慢性阻塞性肺疾病伴認(rèn)知障礙患者同型半胱氨酸、8-羥基脫氧鳥苷酸、血清淀粉樣蛋白A 水平變化及其與認(rèn)知功能的相關(guān)性研究

郭陶陶，王晶晶，袁文杏，劉敏，張向民

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）主要特征是慢性氣流受限且呈進(jìn)行性發(fā)展，主要發(fā)病原因?yàn)橛泻怏w或顆粒進(jìn)入肺部而引發(fā)的炎性反應(yīng)［1］。研究表明，COPD 發(fā)生于≥40 歲人群，且發(fā)病風(fēng)隨年齡增長(zhǎng)而升高，≥80歲人群COPD 發(fā)病率達(dá)28%［2］。COPD 患者不僅易并發(fā)心血管疾病、神經(jīng)元損傷，且高達(dá)77%的COPD 患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知障礙，但具體發(fā)生機(jī)制目前尚不明確［3］。

同型半胱氨酸（Hcy）是含硫非必需氨基酸，血液中Hcy 因受外界因素影響而升高，易累積并形成高同型半胱酸血癥（HHcy）。研究表明，血漿Hcy 水平升高者阿爾茨海默?。ˋD）發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較血漿Hcy 水平未升高者增加1 倍，提示Hcy 在認(rèn)知障礙發(fā)生過程中具有重要作用［4］。8-羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG）是DNA 氧化損傷的重要生物學(xué)標(biāo)志物，COPD 患者血清8-OHdG水平明顯升高。氧化應(yīng)激是引發(fā)AD 的重要機(jī)制之一［5］。血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種急性時(shí)相蛋白，正常狀態(tài)下其水平較低。研究表明，SAA不僅與COPD相關(guān)［6］，還可升高白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等炎性因子水平，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、腦白質(zhì)損傷，并參與AD 的發(fā)生發(fā)展［7］。筆者推測(cè)Hcy、8-OHdG、SAA 可能是COPD 患者出現(xiàn)認(rèn)知障礙的重要原因。本研究旨在探討COPD 伴認(rèn)知障礙患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平變化及其與認(rèn)知功能的相關(guān)性，為COPD 患者認(rèn)知障礙的早期預(yù)防和診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月—2018 年3 月邯鄲市第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的COPD 患者88 例為COPD組，均符合《2011GOLD 慢性阻塞性肺疾病全球倡議：COPD 診斷、治療與預(yù)防 全球策略》［7］中的COPD 診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男50 例，女38 例；年齡39～84 歲，平均年齡（65.9±13.4）歲，另選取同期本院門診體檢健康者42 例為對(duì)照組，其中男23 例，女19 例；年齡40～83 歲，平均年齡（66.1±12.9）歲。對(duì)照組與COPD 組受試者性別（χ2=0.011）、年齡（t=3.589）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。根據(jù)認(rèn)知功能將COPD 患者分為認(rèn)知障礙組（n=57）和非認(rèn)知障礙組（n=31）。納入標(biāo)準(zhǔn)：能夠完成相關(guān)量表測(cè)試者；未接受過糖皮質(zhì)激素治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有吸煙史、飲酒史及近期補(bǔ)充過葉酸和/或維生素B12者；合并心、腦、血管疾病及腎功能不全、糖尿病、惡性腫瘤、老年癡呆等者。本研究經(jīng)邯鄲市第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者自愿簽署知情同意書。

1.2 認(rèn)知功能 采用蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（MoCA）評(píng)價(jià)所有受試者認(rèn)知功能，包括視空間與執(zhí)行能力、命名、注意力、語言、抽象、延遲回憶及定向力共7 項(xiàng)，滿分30 分，≥26 分為認(rèn)知功能正常，＜26 分為認(rèn)知障礙。

1.3 Hcy、8-OHdG、SAA 水平 所有受試者于早晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血4 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Hcy、8-OHdG、SAA 水平，試劑盒購自寧波瑞源生物科技有限公司。

1.4 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測(cè)所有受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA mRNA 表達(dá)情況。應(yīng)用Trizol 試劑盒提取總RNA，經(jīng)勻漿、離心、與異丙醇混合、冰乙醇洗滌后采用分光光度法檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm 時(shí)的RNA 純度和濃度，50 ℃ 20 min 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。后在qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)系統(tǒng)混合物中加入SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，CA，USA）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增系統(tǒng)為ABI 7500 Fast Real-Time PCR，擴(kuò)增總體積為20 μl，其中基因引物對(duì)0.4 μl、cDNA 1 μl、3 mmol/L MgCl22.4 μl、SYBGreen 10 μl、蒸餾水6.2 μl，共40個(gè)熱循環(huán)。Hcy、8-OHdG、SAA 及β-actin 引物序列和擴(kuò)增條件見表1，其中β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算目的蛋白mRNA 相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

