桑葉生物堿測定方法研究進展*

吳曉紅，高生平，陳媛媛，蔣彩云，張漢鵬，劉敬華

(1 江蘇經貿職業(yè)技術學院，江蘇 南京 211168；2 南京工業(yè)大學浦江學院，江蘇 南京 211134)

在我國，桑樹自古以來就有較大范圍的種植和利用，是我國農耕文明的重要代表作物。桑樹廣泛分布在包括新疆地區(qū)在內的我國28個省區(qū)，享有“東方圣樹”的美稱。桑葉是藥食兩用品，傳統(tǒng)中醫(yī)理論中桑葉素有疏散風熱、清肺潤喉、清肝明目、滋陰補血之功效?，F(xiàn)代藥理研究證明，桑葉中多羥基生物堿類具有明顯的降血糖、降血脂作用[1-2]。桑葉中含有多種生物堿成分[3]，1-脫氧野尻霉素 (1-deoxynojirimycin，DNJ)是桑葉中多羥基生物堿的一種特征性成分，近些年來深受研究學者們關注，是一種糖苷酶抑制劑[4-6]。

桑葉中總生物堿的含量受桑葉品種、采摘時間、產地和藥用部位等多種因素影響[7]，準確快速測定桑葉中的總生物堿和生物堿單體含量，為桑葉的制劑質量控制及藥用價值進一步開發(fā)提供依據(jù)。本文擬對近年來國內學者就桑葉生物堿測定方法的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 桑葉生物堿的提取方法

生物堿的諸多價值吸引著廣大研究人員尋找合適的生物堿提取方法。桑葉生物堿的多羥基結構，使得在極性溶劑中溶解性較強。常規(guī)提取溶劑為水和乙醇，為增加提取效率，有報道采用酸水[8]、亞臨界水[9]、纖維素酶水溶液[10]等提取溶劑，提取方法采用煎煮提取[11]、加熱回流[12]、超聲輔助[13-15]、微波輔助[16-17]、真空氣流細胞破壁[18]等提取技術。

水提法雖能夠提取大部分生物堿，但水溶性雜質過多，提取液需要進一步分離純化，通常需要加入乙醇沉淀除去桑葉多糖類物質的干擾。有機溶劑提取法適用性較強，不過也存在著提取純度不高、較為耗時的缺點。有文獻[19]報道通過加熱回流的方式提取桑葉中的DNJ會造成其結構破壞，所測含量偏低。隨著新技術的應用，超聲提取、微波萃取等都呈現(xiàn)了較好的提取效果。真空氣流細胞破壁技術結合有機溶劑提取法可以大幅度提升生物堿的得率[17]。

2 桑葉生物堿的檢測方法研究概況

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 高效液相色譜-紫外檢測器法

紫外檢測器是液相色譜最常用的檢測器，該法要求被測物質要帶有發(fā)色團。而桑樹生物堿本身不吸收紫外光，需要衍生化反應生成能吸收紫外光的物質。唐靜等[20]采用柱前衍生化高效液相色譜-紫外檢測器法，以芴甲氧羰酰氯為衍生化試劑，以C18柱為色譜柱，檢測了桑葉中DNJ的含量，該方法操作簡便，結果準確，解決了DNJ無紫外吸收難以檢測的困難。劉韋鋆等[11]建立了柱前衍生化高效液相色譜法測定桑葉中DNJ的方法，流動相為乙腈-0.1%冰醋酸(11：16)，檢測波長為254 nm，并進行了方法學驗證。

2.1.2 高效液相色譜-熒光檢測器法

熒光檢測器是一種選擇性好、靈敏度極高的檢測器。但由于桑葉生物堿本身不發(fā)熒光，仍需要進行衍生化反應后測定。歐陽臻等[21]就針對桑葉DNJ采用了熒光檢測法。桑葉經酸法提取后，使用芴甲氧酰氯處理樣品發(fā)生衍生化反應，以激發(fā)波長為254 nm，發(fā)射波長為322 nm，流動相為乙腈-0.1%乙酸水溶液(55：45)。實驗結果顯示該法加樣回收率達到了97.2%。徐斌等[22]在前人基礎上采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測器法對22種桑葉中DNJ的含量進行了測定，改進了色譜分離條件，色譜流動相為乙腈-0.1%乙酸水溶液，以梯度洗脫的方法達到更好的分離效果。

