作用(Chenetal., 2002)。對于昆蟲抗氧化損傷的機制到目前還不是很清楚，而針對昆蟲的這一特點的研究有助于我們提高對于人類一些疾病的認識。

在對飛蝗的研究中發(fā)現(xiàn)，在低壓低氧的環(huán)境下，肌細胞中參與能源生產(chǎn)過程的基因在轉錄水平受到顯著抑制，包括丙酮酸脫氫酶作用的脫羧反應、脂肪酸運輸和β-氧化過程、TCA循環(huán)、電子傳遞鏈和ATP合成過程。這些過程的抑制主要是由于一些關鍵步驟的基因表達受到了抑制。之后研究者又通過通路研究分析，結果顯示糖酵解和其下游的各個途徑均受到了明顯的抑制，相反的戊糖磷酸途徑卻表現(xiàn)出明顯的增強。這表明能量產(chǎn)生過程的抑制和戊糖磷酸途徑的增強協(xié)同地將葡萄糖從合成ATP轉移到產(chǎn)生還原力，對于這一現(xiàn)象有一種可能的解釋便是在低壓低氧中，主要的威脅不是能量危機，而是氧化損傷(Zhaoetal., 2012)。因此，在低氧情況下，對于葡萄糖的分流和重新分配也是一種抗氧化損傷的適應。也有研究者對果蠅在有氧代謝率臨界PO2范圍內(nèi)(4～5 kPaPO2)和嚴重低氧(0～1.5 kPaPO2)范圍內(nèi)的轉錄組進行了測序研究。比較了暴露于0.5 kPaPO2的嚴重低氧下1 h和6 h后的轉錄反應，結果表明許多基因(如熱休克蛋白)的表達隨時間增加而增加，更多的基因隨著暴露時間的延長而上調(diào)(Lietal., 2013)。而在輕度低氧環(huán)境中誘導的基因(主要是轉錄因子和編輯基因)較少，且不包括熱休克蛋白，這與前面飛蝗在重度低氧時主要轉向損傷控制的假設一致。

4 發(fā)育和體型的適應

4.1 體型與氧氣濃度的關系

在動物進化過程中，PO2水平發(fā)生了巨大的變化，許多研究結果表明昆蟲體型的變化與環(huán)境氧濃度變化有關。化石和地質(zhì)證據(jù)表明，PO2水平的增加與動物體型的增加有關，這就導致了一種假說，即古生代晚期著名的巨型昆蟲是由氧氣供應的增加而生存的(Harrisonetal., 2010)。有研究者指出在氧濃度大于30%PO2的古生代晚期(Michaud and Denlinger, 2007)，昆蟲的體型大小幾乎是現(xiàn)在近親昆蟲體型的十倍(Dudley, 1998)。對化石和環(huán)境氧濃度的進一步研究表明，在昆蟲進化的前150百萬年，隨著空氣中氧濃度的下降，昆蟲的翅長逐漸變短(Clapham and Karr, 2012)。這些結果都支持了前面的假說，同時也暗示著昆蟲減小自身的體型來適應外界環(huán)境氧濃度的降低。

此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)人工低氧環(huán)境下飼養(yǎng)黑腹果蠅和煙草天蛾體型明顯縮小(Zhouetal., 2008; Callier and Nijhout, 2011)。在對黑腹果蠅的進一步研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下(10 kPaPO2)的種群個體較小，但當這些種群恢復到正常狀態(tài)時，其大小與正常PO2條件下的飼養(yǎng)的種群相同，這說明低氧對種群個體大小有很強的約束作用。相比之下，在較高氧分壓下飼養(yǎng)的果蠅(40 kPaPO2)的體型與常氧狀態(tài)下的果蠅無明顯差異(Klok and Harrison, 2009)。此外，耐受高氧的果蠅成蟲的體型也增加了。耐受高氧的果蠅成蟲(能夠生活在60～90 kPaPO2的成蟲)的體重至少比對照組高近20%(McElroy and Chandel, 2017)。與對照組相比，高氧耐受性果蠅的翅面積增大，翅細胞總數(shù)也明顯增多。這些研究結果再次表明，氧氣濃度與昆蟲體型確實存在一定關系。對這一現(xiàn)象的一種解釋是，體型縮小可能是昆蟲對低氧環(huán)境的適應的結果之一，因為體型的縮小使昆蟲能夠以更低的總能量和氧氣需求來進行繁殖，并通過減少氧氣的擴散距離來提高組織PO2。也有研究人員將其解釋為“時效性”，即因為低氧中適宜的食物資源的短時性，促使果蠅發(fā)育到成蟲減小身體尺寸(Harrison and Haddad, 2011)。另一種解釋是由于細胞數(shù)量減少，因為果蠅細胞的分裂周期會受到周圍低氧環(huán)境的嚴重影響(Wingrove and O’farrell, 1999)。細胞在分裂中期生長停滯或減緩表明有絲分裂期間DNA的復制對氧氣非常敏感。在低氧環(huán)境中長期飼養(yǎng)的果蠅細胞數(shù)量較少，體積較小也證明了上述假設，因此這也被認為是氧氣影響昆蟲體型大小的原因之一(Peck and Maddrell, 2005)。以上這些結果說明缺氧以被動的、普遍的方式影響新陳代謝，同時誘導靶信號通路的激活，這些信號通路介導了體型的縮小，或者補償代謝干擾，減弱體型的縮小(Callier and Nijhout, 2014)。

