超聲處理對大豆親脂蛋白結(jié)構(gòu)及溶解性的影響

李 楊 王迪瓊 齊寶坤 鐘明明 徐清清 謝鳳英

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

長期以來，大豆分離蛋白(Isolated soybean protein, SPI)被認(rèn)為由兩種儲存蛋白組成，即大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)，且SPI的功能特性取決于這兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用[1]。大豆儲存蛋白組分中含有一種占SPI 30%左右的親脂性蛋白質(zhì)(Lipophilic protein, LP)，有望作為天然乳化劑在食品工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[2]。因此，SPI的其他功能特性應(yīng)基于這3種蛋白質(zhì)組分的性質(zhì)重新考慮。文獻(xiàn)[3]研究發(fā)現(xiàn)，SPI較低的溶解度可以通過LP的存在來解釋?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對11S和7S的相關(guān)研究較多，對LP的相關(guān)研究較少。LP的主要成分是油體蛋白-磷脂，它是油體的原始成分，且具有較強(qiáng)的親油性[2]，可作為乳化劑提高乳液的穩(wěn)定性。由于LP水溶性差，降低了其乳化效果，因此提高LP溶解性對其應(yīng)用至關(guān)重要。

文獻(xiàn)[4]研究發(fā)現(xiàn)，將LP超聲處理5 min可使其在磷酸緩沖液中均勻分散，但未詳細(xì)論述不同超聲條件對LP結(jié)構(gòu)及溶解性的影響。目前，國內(nèi)外對蛋白改性的方法主要有物理法、化學(xué)法和酶法等，超聲波改性作為一種有效的物理改性手段被廣泛使用。如文獻(xiàn)[5]采用超聲處理顯著提高了花生分離蛋白的表面疏水性，進(jìn)而改善其乳化性；文獻(xiàn)[6]采用超聲處理使大豆分離蛋白形成可溶性聚集體，進(jìn)而提高其溶解度；文獻(xiàn)[7]證明，采用超聲處理可減小液滴尺寸，進(jìn)而提高小麥蛋白和大豆分離蛋白的乳化性。故超聲可作為提高LP溶解性及結(jié)構(gòu)特性的手段，而目前超聲條件處理對LP的影響研究尚屬空白。

本文探究超聲處理對LP的結(jié)構(gòu)及溶解性的影響，在超聲功率(120～480 W)和超聲時(shí)間(10、20 min)處理?xiàng)l件下，研究超聲對LP的物化作用，并確定最佳的超聲條件，在保留LP必要結(jié)構(gòu)特性的基礎(chǔ)上，提高其溶解度及其他功能特性，以期為LP的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸，北京新光化工試劑廠；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)，美國Sigma公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；6 L落地式凍干機(jī)，上海匯分電子科技有限公司；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；Delta320 型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器公司；FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；Q1000型差示掃描量熱儀，美國TA儀器；UV-5100 型高性能紫外可見分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器；Phomo型酶標(biāo)儀，鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1大豆親脂蛋白提取

大豆LP組分的分離由文獻(xiàn)[2]的方法經(jīng)修改后使用。將大豆磨粉，過60目篩后使用正己烷進(jìn)行脫脂，并在70℃干熱處理2 h，此時(shí)氮溶解指數(shù)降至75%，可有效防止LP與11S共沉淀。干熱處理后的脫脂豆粉按料液比8 g/mL加入到蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0。在20℃下攪拌1 h后3 000g離心10 min。分離上清液并加入10 mmol/L Na2SO3,然后用H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.8，隨后3 000g離心10 min分離上清液，將上清液用H2SO4調(diào)節(jié)pH值至5.0，并在55℃下處理15 min。然后加入50 mmol/L NaCl并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.5，3 000g離心10 min，沉淀即為LP組分，凍干備用。

1.3.2超聲處理

將4.8 g LP溶解在240 mL的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L, pH值7.0)，在室溫(20℃)下攪拌2 h，制得質(zhì)量濃度為20 mg/mL的大豆親脂蛋白溶液，將超聲處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)插入液面，進(jìn)行超聲處理，本試驗(yàn)選擇在20 Hz下，超聲功率為0、120、240、360、480 W，超聲時(shí)間為10、20 min，樣品編號見表1，每超聲處理4 s，間隔2 s。

