小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴含量及胚胎發(fā)育的影響

張紫薇，于 博，戴佳格，武 麗，王俊麗，劉 兵，高建明

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

卵母細(xì)胞的冷凍保存對(duì)于優(yōu)良、瀕危動(dòng)物保種、人工輔助受孕等都有著積極的影響。目前豬卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍保存的妊娠率較低且鮮有報(bào)道。1989年Hayashi等成功冷凍從桑椹胚到孵化囊胚的豬胚胎，其解凍后移植產(chǎn)下后代[1]。2014年Somfai等對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞冷凍保存方法進(jìn)行優(yōu)化，使冷凍存活率大幅提高，并應(yīng)用固體表面冷凍法(solid-surface vitrification，SSV)玻璃化冷凍獲得囊胚，移植給4個(gè)受體后成功產(chǎn)下18頭活仔豬[2]。有學(xué)者利用開(kāi)放式拉長(zhǎng)塑料細(xì)管法(Open pulled straw，OPS)和細(xì)管法對(duì)豬GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的研究中發(fā)現(xiàn)，OPS法其解凍后存活率和體外成熟率均顯著高于細(xì)管法[3]。采用OPS法玻璃化冷凍12 h豬卵母細(xì)胞解凍后成熟率顯著高于程序化冷凍組[4]。OPS法玻璃化冷凍對(duì)于體外培養(yǎng)的綿羊胚胎的冷凍保存比傳統(tǒng)冷凍更有效[5]。然而玻璃化冷凍后的豬胚胎會(huì)出現(xiàn)一系列的凋亡現(xiàn)象[6]。細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的細(xì)胞死亡過(guò)程，由一系列基因控制，激活死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑或線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在途徑。Lin等研究發(fā)現(xiàn)囊胚延遲培養(yǎng)會(huì)增加細(xì)胞凋亡的發(fā)生率和促凋亡BAX基因的表達(dá)，并降低內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層細(xì)胞比率[7]。在體外成熟液和培養(yǎng)液中添加白藜蘆醇，可通過(guò)改善凍后豬孤雌激活囊胚的線粒體功能，降低囊胚細(xì)胞凋亡水平，從而提高其抗凍能力[8]。在冷凍保存期間哺乳動(dòng)物囊胚的冷凍損傷會(huì)誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，并會(huì)影響隨后的胚胎發(fā)育，甚至可能在胚胎著床前導(dǎo)致死亡。X-連鎖凋亡抑制因子(XIAP)是一種抗凋亡基因，冷凍保存后小鼠囊胚中XIAP的基因和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)[9]。在牛囊胚玻璃化冷凍解凍后培養(yǎng)過(guò)程中添加20 μmol/L半胱天冬酶(Caspase)抑制劑Z-VAD-FMK可以通過(guò)降低Caspase 3的水平，能夠抑制冷凍誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。

小檗堿(Berberine，Ber)是一種異喹啉生物堿化合物，具有多種藥理活性，包括保護(hù)心血管、降糖降脂、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)特性等作用[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期在豬卵母細(xì)胞成熟液及胚胎培養(yǎng)液中添加小檗堿，促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟(invitromaturation, IVM)及其囊胚體外發(fā)育，改善培養(yǎng)環(huán)境中的NO水平，有效降低豬卵母細(xì)胞中脂滴的含量[12-16]。豬卵母細(xì)胞的脂滴含量遠(yuǎn)高于其他物種[17]。豬卵母細(xì)胞冷凍解凍后的存活率和生存能力均較低。本試驗(yàn)采用OPS玻璃化冷凍方法，觀察小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴含量及體外受精(invitrofertilization，IVF)胚胎發(fā)育的影響，探討提高豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存效果的可能途徑，從而為建立更有效的豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豬卵巢的采集

健康母豬卵巢來(lái)自北京近郊區(qū)的屠宰場(chǎng)，將新鮮卵巢置于35 ℃含雙抗的生理鹽水中，1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 豬卵母細(xì)胞體外成熟

將取回的新鮮豬卵巢，按文獻(xiàn)[16]獲取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte complexes，COCs；GV期)。以mTCM199成熟液為對(duì)照組，以添加小檗堿的mTCM199成熟液為Ber組。于39 ℃、5% CO2、95%空氣、100%相對(duì)濕度的CO2培養(yǎng)箱中IVM培養(yǎng)44 h(其0～22 h添加0.5 μg/mL LH、0.5 μg/mL FSH，而22～44 h不添加LH和FSH)。IVM 44 h后，用0.1%透明質(zhì)酸酶脫除擴(kuò)散3倍以上的卵丘細(xì)胞，選擇排出第一極體的卵母細(xì)胞(MII期)備用，并統(tǒng)計(jì)第一極體排出率。