但是氧氣濃度對昆蟲體型大小的影響也取決于昆蟲的種類。對于果蠅D.melanogaster、綠頭蠅Calliphoravomitoria、煙草天蛾M.sexta以及黃粉蟲T.molitor等，其體型大小與氧氣濃度在一定范圍內(nèi)成正相關。而對美洲沙漠蝗的研究發(fā)現(xiàn)，長期低氧環(huán)境生活并不會影響其最終體型大小(Greenberg and Ar, 1996; Frazieretal., 2001)。

4.2 發(fā)育時間與氧氣濃度的關系

有研究認為昆蟲的臨界體型是受到體內(nèi)氧分壓決定的，在幼蟲發(fā)育期間，隨著脂肪體的積累，體型不斷的生長，但是在此過程中氣管系統(tǒng)及氣孔等依然保持恒定，當機體不斷增大時會出現(xiàn)組織供氧減少的情況，隨即昆蟲達到臨界體積并開始蛻皮(Woods and Hill, 2004)。迄今的研究中均發(fā)現(xiàn)10 kPa或者更低的氧氣濃度會延長昆蟲的發(fā)育時間，減緩昆蟲的發(fā)育速率。在對煙草天蛾M.sexta的研究表明，較高的發(fā)育速率會導致抗應激能力的降低和氧化損傷過多的累積，也就是說在氧氣濃度較低的情況下，煙草天蛾會選擇降低發(fā)育速率從而提高自身抗氧化損傷能力和應激能力來獲得更高的生存率(Harrisonetal., 2013)。

最近基于腸道微生物造成的類似低氧環(huán)境的研究給我們新的啟示。在無腸道微生物群時，給埃及伊蚊Aedesaegypti即使喂食營養(yǎng)全面的食物，它們的發(fā)育不會超過1齡，與此相反，包括大腸桿菌在內(nèi)的幾種細菌可以幫助無菌性幼蟲發(fā)育成成蟲。在這種情況下，埃及伊蚊幼蟲腸道內(nèi)的氧氣濃度降低到了5%以下，這就說明腸道微生物導致的體內(nèi)氧分壓下降是促進埃及伊蚊生長和蛻皮的重要因素(Coonetal., 2017)。這就進一步證實了“昆蟲的臨界體型是受到體內(nèi)氧分壓決定的”這一假設。這些研究結果說明，低氧不僅會對昆蟲機體造成一定的影響，同時也是昆蟲生長發(fā)育的必要條件，這對我們理解昆蟲對低氧的適應性進化機制有重要意義。