表1 Hcy、8-OHdG、SAA 及β-actin 引物序列和擴(kuò)增條件Table 1 Primers sequence and amplification conditons of Hcy，8-OHdG，SAA andβ-actin

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)；Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA 評(píng)分，Hcy 水平與COPD伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG、SAA 水平及Hcy mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG、SAA mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MoCA 評(píng)分 三組受試者視空間與執(zhí)行能力、命名、注意力、語言、抽象、延遲回憶、定向力評(píng)分及MoCA總分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；認(rèn)知障礙組患者視空間與執(zhí)行能力、命名、注意力、語言、抽象、延遲回憶、定向力評(píng)分及MoCA 總分低于非認(rèn)知障礙組、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 Hcy、8-OHdG、SAA 水 平 三 組 受 試 者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；認(rèn)知障礙組患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平高于非認(rèn)知障礙組、對(duì)照組，非認(rèn)知障礙組患者Hcy、SAA 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

2.3 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；認(rèn)知障礙組患者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于非認(rèn)知障礙組、對(duì)照組，非認(rèn)知障礙組患者Hcy、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

表3 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比較Table 3 Comparison of Hcy，8-OHdG and SAA levels in the three groups

表3 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA 水平比較Table 3 Comparison of Hcy，8-OHdG and SAA levels in the three groups

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與非認(rèn)知障礙組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) Hcy（mmol/L）8-OHdG（μg/L）SAA（mmol/L）對(duì)照組 42 13.25±1.21 11.25±1.58 45.78±15.22非認(rèn)知障礙組 31 16.22±2.05a 12.25±1.02 75.52±10.84a認(rèn)知障礙組 57 19.98±1.02ab 19.99±1.21ab 90.32±16.55ab F 值 4.006 4.092 4.297 P 值 0.028 0.026 0.021

表2 三組受試者M(jìn)oCA 評(píng)分比較分）Table 2 Comparison of MoCA score in the three groups

表2 三組受試者M(jìn)oCA 評(píng)分比較分）Table 2 Comparison of MoCA score in the three groups

注：與認(rèn)知障礙組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 視空間與執(zhí)行能力 命名 注意力 語言 抽象 延遲回憶 定向力 總分對(duì)照組 42 3.85±1.20a 2.96±0.38a 5.93±1.02a 2.94±0.58a 1.99±0.39a 3.54±1.32a 5.99±1.63a 27.36±1.01a非認(rèn)知障礙組 31 3.64±1.00a 2.68±0.42a 5.83±1.12a 2.96±0.89a 1.77±0.48a 3.25±0.45a 5.91±1.44a 26.15±0.81a認(rèn)知障礙組 57 1.58±0.82 1.66±0.37 2.76±0.68 1.95±0.38 1.31±0.21 1.66±0.28 4.23±1.12 15.15±0.66 F 值 4.350 3.826 4.522 3.626 3.285 4.565 3.543 3.701 P 值 0.018 0.032 0.016 0.037 0.045 0.015 0.041 0.035

2.4 相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r 值分別為-0.456、-0.677、-0.413、-0.477、-0.699、-0.478，P＜0.05，見圖1、2）；Hcy 水平與COPD 伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG、SAA水平呈正相關(guān)（r值分別為0.335、0.442，P＜0.05，見圖3），且Hcy mRNA 相對(duì)表達(dá)量與8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量亦呈正相關(guān)（r 值分別為0.365、0.441，P＜0.05，見圖4）。

表4 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA in the three groups

表4 三組受試者Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較Table 4 Comparison of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA in the three groups

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與非認(rèn)知障礙組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) Hcy 8-OHdG SAA對(duì)照組 42 0.326±0.028 0.316±0.029 0.422±0.030非認(rèn)知障礙組 31 0.488±0.032a 0.359±0.028 0.715±0.024a認(rèn)知障礙組 57 0.625±0.031ab 0.587±0.025ab 0.896±0.022ab F 值 3.869 3.701 3.785 P 值 0.031 0.035 0.033

圖1 Hcy、8-OHdG、SAA 水平與COPD 伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA 評(píng)分相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 1 Scatter plots for correlations of Hcy，8-OHdG and SAA levels with MoCA score in COPD patients accompanied with cognitive disorder