1.3 卵母細(xì)胞的化學(xué)損傷效果

將MII期卵母細(xì)胞(冷凍液處理對(duì)照組，冷凍液處理+Ber組)在預(yù)處理液(含有3 mg/mL BSA，無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS液中添加10% EG和10% DMSO)中平衡3 min后，移入冷凍液(EDFS 40為FS液添加20% EG和20% DMSO，F(xiàn)S液為基礎(chǔ)液添加30%的聚蔗糖和0.5 mol/L蔗糖)25 s，移入37 ℃盛有解凍液(PBS液中添加1.00、0.50、0.25 mol/L的蔗糖溶液)的表面皿中，按蔗糖溶液從高到低濃度梯度分別以1、3、3 min脫出冷凍保護(hù)劑，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入mTCM199成熟液中，在39 ℃、5% CO2、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)恢復(fù)2 h，觀察卵母細(xì)胞存活率。然后進(jìn)行體外受精及胚胎體外培養(yǎng)。

1.4 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍與解凍

OPS的制作參照Vajta等[18]報(bào)道的方法并改進(jìn)。用0.25 mL塑料細(xì)管(IMV，L’Aigle, Frence)加熱后手工拉制而成，細(xì)管末端長(zhǎng)約2～4 cm，內(nèi)徑約為0.20 mm，管壁厚約為0.02 mm。所有操作在室溫25 ℃±1 ℃，37 ℃恒溫載物臺(tái)上進(jìn)行。所需溶液預(yù)熱至37 ℃。將體外成熟前后的卵母細(xì)胞按各試驗(yàn)組別進(jìn)行處理，先在預(yù)處理液中平衡3 min，然后移入冷凍液平衡25 s，卵母細(xì)胞在冷凍液中平衡后吸入OPS管直接投入液氮中冷凍保存(每支管裝入5枚)。從液氮中取出冷凍的OPS管，迅速將含有卵母細(xì)胞的部分浸入37 ℃的盛有解凍液的表面皿中并吹出。按1.3脫出冷凍保護(hù)劑方法進(jìn)行，然后將其卵母細(xì)胞置入成熟液中，在39 ℃、5% CO2、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)恢復(fù)2 h，觀察卵母細(xì)胞存活率。然后進(jìn)行體外受精及胚胎體外培養(yǎng)。

各試驗(yàn)組別：GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍為GV期冷凍組；GV期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍解凍后在成熟液中添加小檗堿為GV期冷凍+Ber組；MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍為MII期冷凍組；在成熟液中添加小檗堿進(jìn)行體外成熟的MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍為MII期冷凍+Ber組。

1.5 卵母細(xì)胞存活的判定

在體視顯微鏡下觀察，解凍后GV期卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞的連接完整、卵丘細(xì)胞無(wú)脫落、卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻、透明帶無(wú)破裂。解凍后MII期卵母細(xì)胞大小正常，無(wú)形變，卵周隙清晰，卵黃膜完整，折光性好，胞質(zhì)均勻呈黑灰色；死亡的卵母細(xì)胞卵黃膜沒(méi)有折光性，胞質(zhì)顏色一般呈淺褐色。

1.6 豬卵母細(xì)胞脂滴染色

按照文獻(xiàn)[16]采用尼羅紅染色試劑盒(上海杰美基因，GMS12196)進(jìn)行卵母細(xì)胞脂滴染色，在激光共聚焦顯微鏡(FV-1000，OLYMPUS)激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm下，每個(gè)卵母細(xì)胞分層掃描20～30 次，觀察脂滴的熒光分布并連續(xù)拍照，獲得脂滴在卵母細(xì)胞內(nèi)的分布情況，然后壓片，采集圖像，應(yīng)用Graphpad prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件生成柱狀圖，Image J圖像分析對(duì)圖片進(jìn)行脂滴個(gè)數(shù)及熒光面積的統(tǒng)計(jì)。

1.7 豬卵母細(xì)胞體外受精

從北京近郊種豬場(chǎng)獲取新鮮長(zhǎng)白豬精液，控溫18 ℃左右1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。按照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行精子獲能。將各組別排出第一極體的卵周隙明顯、卵細(xì)胞膜完整的卵母細(xì)胞置入50 μL 的mTBM受精液滴中培養(yǎng)30 min。將獲能后的精子以1.5×106個(gè)/mL加入已放入成熟卵母細(xì)胞的mTBM受精液滴中，受精6 h。