5 代謝適應

對官袍虎甲Cicindelatogata幼蟲的研究發(fā)現(xiàn)，25℃下的無氧環(huán)境中抑制了機體97%的代謝活動，同時其無氧呼吸則顯著增強(Hobacketal., 1998)。通過對極端耐低氧品系的果蠅與正常氧分壓條件下飼養(yǎng)的果蠅進行比較研究發(fā)現(xiàn)，耐低氧果蠅的整體代謝水平受到了明顯的抑制(Zhouetal., 2011)。深入研究發(fā)現(xiàn)，低氧耐受性較高的果蠅品系體內(nèi)一個名為hairy的轉錄抑制因子的轉錄調(diào)控區(qū)存在明顯的變異，該變異使其所在基因的表達量顯著升高，從而抑制了能量代謝相關基因的表達。而將hairy的基因敲除顯著降低了果蠅低氧耐受性，使得這些果蠅在低氧環(huán)境中的存活率顯著降低(Zhouetal., 2008)。同樣的，平原飛蝗在溫和低氧環(huán)境中(13%PO2)的能量代謝過程受到了系統(tǒng)性的抑制(Zhaoetal., 2012)。小金蝠蛾T.xiaojinensis是一種生存溫域極窄生物，在面對高溫環(huán)境時，其通過降低體內(nèi)氧氣濃度來抑制其有氧代謝的整體強度，激活了效率較低的厭氧糖酵解來維持其能量供應，以延長其在高溫環(huán)境中的生存時間(Zhuetal., 2019)。由此可見，降低自身的代謝過程是對于昆蟲的低氧適應是十分重要的一種方式，同時對于某些生物來說低氧又是其適應其他逆境的一種緩沖方式。

然而有趣的是，對于西藏飛蝗轉錄組的研究顯示，能量代謝相關基因表達量則無明顯變化，其體內(nèi)丙酮酸脫氫酶復合體的β亞基蛋白(Pyruvate dehydrogenase complex subunit E1β, PDHE1β, 丙酮酸脫氫酶是檸檬酸循環(huán)的限速酶)表達量在極端低氧情況下比平原蝗蟲要高，深入研究發(fā)現(xiàn)其編碼基因啟動子區(qū)域發(fā)生了變異，這一變異使PDHE1β在高原蝗蟲中不會因低氧而導致表達量下降，從而使其能夠更好地利用有氧代謝在極端低氧時產(chǎn)生ATP(Zhaoetal., 2013)。還有研究表明，低氧處理對西藏蝗蟲和平原蝗蟲的氧化磷酸化反應均有顯著抑制作用，但對西藏蝗蟲的抑制作用較小。因為西藏蝗蟲的細胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase, COX)在常氧和低氧件下均表現(xiàn)出較高的活性，這使得西藏飛蝗的線粒體能夠在低氧環(huán)境中更有效的利用氧氣(Zhangetal., 2013)。這就說明低氧環(huán)境中，昆蟲也可以通過提高氧氣的利用效率來增強自身在低氧環(huán)境中的存活。

綜上，代謝適應對于昆蟲在低氧環(huán)境中生存是一項重要條件，無論是提高氧氣利用率還是降低氧氣的需求量都是為了保持昆蟲在低氧環(huán)境中的代謝穩(wěn)態(tài)與能量供給，但為了達到這一目的，昆蟲的適應方式應該不僅僅局限于此。因此，從多角度探尋昆蟲低氧適應中維持代謝穩(wěn)態(tài)可能是一個重要方向。

6 低氧適應的關鍵分子通路

昆蟲中與低氧相關的代謝通路主要包括胰島素(Insulin/Insulin-like)信號通路和低氧誘導因子(HIF)信號通路，這兩條通路從多方面調(diào)節(jié)昆蟲在低氧環(huán)境中的適應生存，包括生長發(fā)育、能量代謝、氣管系統(tǒng)可塑性等(圖1)，但這兩條通路在調(diào)節(jié)低氧響應上具有不同的特征，我們在下面分開說明。

圖1 昆蟲低氧適應相關信號通路和功能Fig.1 Hypoxic adaptation related signaling pathways in insects注：由缺氧直接引起的通路反應(黑色實線)和由缺氧間接引起的通路反應(黑色虛線)；通路間的相互作用(紅線)；通路引起的功能反應(藍線)。Note:Pathway response directly (black solid line) and indirectly (black dotted line) induced by hypoxia; Interaction between pathways (red line); functional response regulated by signal pathway (blue line).