2.1.3 高效液相色譜-二極管陣列檢測器法

二極管陣列檢測器與紫外檢測器相比，一次檢測可以得到各組分的光譜、色譜的三維譜圖，為后續(xù)的定性、定量分析提供了更多的依據(jù)，但測定桑葉生物堿類化合物仍需衍生化反應后進行測定。高林森等[22]利用該法檢測了桑葉中DNJ含量。以酸法提取純化后的DNJ，在弱堿性介質中與芴甲氧酰氯發(fā)生衍生化反應，265 nm為測定波長，采用C18色譜柱，分析發(fā)現(xiàn)目標色譜峰分離效果好，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率的測定結果均顯示該法穩(wěn)定可靠。

2.1.4 高效液相色譜-示差折光檢測器法

示差折光檢測器是通用型檢測器，優(yōu)點是不需要樣品有光學特性，缺點是靈敏度比其它檢測器差。歐陽華學等[23]建立了高效液相色譜-示差折光檢測法直接測定桑葉中DNJ的方法，以強極性氨基鍵合硅膠為固定相的色譜柱，以乙腈-水(70： 30)為流動相，取得了滿意的效果。該法最大的優(yōu)點是樣品不需衍生，具有操作簡便、快速、準確的特點，但由于示差折光檢測器的靈敏度低，該法應用不多。

2.1.5 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法

蒸發(fā)光散射檢測器響應值不需要樣品具有光學特性，因此檢測時避免了其它檢測器需要樣品帶有發(fā)色團或熒光基團的限制條件，應用范圍較廣。但該檢測器的靈敏度較低，干擾較大，測定誤差大。楊梅等[24]采用該法測定了不同產地的桑葉中DNJ的含量分布，流動相使用乙腈-水(70：30)混合液，并加入10 mmol/L醋酸銨溶液。平均回收率達95.98%，RSD為1.98%。王賀等[25]采用該法，以乙腈-水(85：15)為流動相，測得新疆藥桑葉中DNJ平均含量為1.93 mg/g。實驗結果表明該方法快捷簡便、結果可靠。

2.1.6 高效離子交換色譜-脈沖安培檢測法

Yashihashi等[26]開發(fā)了一種簡單、選擇性強、快速的高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測方法，用于定量測定桑葉產品中的DNJ。將桑葉茶樣品的水提取物在CarboPac MA1色譜柱中以NaOH溶液梯度洗脫進行測定。DNJ保留時間為7.26 min，檢出限為5 ng。該法干擾小，對DNJ具有高選擇性，并且在樣品制備、分離度和靈敏度方面優(yōu)于其它高效液相色譜技術。

2.2 液相色譜-質譜聯(lián)用法

質譜法是一種通過測量離子荷質比來區(qū)分不同成分的方法，通常與分離技術聯(lián)用以取得更好的效果。沈小月等[27]采用液相色譜-質譜聯(lián)用法檢測分析了桑葉生物堿成分，衍生化后分離并對照鑒定。對4個生物堿成分(含DNJ和蕎麥堿)進行檢測和鑒定，取得了良好的效果。

通過一級質譜只能測定組分的分子量；而對于分子量相近的，結構又相互區(qū)別的復雜混合組分，傳統(tǒng)的單一質譜功能不能滿足分析要求。利用多級串聯(lián)質譜技術，對上一級質譜圖的信號強或關鍵的信號峰，選作下一級的母離子來進一步分析，一直檢測2～3級。尚磊等[28]采用液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測了桑葉中總生物堿成分，以DNJ為參照，外標法計算桑葉總生物堿含量。此方法可檢測出樣品中的6種生物堿，包括DNJ、蕎麥堿等，總生物堿含量超過75%。Zhang等[29]用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，一次分離并且檢測出了桑葉中的DNJ和蕎麥堿的含量。

2.3 硅鎢酸鹽沉淀法

該法也稱為沉淀重量法，用于測定桑葉總生物堿含量，具有操作簡單、快捷、不需要復雜儀器、不需要使用昂貴對照品等優(yōu)點。該法原理是采用生物堿沉淀試劑硅鎢酸與桑葉總生物堿產生沉淀，稱量此沉淀重量，換算出生物堿含量。鄧海波[30]用沸水提取桑葉，提取液經純化處理后得總生物堿，用重量法測定其生物堿含量為27.1%。劉一衡[31]采用該法測定了新疆藥桑桑葉總生物堿含量，在正交試驗優(yōu)化出的最佳實驗條件下得到總生物堿含量為4.64 mg/g。何軍等[32]比較了紫外分光光度法和重量沉淀法在測定附子總生物堿含量中的差異，發(fā)現(xiàn)重量沉淀法準確性、穩(wěn)定性要優(yōu)于紫外分光光度法。