1.8 豬體外受精卵體外培養(yǎng)

將各組別體外受精卵用添加0.4% BSA的NCSU-23胚胎培養(yǎng)液清洗3遍，之后分別移入39 ℃、5%CO2、100%濕度的CO2培養(yǎng)箱50 μL添加0.4% BSA的NCSU-23胚胎培養(yǎng)液(平衡4 h)液滴中，每滴15枚左右，進(jìn)行體外培養(yǎng)。每隔24 h或48 h觀察胚胎發(fā)育率(分別于培養(yǎng)48、72、96、120、168 h觀察其2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率、8-細(xì)胞率、桑椹胚率、囊胚率，間隔48 h換液)。

1.9 囊胚細(xì)胞差異染色

將各組別囊胚分別置入0.5%的鏈霉蛋白酶去除透明帶，在含有0.4% BSA的PVA-TL-Hepes液中清洗5 min，在39 ℃不含CO2的培養(yǎng)箱中孵育40 min(50 μL PVA-TL-Hepes小滴中添加5.5 μL兔抗豬全血清并覆蓋石蠟油)，用10%的胎牛血清結(jié)束抗體反應(yīng)5 min。囊胚在無(wú)石蠟油的PVA-TL-Hepes液中清洗5 min，并重復(fù)3次，在39 ℃不含CO2的培養(yǎng)箱中孵育90 min(50 μL PVA-TL-Hepes小滴中添加3.5 μL豚鼠血清并覆蓋石蠟油)，在豚鼠補(bǔ)體中孵育的同時(shí)用10 μL的H33342和10 μL的PI染色，之后在含有0.4% BSA的PVA-TL-Hepes液中清洗5 min，將囊胚轉(zhuǎn)移到載玻片上的甘油液滴內(nèi)，盡量少帶液體，用凡士林在載玻片四角點(diǎn)四個(gè)柱，蓋上蓋玻片，再輕輕壓蓋玻片，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.10 囊胚細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià)

將各組別囊胚在添加有0.1% PVA的TL-Hepes液中清洗3次，隨后在4%的多聚甲醛中固定1 h(室溫)，之后在0.1% PVA的TL-Hepes液中清洗3次，在0.1%(v/v)TritonX-100的檸檬酸鈉溶液中孵育1 h(室溫)。DNA碎片(DNA fragmentation)檢測(cè)應(yīng)用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit，Roche，Germany)，即采用TUNEL檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的程度，被固定的胚胎在TUNEL反應(yīng)混合液中孵育1 h(暗室，38.5 ℃)并清洗干凈后放入10 μg/mL PI中室溫避光染色5 min，滴加DABCO后封片，使用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)整個(gè)胚胎凋亡的細(xì)胞核，并計(jì)數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的方差分析和SNK多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和差異顯著性比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)重復(fù)≥3次。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟效果的影響

由表1可見(jiàn)，Ber組豬卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，第一極體排出率極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

表1 小檗堿對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響Tab.1 Effect of Ber on porcine oocytes in vitro maturation

2.2 小檗堿對(duì)豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液處理后化學(xué)損傷的影響

由表2可見(jiàn)，冷凍液處理+Ber組的細(xì)胞存活率極顯著高于冷凍液處理對(duì)照組(P<0.01)。Ber組及冷凍液處理+Ber組的2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率、8-細(xì)胞率、桑椹胚率和囊胚率分別極顯著高于對(duì)照組和冷凍液處理對(duì)照組(P<0.01)，冷凍液處理+Ber組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 小檗堿對(duì)豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液處理后化學(xué)損傷的影響Tab.2 Effects of Ber on chemical damage of porcine oocytes treated with vitrified frozen liquid

注：表中“-”表示成熟卵母細(xì)胞未經(jīng)玻璃化冷凍液處理。

Note:The "-" in the table indicates that mature oocytes are not treated with Vitrified frozen liquid.

2.3 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍解凍后豬卵母細(xì)胞存活率的影響

由表3可見(jiàn)，MII期冷凍+Ber組的細(xì)胞存活率極顯著高于MII期冷凍組與GV期冷凍組(P<0.01)，MII期冷凍組的存活率極顯著高于GV期冷凍組(P<0.01)。

表3 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍解凍后豬卵母細(xì)胞存活率的影響Tab.3 Effects of Ber on the survival rate of porcine oocytes after vitrification and thawing