6.1 胰島素(insulin/insulin-like)信號通路

胰島素信號通路是生物體內(nèi)重要的調(diào)控能量代謝的途徑，胰島素信號通路活性增加可導致能量代謝增強，但在低氧環(huán)境中旺盛的能量代謝可能會導致細胞氧化壓力的增加進而對機體產(chǎn)生有害的作用。對線蟲的研究表明，秀麗線蟲Caenorhabditiselegans中胰島素/胰島素類似物生長因子(insulin/insulin-like growth factor, IGF)受體同源基因daf-2突變體在低氧環(huán)境中的壽命比野生型明顯延長，而將daf-2重新在神經(jīng)系統(tǒng)或肌肉中回補后，線蟲在低氧環(huán)境中的死亡率重新提升，這一結果證實了上述結論(Scottetal., 2002)。不同的是，在果蠅中發(fā)現(xiàn)，低氧處理會降低果蠅組織中胰島素通路的活性，同時增加其大腦內(nèi)胰島素生成細胞中胰島素樣多肽2的含量；除此之外，在缺氧條件下，在果蠅幼蟲全身或者氣管組織中過表達胰島素受體，增強了氣管的可塑性，增強了缺氧期間的氧氣輸送(Harrison and Haddad, 2011; Wongetal., 2014)。以上說明胰島素信號通路可以調(diào)節(jié)低氧下昆蟲的發(fā)育過程。最新的研究揭示自然選擇如何作用于昆蟲胰島素通路關鍵基因，來調(diào)節(jié)昆蟲對低氧的適應性(圖2)。PTP1B是一種酪氨酸磷酸酶，通過對胰島素受體的酪氨酸位點去磷酸化從而達到抑制其功能，進而抑制整個胰島素信號通路。果蠅PTP1B同源蛋白，在低氧下可降低胰島素受體的活性(Leeetal., 2008)。基于飛蝗西藏種群和平原種群的比較基因組學發(fā)現(xiàn)，編碼PTP1B的基因PTPN1在西藏飛蝗中受到很強的自然選擇作用。PTPN1基因具有一個氨基酸變異位點，導致其編碼蛋白脯氨酸富集構域(Pro-Rich)發(fā)生突變(p.Asn349Ile)，而且該變異位點的頻次呈現(xiàn)海拔梯度變化。西藏飛蝗在低氧暴露下表現(xiàn)很強的代謝穩(wěn)態(tài)，而功能研究發(fā)現(xiàn)，正是該突變鈍化了胰島素信號通路對低氧的響應，使西藏飛蝗在低氧環(huán)境下仍能維持適當水平的能力代謝水平和正常的活動(Dingetal., 2018)(圖2)。該類研究使我們對昆蟲在代謝上適應長期低氧環(huán)境的機制有了新的認識。

圖2 去磷酸化酶PTP1B蛋白突變對胰島素信號通路的影響Fig.2 Effects of PTP1B protein mutation on insulin signaling pathway注：在平原飛蝗體內(nèi)，在低氧環(huán)境中野生型PTP1B酶活性升高，使胰島素受體對胰島素的敏感性降低，減弱了能量代謝過程；在西藏飛蝗體內(nèi)，突變型PTP1B對低氧敏感度降低，胰島素通路活性維持穩(wěn)定，從而可以在低氧環(huán)境中保持穩(wěn)定的能量的代謝水平。Note:Under hypoxic environment, the lowland locusts possessing wild-type PTP1B increase the enzymatic activity of PTP1B that in turn, reduces the sensitivity of the insulin receptor to insulin and represses the energy metabolism. As a contrast, the Tibetan locusts harboring the mutant PTP1B possess a reduced sensitivity to hypoxia, and stable insulin pathway activity, thereby maintaining a stable energy metabolism level in a hypoxic environment.