3 討論

COPD 是一種免疫介導(dǎo)的炎性疾病，常伴發(fā)其他多種疾病，如心血管疾病、骨骼功能障礙等，目前已成為影響全球居民身體健康的疾病之一［8］。COPD 可導(dǎo)致視空間與執(zhí)行能力減弱、注意力急劇下降、語言能力消退、抽象及延遲回憶淡化等認(rèn)知障礙［3，9］，但目前其具體機(jī)制并不明確。研究表明，缺氧及高碳酸血癥引發(fā)腦內(nèi)代謝紊亂、神經(jīng)功能損傷可能是COPD 患者發(fā)生認(rèn)識(shí)障礙的重要原因之一［10］。此外，多種分子通路如炎癥機(jī)制和氧化應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)因子也被認(rèn)為是影響認(rèn)知功能的潛在原因［5，11］。

已有研究表明，HHcy 是腦卒中、認(rèn)知障礙、AD 等腦功能老化性疾病的危險(xiǎn)因素［12］。而Hcy 不僅可通過誘導(dǎo)淀粉樣蛋白沉積及Tau 蛋白過磷酸化誘發(fā)AD，還可誘導(dǎo)炎癥和黏附因子聚集［13］。Hcy 氧化產(chǎn)生的自由基和過氧化氫（H2O2）可導(dǎo)致腦部缺血及缺氧，抑制神經(jīng)傳導(dǎo)，導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，認(rèn)知障礙組患者Hcy 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、非認(rèn)知障礙組，非認(rèn)知障礙組患者Hcy 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組；Hcy 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，表明Hcy 與COPD 患者認(rèn)知障礙有關(guān)，且Hcy 水平越高則患者認(rèn)知功能損傷越嚴(yán)重。

COPD 患者常出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而8-OHdG 不僅是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要生物學(xué)標(biāo)志物，還是機(jī)體代謝和修復(fù)能力下降的重要標(biāo)志。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，后者可通過毒性作用而損傷周圍組織活細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞凋亡。研究表明，AD 患者大腦細(xì)胞核中8-OHdG 水平明顯升高［5］。本研究結(jié)果顯示，認(rèn)知障礙組患者8-OHdG 水平及其mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、非認(rèn)知障礙組，8-OHdG 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，提示COPD 伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG 水平較高，且8-OHdG 水平越高患者認(rèn)知損傷程度越嚴(yán)重。

COPD 患者常表現(xiàn)出全身性炎性反應(yīng)［15］。IL-6、TNF-α、白介素10（IL-10）等是常見的炎性因子，研究表明，上述炎性因子不僅在COPD 患者器官功能障礙中發(fā)揮重要作用，還參與了AD 的發(fā)病過程［11］。SAA在大腦中積聚過多可導(dǎo)致機(jī)體炎性因子水平升高，進(jìn)而引發(fā)腦細(xì)胞炎性反應(yīng)。研究表明，AD 患者SAA 水平明顯升高［7］，提示SAA 可通過調(diào)控炎性反應(yīng)而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。本研究結(jié)果顯示，認(rèn)知障礙組患者SAA 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組、非認(rèn)知障礙組，SAA水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)果相似。

有研究表明，COPD 患者Hcy 水平升高的同時(shí)一些炎性因子如C 反應(yīng)蛋白（CRP）也會(huì)發(fā)生活化，提示Hcy可能通過調(diào)控炎性反應(yīng)而參與COPD 發(fā)生發(fā)展［16］。此外，Hcy 水平升高還可促進(jìn)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致8-OHdG 水平升高［17］。本研究結(jié)果顯示，Hcy 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 均呈正相關(guān)，提示8-OHdG、SAA可作為Hcy 下游調(diào)控因子在COPD 患者認(rèn)知障礙中發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

圖2 Hcy、8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者M(jìn)oCA 評(píng)分相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 2 Scatter plots for correlations of relative mRNA expression quantity of Hcy，8-OHdG and SAA with MoCA score in COPD patients accompanied with cognitive disorder

圖3 Hcy 水平與COPD 伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG、SAA 水平相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 3 Scatter plots for correlations of Hcy with 8-OHdG and SAA in COPD patients accompanied with cognitive disorder

圖4 Hcy mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者8-OHdG、SAA mRNA 相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性的散點(diǎn)圖Figure 4 Scatter plots for relative mRNA expression quantity of Hcy with relative mRNA expression quantity of 8-OHdG and SAA in COPD patients accompanied with cognitive disorder

綜上所述，COPD 伴認(rèn)知障礙患者Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯升高，且Hcy、8-OHdG、SAA 水平及其mRNA 相對(duì)表達(dá)量與COPD 伴認(rèn)知障礙患者認(rèn)知功能損傷程度呈負(fù)相關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：郭陶陶進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)并撰寫論文；王晶晶進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；袁文杏進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理；劉敏進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、結(jié)果分析與解釋；張向民進(jìn)行論文修訂；郭陶陶、張向民負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。