2.4 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴數(shù)量及面積的影響

由表4和圖1可見(jiàn)，Ber組和MII期冷凍+Ber組脂滴數(shù)量及面積分別極顯著低于對(duì)照組和MII期冷凍組(P<0.01)，對(duì)照組和MII期冷凍組分別極顯著低于GV組和GV期冷凍組(P<0.01)，GV期冷凍組極顯著低于GV組(P<0.01)，MII期冷凍組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴數(shù)量的影響Tab.4 Effect of Ber on the lipid droplets number in vitrified frozen porcine oocytes

注：A. 各組卵母細(xì)胞的脂滴面積；B. 各組尼羅紅染色結(jié)果；1.GV組；2.GV期冷凍組；3.對(duì)照組；4. Ber組；5.MII期冷凍組；6.MII期冷凍+Ber組。Note: A. Each group of lipid droplets area of porcine oocytes; B. Results of Nile Red staining in each group; 1.GV group, 2. GV vitrification group, 3. Control group, 4. Ber group, 5. MII vitrification group, 6. MII vitrification+Ber group.圖1 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴含量的影響Fig.1 Effect of Ber on the lipid droplets content in vitrified frozen porcine oocytes

2.5 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響

由表5可見(jiàn)，GV期冷凍+Ber組卵丘細(xì)胞擴(kuò)散率與第一極體排出率均顯著高于GV期冷凍組(P<0.05)。

表5 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響Tab.5 Effect of Ber on vitrified frozen porcine oocytes in vitro maturation

2.6 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外受精胚胎體外發(fā)育的影響

由表6可見(jiàn)，在囊胚發(fā)育率上，Ber組極顯著高于對(duì)照組及其他各組(P<0.01)，GV期冷凍+Ber組和GV期冷凍組極顯著高于MII期冷凍+Ber組和MII期冷凍組(P<0.01)，而他們二者間均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但GV期冷凍+Ber組和MII期冷凍+Ber組的囊胚發(fā)育率均高于GV期冷凍組和MⅡ期冷凍組。

2.7 小檗堿對(duì)豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍體外受精囊胚細(xì)胞數(shù)和凋亡的影響

由表7可見(jiàn)，在囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞總數(shù)上，Ber組極顯著高于對(duì)照組及其他各組(P<0.01)；GV期冷凍+Ber組極顯著高于GV期冷凍組、MII期冷凍組和MII期冷凍+Ber組(P<0.01)，GV期冷凍組、MⅡ期冷凍+Ber組和對(duì)照組三者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。MII期冷凍組極顯著低于其他各組(P<0.01)。

由表8可見(jiàn)，在囊胚凋亡細(xì)胞數(shù)上，各組別之間關(guān)系與在囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞總數(shù)上的結(jié)果相反。

表6 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外受精胚胎體外發(fā)育的影響Tab.6 Effect of Ber on vitrified frozen porcine oocytes IVF embryo development

表7 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外受精囊胚細(xì)胞數(shù)的影響Tab.7 Effect of Ber on vitrified frozen porcine oocytes IVF blastocysts cell numbers

表8 小檗堿對(duì)玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外受精囊胚細(xì)胞凋亡的影響Tab.8 Effect of Ber on vitrified frozen porcine oocytes IVF blastocysts cell apoptosis

3 討 論

豬卵母細(xì)胞中的脂質(zhì)主要以脂滴的形式存在，其為卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育提供能量[20]。本試驗(yàn)中，GV組和GV期冷凍組的脂滴數(shù)量和脂滴面積分別極顯著高于MII期對(duì)照組和MII期冷凍組，GV期冷凍組的細(xì)胞存活率極顯著低于MII期冷凍組。Wei等利用OPS法玻璃化冷凍解凍牦牛卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MII期存活率顯著高于GV期卵母細(xì)胞，且MII期卵母細(xì)胞中細(xì)胞骨架相關(guān)基因(GJA1，CK8和ACTB)高表達(dá)[21]。經(jīng)IVM后牛卵母細(xì)胞的脂滴含量下降[22]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，IVM期間脂滴含量的降低意味著它們?cè)诔墒爝^(guò)程中被卵母細(xì)胞作為能量源消耗。玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍后的存活率可能與脂滴的含量有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)在胚胎培養(yǎng)基中補(bǔ)充胎牛血清，在桑椹胚和囊胚期巨大脂滴(>6 mm)的數(shù)量顯著增加，其胚胎的低溫耐受性差[23]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合，說(shuō)明玻璃化冷凍卵母細(xì)胞解凍后的存活率確實(shí)與脂滴的含量密切相關(guān)。然而本試驗(yàn)中，GV期冷凍組的囊胚率、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞總數(shù)均極顯著高于MII期冷凍組，而囊胚細(xì)胞凋亡數(shù)極顯著減少，推測(cè)GV期冷凍組胚胎質(zhì)量?jī)?yōu)于MII期冷凍組是由于在冷凍解凍過(guò)程中，脂滴在一定條件下轉(zhuǎn)化為能量，對(duì)卵母細(xì)胞冷凍后的修復(fù)具有一定的作用。有關(guān)機(jī)制還有待今后進(jìn)一步研究。