6.2 低氧誘導因子(HIF)信號通路

HIF通路在低氧環(huán)境中維持細胞穩(wěn)態(tài)和存活起到了至關重要的作用，并且其在氣管系統(tǒng)可塑性和調(diào)控昆蟲生長和發(fā)育扮演了重要的角色。最先發(fā)現(xiàn)HIF作為轉錄因子，當被激活后，HIF會結合在位于其靶標基因啟動子區(qū)的低氧響應原件(Hypoxic response element, HRE)上，并調(diào)控基因的轉錄(Semenza, 2003)。HIF由兩個亞基組成，α亞基和β亞基。β亞基穩(wěn)定表達在細胞核中，而α亞基則受到氧氣的抑制，當氧氣含量降低，抑制才會被解除。人類的HIF通路在低氧環(huán)境下參與一系列細胞過程的調(diào)控，包括調(diào)節(jié)細胞代謝，促進無氧呼吸而抑制有氧呼吸(Kimetal., 2006)，在低氧環(huán)境中優(yōu)化線粒體功能(Fukudaetal., 2007)，促進血管生成和紅細胞的生成，誘導炎癥反應以及調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡等(Dengleretal., 2014)。在短期且急性的低氧刺激下可以激活HIF-1α，而較長時間的低氧刺激下則會激活HIF-2α轉錄活性(Kohetal., 2011)。在對西藏人低氧適應遺傳機制研究中發(fā)現(xiàn)了HIF-2α(EPAS1)的變異，該變異與西藏人在高原地區(qū)患慢性高山癥的概率較低有關(Pengetal., 2017)。而HIF-3α則參與抑制HIF-1/2α的過程。同時HIF-3α也被發(fā)現(xiàn)在斑馬魚胚胎中參與調(diào)控胚胎發(fā)育過程(Zhangetal., 2014)。此外，在線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)HIF過表達可以增強機體對氧化壓力的抵抗能力，從而延長線蟲的壽命(Zhangetal., 2009)。

而在昆蟲的研究中，HIF參與調(diào)節(jié)昆蟲低氧適應鮮有相關報道。在果蠅中，HIF-α的同源蛋白被稱為sima，其最早在果蠅胚胎中被發(fā)現(xiàn)(Lavista-Llanosetal., 2002)。氣管的末端細胞可以通過“氧傳感器”——Fatiga感知低氧，從而導致sima在這些細胞中不斷積累，而sima的積累誘導了Btl(一種成纖維細胞生長因子受體)的表達，Btl的高表達提高了其與配體Bnl的結合水平，從而誘導了末端細胞的分支生長(Centaninetal., 2008)。sima與哺乳動物中HIFα亞基類似，受低氧處理的激活，在常氧環(huán)境中則被降解。HIF-1還負責急性反應，使多種參與細胞代謝、細胞死亡和細胞生長的基因恢復活性。黑腹果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1可以調(diào)控賴氨酸特異性去甲基化酶2(KDM2)家族成員，幫助協(xié)調(diào)細胞對缺氧的反應(Batieetal., 2017)。重要的是，sima基因在果蠅中也調(diào)控氣管系統(tǒng)的分支和生長，與人類中HIF調(diào)控血管生成相似。由上分析可知，HIF信號通路在進化上非常保守，值得我們開展其低氧感知和適應方面功能的深入研究。

同時研究發(fā)現(xiàn)，HIF信號通路和Insulin信號通路相互作用。對埃及伊蚊A.aegypti的研究中發(fā)現(xiàn)，細菌所引起的腸道內(nèi)缺氧是埃及伊蚊幼蟲生長到臨界大小，蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone, 20E)釋放和羽化所必需的信號(Coonetal., 2017)，而這一信號是通過HIF信號通路來實現(xiàn)的，即在埃及伊蚊幼蟲體內(nèi)，HIF信號通路可以激活AMP依賴的蛋白激酶信號(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)和胰島素生長因子信號(insulin/insulin growth factor signaling, IIS)來調(diào)節(jié)埃及伊蚊幼蟲的成長和代謝(Valzaniaetal., 2018)。

前述結果表明，HIF信號通路對于昆蟲在低氧適應中的重要作用，不僅體現(xiàn)在其是昆蟲應對低氧環(huán)境的有效途徑，更體現(xiàn)在其作為誘導生長和發(fā)育的重要信號通路。由此可見，昆蟲在漫長的低氧適應進化過程中，不僅發(fā)展出了一系列應對低氧環(huán)境的機制，還將低氧作為自身生長和發(fā)育的條件之一。因此，低氧適應與調(diào)控對于昆蟲的進化和發(fā)展具有重要作用。