表1 不同超聲處理樣品編號

1.3.3十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗(yàn)。分別配置12%的分離膠與5%的濃縮膠，將5%的2-巰基乙醇(2-ME)加入到樣品緩沖液中。將樣品和緩沖液的混合物在沸水中加熱5 min，用于電泳運(yùn)行的緩沖液是0.025 mol/L Tris-HCl，0.192 mol/L甘氨酸和0.1%SDS，上樣量為10 μL，之后凝膠采用0.1%考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色液(含45%甲醇和10%冰乙酸)染色30 min，并用脫色溶液洗滌脫色后分析。

1.3.4傅里葉紅外光譜(FITR)

將超聲處理后的大豆分離蛋白溶液進(jìn)行凍干，凍干后的樣品置于干燥器中用P2O5充分干燥，取樣品1.5 mg，與200 mg溴化鉀研磨混勻后壓片進(jìn)行紅外光譜測定。在試驗(yàn)過程中，為了減少蒸汽的干擾，用干燥的N2持續(xù)注入測量室。測定時(shí)波數(shù)范圍為4000～400 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率4 cm-1，得到的紅外吸收曲線采用Peak fitting軟件和高斯曲線擬合，分析大豆親脂蛋白不同超聲功率下二級結(jié)構(gòu)含量的變化[9]。

1.3.5內(nèi)源熒光光譜

將 20 mg/mL大豆蛋白溶液用pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋到0.1 mg/mL，取一份稀釋液3 mL置于石英比色皿中掃描熒光圖譜。掃描條件為：記錄發(fā)射波長200～500 nm，激發(fā)波長設(shè)置為290 nm，增長間隔為10 nm。

1.3.6外源熒光強(qiáng)度

參照文獻(xiàn)[10]的方法稍作修改，采用ANS作為熒光探針測定蛋白質(zhì)的外源熒光強(qiáng)度。分別稱取0.025 g不同品種蛋白樣品溶于50 mL 磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.0)中，在室溫條件下攪拌1.0 h后離心(10 000g，30 min)，取上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白質(zhì)量濃度，并用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.0)依次稀釋蛋白，使其質(zhì)量濃度在0.005～0.1 mg/mL之間，將所得梯度的上清液溶液與8.0 mmol/L ANS以體積比100∶1混合，靜置3 min后測其熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長390 nm，發(fā)射波長4 970 nm，夾縫為5 nm。以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度制圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的外源熒光強(qiáng)度。

1.3.7差示掃描量熱法(DSC)

參照文獻(xiàn)[11]的方法，用鋁制坩堝稱取3.0 mg(干基)樣品，按料液比6 mL/g加入去離子水，壓蓋密封后，置于室溫平衡后測定，差示掃描量熱法(DSC)測量使用Q1000型差示掃描量熱計(jì)以10℃/min的掃描速率在30～140℃范圍內(nèi)進(jìn)行。使用熱分析系統(tǒng)(TA-60WS)軟件測定變性峰的溫度。

1.3.8溶解性

參照文獻(xiàn)[12]的方法稍作修改測定大豆分離蛋白溶解性，用質(zhì)量濃度約為10 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液(pH值8.0)，攪拌1 h使樣品溶解，靜置2 min后，將上清液倒入離心管中離心15 min(10 000g)。取上清液2 μL稀釋10倍，采用BCA法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。以牛清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白的質(zhì)量濃度占樣品中總的蛋白質(zhì)量濃度的百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣的平均值，結(jié)果采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行處理，采用ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果和討論

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖1 不同超聲處理下LP的SDS-PAGE圖譜

不同超聲條件下LP的SDS-PAGE圖譜顯示如圖1(圖中M表示標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白)所示，LP中包含7S和11S的亞基以及脂氧合酶、膜蛋白，34 ku蛋白存在于蛋白質(zhì)的儲存液泡中，24、18、17 ku為來自油體蛋白[2-3,13]，LP中脂類質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(7.48±0.049)%，較11S(2.36±0.026)%與7S(1.45±0.047)%高很多[3]，其脂質(zhì)組分經(jīng)薄層色譜分析顯示主要為磷脂，如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和磷脂酰肌醇[2]，而由于含有較高含量磷脂，因此膜蛋白對考馬斯亮藍(lán)具有較低的染色敏感性[3]，其電泳圖上條帶強(qiáng)度較7S、11S的亞基弱。而本研究旨在探明超聲處理對LP結(jié)構(gòu)特性的影響，如圖1所示，與未超聲處理的LP相比，超聲處理后的LP亞基含量出現(xiàn)不同程度的改變，當(dāng)超聲時(shí)間為10 min，超聲功率在120～360 W時(shí)，分子質(zhì)量48 ku以上的亞基含量都明顯降低，這是因?yàn)槌暜a(chǎn)生的空化效應(yīng)破壞了大亞基結(jié)構(gòu)；當(dāng)超聲功率增加到480 W時(shí)，亞基含量整體降低，48 ku以上亞基條帶幾乎消失，這說明高強(qiáng)度超聲功率會引發(fā)LP亞基結(jié)構(gòu)破碎和解離。結(jié)果表明，適當(dāng)條件的超聲處理可有效保留LP亞基結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上改善LP的物化性質(zhì)。圖譜顯示超聲后亞基種類并沒有太大變化，表明超聲處理不會對LP的一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生太大影響，與文獻(xiàn)[14-15]研究結(jié)果一致。