有研究表明高濃度的玻璃化冷凍保護(hù)劑和高冷卻速率可以防止冰晶的形成[24]，但被證明會(huì)顯著降低哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力[25]。Zhu等[26]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿與白藜蘆醇組合對(duì)降脂有增強(qiáng)作用。本研究中，在卵母細(xì)胞體外成熟液中添加小檗堿，可能通過(guò)影響miRNA及脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，降低豬卵母細(xì)胞中脂滴的含量，進(jìn)而促進(jìn)豬卵母細(xì)胞體外成熟[15-16]。本試驗(yàn)小檗堿可以極顯著降低新鮮成熟卵母細(xì)胞和玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞的脂滴數(shù)量和脂滴面積，顯著提高新鮮卵母細(xì)胞和玻璃化冷凍GV期卵母細(xì)胞的成熟率，GV期冷凍+Ber組相對(duì)于MII期冷凍+Ber組可以極顯著提高囊胚發(fā)育率，而且相對(duì)于GV期冷凍組和MII期冷凍組，其囊胚發(fā)育率有上升趨勢(shì)，這些可能是小檗堿通過(guò)影響脂滴含量實(shí)現(xiàn)的。

除了由低溫保存引起的損傷外，玻璃化溶液中的化學(xué)物質(zhì)是影響卵母細(xì)胞存活率的主要因素之一。冷凍保護(hù)劑具有一定的毒性，對(duì)細(xì)胞有一定的損傷。冷凍保護(hù)劑較高的毒性會(huì)阻礙卵母細(xì)胞的活力[27]。本試驗(yàn)小檗堿可以極顯著提高成熟卵母細(xì)胞冷凍液處理后體外受精囊胚的發(fā)育率和玻璃化冷凍成熟卵母細(xì)胞解凍后的存活率。由此推測(cè)，小檗堿對(duì)冷凍保護(hù)液的毒性具有一定的抑制作用。玻璃化冷凍時(shí)添加高濃度的冷凍保護(hù)劑容易引起化學(xué)中毒[28]，一旦操作過(guò)慢還可能會(huì)引起強(qiáng)烈滲透損傷，從而破壞卵母細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致紡錘體和染色體結(jié)構(gòu)異常，玻璃化冷凍解凍后卵母細(xì)胞的存活率、形態(tài)正常率、受精率和發(fā)育力等有所下降[29]。玻璃化冷凍降低牛GV期卵母細(xì)胞的成熟率[30]。通過(guò)向培養(yǎng)基中添加10-9mol/L褪黑激素可以顯著增加玻璃化冷凍解凍后小鼠成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力[31]。在體外成熟前補(bǔ)充咖啡因可以提高牛囊胚質(zhì)量，并表現(xiàn)出較高的抗凍性[32]。通過(guò)離心分離細(xì)胞中脂滴的極化，脂解和脂質(zhì)譜的化學(xué)修飾，能夠提高在富含脂質(zhì)的卵母細(xì)胞/胚胎中冷凍保存的有效性[33]。這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。

近20年來(lái)，小檗堿在細(xì)胞凋亡方面的作用不斷被發(fā)現(xiàn)。小檗堿可抑制心肌梗死后心力衰竭的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)影響心肌梗死后心力衰竭心肌組織ERS和CHOP及Caspase-12凋亡信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，上調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá)，下調(diào)Caspase-3表達(dá)，從而抑制心臟重塑，保護(hù)心臟功能[34]；可以通過(guò)增強(qiáng)自噬和激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路保護(hù)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞免受高葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[35]。本試驗(yàn)中，小檗堿極顯著提高新鮮和玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，降低其囊胚細(xì)胞凋亡，說(shuō)明小檗堿有利于豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍解凍后體外發(fā)育囊胚質(zhì)量的提高。

4 結(jié) 論

小檗堿通過(guò)降低玻璃化冷凍豬卵母細(xì)胞脂滴含量，從而提高其冷凍解凍后體外成熟率和體外受精胚胎發(fā)育的質(zhì)量；GV期玻璃化冷凍卵母細(xì)胞相對(duì)于MII期，在冷凍解凍后其體外受精胚胎發(fā)育的質(zhì)量有更好提高。相關(guān)機(jī)制還有待今后進(jìn)一步研究。

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