6.3 其他遺傳機制

顯然參與昆蟲低氧適應的分子機制是多方面的?？蒲腥藛T比較了棲息于青藏高原的草原毛蟲和其低海拔近親草原毛蟲的轉錄組，受到自然選擇的基因富集通路包括mTOR信號通路中的正選擇基因，包括線粒體加工肽β亞基(Mitochondrial-processing peptidase subunit beta, MPPB)、mTOR調(diào)節(jié)相關蛋白(Regulatory associated protein of mTOR, RAPTOR)和胞內(nèi)氯離子通道4(Chloride intracellular channel exc-4, EXC4)(Zhangetal., 2017)。而在對大山雀的研究中發(fā)現(xiàn)，mTOR通路對于其沿海拔低氧適應相關(Quetal., 2015)。這就表明mTOR通路在昆蟲低氧適應中起到了關鍵作用并且可能與脊椎動物保守。對實驗室培育出的極端耐低氧品系果蠅研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路相關基因受低氧選擇，抑制低氧耐受果蠅的Notch信號通路顯著的降低了果蠅低氧下的存活率(Zhouetal., 2011)。在另一項研究中，科研人員比較了非洲東部棲息于不同海拔的同種蜜蜂的基因組，兩個不同的蜜蜂種群在外形和行為上都有明顯的差異，結果顯示兩個蜜蜂種群的遺傳背景差異很小，然而兩個種群在7號染色體上存在一個顯著的分化，位于該分化位點的基因編碼蛋白為多巴胺受體。這些蛋白的功能與蜜蜂的學習和采集行為密切相關，可能有助于提高其對高原環(huán)境的適應(Wallbergetal., 2017)。

在人類高原低氧適應研究中發(fā)現(xiàn)的許多基因功能在昆蟲中也得到很好的驗證。在一項慢性高原病的研究中，科研人員通過對患有慢性高原病的人群和非患病人群進行了全基因組水平的比較，并篩選得到一系列相關的遺傳差異基因。隨后科研人員在果蠅中得到這些差異基因的同源基因并在果蠅中進行了體內(nèi)功能驗證。該研究中鑒定了除了之前報道的慢性高原病相關基因SENP1以外，一些從未報道的基因如：SGK3,COPS5,PRDM1和IFT122也被發(fā)現(xiàn)。其中SENP1，SGK3和COPS5為HIF通路的關鍵基因，而PRDM1為非HIF通路依賴的低氧適應基因。在果蠅中對這些基因進行驗證發(fā)現(xiàn)，果蠅的耐低氧能力顯著增強(Stobdanetal., 2017)。使用同樣的方式，科研人員通過研究埃塞俄比亞高原人種的受選擇基因，并使用果蠅進行驗證，最終篩選出了3個未曾報道的基因參與低氧適應過程，這些基因分別是：CIC,LIPE和Paf-Aha(Udpaetal., 2014)。在另一項研究中，科研人員通過篩選和驗證了耐低氧果蠅中受選擇基因，這些基因的同源基因同時也在高原人種包括西藏人、夏爾巴人、埃塞俄比亞人和安第斯人的自然選擇基因中被發(fā)現(xiàn)(Jhaetal., 2015)。以上這些結果說明，對于昆蟲低氧適應的研究可以為理解低氧相關的人類疾病機理提供一定的參考作用，同時昆蟲具有良好的遺傳可操作性，為研究遺傳進化和功能驗證提供的良好平臺。

7 展望

昆蟲作為世界上分布最為廣泛的生物之一，對其低氧適應的研究無疑將會為近代醫(yī)學的發(fā)展提供極大的便利。目前對于昆蟲的低氧適應研究主要停留在遺傳機制的研究之上，而存在于遺傳機制背后更深層的分子機制依舊是存在不少的空白，例如，有研究證明PTP1B在低氧處理的平原飛蝗中出現(xiàn)了酶活性的上升，但是導致其活性提高的分子機制需要進一步研究；其次，在高原低氧環(huán)境中長期生存的昆蟲能夠保持活躍的能量代謝，而活躍的能量代謝會增加機體的氧化壓力，昆蟲如何抵御這種氧化壓力的分子機制尚未明確；除此之外，對于長期生活在低氧環(huán)境中的昆蟲，如何提高氧氣運輸、增加氧氣利用率雖然有相關報道，但僅是針對遺傳機制的的研究，其背后的分子機制也沒有深入探討。對于這些分子機制的進一步研究，必然是未來生物科學領域的一大挑戰(zhàn)，突破這一挑戰(zhàn)不但能更深層次的了解昆蟲如此繁盛的原因，更能對一些重大疾病的發(fā)生、發(fā)展過程提供一些豐富的啟示。

致謝:感謝張振宇博士和趙德健博士在文獻收集及編寫過程中給予的幫助。