2.2 FITR分析

超聲處理后，LP的FITR光譜圖如圖2所示，波數(shù)從1 640 cm-1到1 650 cm-1變化時(shí)透光率增加，超聲處理的空化效應(yīng)會導(dǎo)致β-轉(zhuǎn)角的展開，而無規(guī)則卷曲增加，使用傅里葉自反卷積(FSD)擬合和二階導(dǎo)數(shù)分析來實(shí)現(xiàn)最大頻帶變窄，降低信噪比并鑒定LP中存在的不同類型二級結(jié)構(gòu)，之后采用楊氏方程計(jì)算LP的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表2所示，超聲處理10 min時(shí)，隨超聲功率的增加α-螺旋減少，β-折疊先增加后減少，無規(guī)則卷曲增加，與超聲處理牛血清蛋白和乳清蛋白的結(jié)果一致[16-17]，而超聲處理20 min時(shí)，隨超聲功率的增加α-螺旋先增加后減少，β-折疊先增加后減少，再略有增加。此結(jié)果可能是由于超聲處理的空化效應(yīng)使氣泡振蕩并破裂，從而產(chǎn)生坍塌壓力、湍流和剪切應(yīng)力，影響了氨基酸的局部序列以及分子之間的相互作用并使β-轉(zhuǎn)角展開，無規(guī)則卷曲減少[18]。

圖2 不同超聲處理?xiàng)l件下LP的FITR光譜圖

表2 不同超聲處理下LP的二級結(jié)構(gòu)相對含量

注：同列不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

大豆蛋白所表現(xiàn)出的內(nèi)源熒光強(qiáng)度主要是因其含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)[19]，激發(fā)波長為280 nm，主要依靠Trp和Tyr發(fā)射熒光[20]，Trp熒光強(qiáng)度較強(qiáng)是由于Tyr與Trp之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，而熒光的變化可反映色氨酸微環(huán)境的變化[21]，因此色氨酸的熒光峰可近似看作大豆蛋白的熒光峰，從而反映大豆蛋白的三級結(jié)構(gòu)。由圖3可知，超聲處理后，LP的內(nèi)源熒光強(qiáng)度均發(fā)生不同程度的增加，在超聲處理時(shí)間為10 min時(shí)，內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著超聲功率的增加先增大后減小，并且最大波長(λmax)發(fā)生不同程度的紅移，可能由于超聲處理期間，LP分子通過水解解折疊，破壞其疏水作用[22]，Trp的微環(huán)境由疏水變?yōu)橛H水，一般情況下熒光波長會隨著溶劑極性的增大而紅移，內(nèi)源熒光強(qiáng)度也會有所增加，因?yàn)樵跇O性溶劑中π→π*躍遷所需的能差減小，躍遷概率增加。而超聲強(qiáng)度過大時(shí)會導(dǎo)致暴露于溶劑的生色團(tuán)數(shù)量增加，從而導(dǎo)致內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低。

圖3 不同超聲處理下LP的內(nèi)源熒光光譜

2.4 外源熒光強(qiáng)度分析

圖4 不同超聲處理下LP的外源熒光強(qiáng)度

外源熒光強(qiáng)度反映蛋白質(zhì)分子表面上存在的疏水基團(tuán)數(shù)量，文獻(xiàn)[19]研究認(rèn)為疏水相互作用對蛋白質(zhì)構(gòu)象、功能和穩(wěn)定性有重要影響。如圖4(圖中不同小寫字母表示差異顯著)所示，超聲10 min、功率為360 W以及超聲20 min、功率為240 W時(shí)外源熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，并且功率較低時(shí)呈現(xiàn)遞增趨勢。超聲波處理會破壞蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵引起蛋白質(zhì)分子一定程度的展開，以及最初在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水基團(tuán)暴露于外部環(huán)境，因此增加了疏水基團(tuán)的數(shù)量[23]，而超聲強(qiáng)度較大時(shí)，外源熒光強(qiáng)度下降，超聲強(qiáng)度極強(qiáng)時(shí)可能導(dǎo)致LP聚集，疏水區(qū)封閉[24]，而持續(xù)增加超聲功率及時(shí)間，可能由于超聲波誘導(dǎo)蛋白質(zhì)徹底變性，疏水殘基暴露，疏水性增加。本研究中，由圖4、5可看出，蛋白質(zhì)的外源熒光強(qiáng)度越大溶解度越大，文獻(xiàn)[23-24]也得出此結(jié)果。