2.4 雷氏鹽比色法

雷氏鹽比色法也常用于測定總生物堿含量。桑葉經提取純化后供試品溶液在酸性介質中與雷氏鹽反應，生成不溶于水的生物堿雷氏銨鹽沉淀，經處理后，用70%丙酮溶液溶解，于525 nm附近測定其吸光度。沈維治等[33]采用該法測定了桑葉中總生物堿含量。結果顯示，不同桑樹品種、不同生長時期及不同部位的桑葉中總生物堿含量存在差異。蒲俊松[34]采用該法測定了桑葉總生物堿的含量，該方法操作簡單，穩(wěn)定性好，回收率高，能克服傳統(tǒng)方法中繁瑣、儀器設備昂貴等缺陷和不足。

2.5 氣相色譜法

氣相色譜法常用于熱穩(wěn)定性比較好、沸點較低的樣品，桑葉中DNJ不易汽化，需要衍生化后測定。李宏等[35]為測定DNJ的含量，通過預處理將樣品反應制得沸點較低的酯類物質，首次將氣相色譜法應用到了桑葉DNJ的檢測上。王濟強等[36]將桑葉生物堿提取液中的DNJ與六甲基二硅氮烷和氯化三甲基硅烷發(fā)生衍生反應，所得產物使用TRB5色譜柱進行分離，氣相色譜-質譜法定性，火焰離子化檢測器定量分析DNJ含量。該法采用氣相色譜-質譜法對硅烷化衍生物目標峰進行了確定，簡單、快速、準確。

2.6 薄層色譜法

楊翠平[37]確定了DNJ測定的薄層色譜法定性分析條件，對比了幾種常用的定性檢測生物堿的顯色劑和展開劑。實驗結果發(fā)現(xiàn)，以正丁醇-醋酸-水(4：1：1)為展開劑，氯-鄰聯(lián)甲苯胺為顯色劑，DNJ在薄板上的展開效果最好，DNJ斑點圓整、清晰。

李玲等[38]建立了新疆藥桑葉中DNJ的薄層色譜定性鑒別方法，以正丁醇-冰醋酸-水(4.5：1.2：1.2)為展開劑，在高效硅膠 G 薄層色譜板上展開，氯-聯(lián)甲苯胺為顯色劑，分離度好、斑點清晰，可作為藥桑葉定性鑒別指標。

2.7 實時直接分析離子源串聯(lián)質譜法

直接實時分析電離源是近年來出現(xiàn)的一種新型非表面接觸型熱解析大氣壓電離源，具有操作簡便，可以對樣品進行直接、無損、快速、原位分析等特點。徐斌[39]首次采用該法串聯(lián)質譜對桑葉中的DNJ進行了定量分析，并鑒定了桑葉中的蕎麥堿。將所測得結果與液相色譜-熒光檢測器法測得結果進行對比，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)的吻合度令人滿意，說明實時直接分析離子源串聯(lián)質譜法是一種有效、準確的、可用于定量桑葉中DNJ的分析方法。

3 結 語

近些年來，人們對桑葉活性成分的研究興趣大增，極大地促進了桑葉的藥用價值和營養(yǎng)價值的進一步開發(fā)，特別是具有治療糖尿病作用的桑葉生物堿。用于測定桑葉總生物堿的重量法和比色法所用儀器簡單，易于操作。薄層色譜法一般僅用于定性鑒定DNJ，而液相色譜法可選擇多種類型檢測器，常用于測定生物堿單體，應用最廣泛。液相色譜-質譜聯(lián)用法定性定量分析生物堿成分較為準確，但檢測成本高。氣相色譜法需要將生物堿衍生化方能進行測定，應用不多。隨著研究的深入，對生物堿種類、結構和性質的了解越來越多。新儀器分析技術的應用提高了檢測效率，多種分析方法的聯(lián)合使用更是大大提高了檢測準確度。可以預見將來還會涌現(xiàn)出更多新技術應用于桑葉生物堿的檢測，有助于桑葉藥用價值的開發(fā)。