2.5 差示掃描量熱法

DSC的峰值溫度T2反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，焓變ΔH是引起蛋白質(zhì)變性所需的能量，較高的焓值表示更有序穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[25]，通過檢測不同超聲條件下LP熱變性溫度及其焓變，分析LP的熱穩(wěn)定性，超聲處理后，LP的T2有所升高，360 W和240 W時(shí)的T2最高，提高了6～7℃，如表3所示。文獻(xiàn)[26-29]認(rèn)為，由于超聲處理時(shí)產(chǎn)生的剪切力，導(dǎo)致分子間二硫化物和非共價(jià)鍵被破壞，并且游離巰基失活，有效減少了超聲過程中蛋白質(zhì)的再聚集，當(dāng)超聲功率過大時(shí)，LP的變性溫度下降，可以推測此時(shí)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被大量破壞。而LP經(jīng)超聲處理后，焓值明顯下降，這可能與LP分子的展開有關(guān)，之后焓值隨超聲功率的增加而增加，可能與分子間疏水鍵部分重組有關(guān)[30]。因此，適度超聲可以提高LP的變性溫度，并且提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖5 不同超聲處理下LP的溶解性

表3 不同超聲處理下LP的DSC

2.6 溶解性

溶解性會促成或影響大多數(shù)蛋白質(zhì)所表現(xiàn)出的功能性質(zhì)，而LP由于含大量磷脂，相比7S、11S，其溶解性較差，圖5(圖中不同小寫字母表示差異顯著)顯示，超聲處理后，LP的溶解性得到了顯著改善，樣品D和G的溶解性最好，溶解度為41.1%和43.0%，提高了20個(gè)百分點(diǎn)左右。在超聲處理過程中發(fā)生的空化效應(yīng)會產(chǎn)生大量的空化氣泡，這會增加周圍塌陷氣泡區(qū)域的局部溫度和壓力[31]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的去折疊，構(gòu)象改變，進(jìn)而使其內(nèi)部親水性氨基酸殘基暴露[32]，并且由于超聲處理期間促使蛋白中的不溶性沉淀物形成可溶性聚集體[33]，因此溶解性得到顯著提升。而與肽鍵的水解關(guān)系不大，因?yàn)槌曁幚砗驦P的SDS-PAGE圖譜并無太大變化，此結(jié)果與文獻(xiàn)[23]的研究一致，由圖中樣品E、F、H可知，持續(xù)增加超聲功率及時(shí)間會導(dǎo)致再次溶解性降低，可能是由于不溶性聚集體的形成[34]。溶解性會影響大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，因此有必要確定最佳的超聲功率及時(shí)間，為改善LP的理化性質(zhì)及功能性質(zhì)提供最佳的預(yù)處理?xiàng)l件。經(jīng)試驗(yàn)確定最佳超聲條件為：在360 W超聲功率下處理10 min。

3 結(jié)束語

超聲處理對LP的結(jié)構(gòu)及溶解性具有相當(dāng)大的影響，超聲處理后在電泳圖中分子量未發(fā)現(xiàn)明顯變化，亞基含量有所改變，經(jīng)紅外、熒光光譜分析后發(fā)現(xiàn)，其二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。超聲處理后LP分子間的非共價(jià)鍵減少，分子解折疊，減少了蛋白質(zhì)分子的再聚集，提高了其變性溫度及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致功能性質(zhì)改變。本研究中，超聲功率為360 W時(shí)處理10 min和超聲功率為240 W時(shí)處理20 min，對LP的溶解性及疏水作用的改善效果最佳，而繼續(xù)增加超聲功率及超聲時(shí)間，則會對LP的性能產(chǎn)生負(fù)面影響。這是由于過剩的能量導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度解折疊，大量疏水殘基暴露，重新形成了不溶性聚集體。經(jīng)試驗(yàn)確定最佳超聲條件為：在360 W超聲功率下處理10 min。