載體固定化酶的應(yīng)用及前景展望*

劉雪凌，林 貝

(燕京理工學(xué)院，河北 三河 065201)

20世紀(jì)60年代，酶固定化技術(shù)作為一種新技術(shù)發(fā)展迅速。這種技術(shù)可以在一定的空間范圍內(nèi)將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理，使之成為不溶于水狀態(tài)，從而能反復(fù)和連續(xù)使用[1]。酶固定化技術(shù)使酶的穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，易于控制，便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)，有廣闊的應(yīng)用前景。

根據(jù)載體的有無可以將固定化酶分為載體固定化酶和無載體固定化酶。本文僅對(duì)載體固定化酶進(jìn)行論述。

1 固定化酶載體的選擇特點(diǎn)

將酶固定在不溶性聚合物或無機(jī)載體上，因此該項(xiàng)技術(shù)被稱為載體固定化酶技術(shù)。其中，載體的種類、理化性質(zhì)等都會(huì)對(duì)此技術(shù)造成影響[2]。

適宜的載體能夠提高載體固定化酶技術(shù)的使用效果，因此對(duì)載體進(jìn)行選擇非常重要。

其選擇特點(diǎn)如下：考慮載體的理化性質(zhì)，比如形狀、大小、孔徑、機(jī)械強(qiáng)度、能否耐酸堿腐蝕、能否耐高溫、能否耐微生物降解等；在載體材料方面，要考慮其材料是否價(jià)廉易得，能否進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)等；能否再生循環(huán)使用，可以降低成本，節(jié)能減排[3]等。

2 載體類型

2.1 傳統(tǒng)載體

傳統(tǒng)載體主要是動(dòng)植物的結(jié)構(gòu)蛋白，為天然高分子產(chǎn)物，例如可以從蝦的甲殼中可以提取殼聚糖、甲殼素[4]；從海藻中可以提取海藻酸鈉等。常用的傳統(tǒng)載體除了殼聚糖、甲殼素、海藻酸鈉外[5]，還包括瓊脂糖凝聚、卵清蛋白、瓊脂糖珠、木質(zhì)纖維[6]等。

這些載體的應(yīng)用可以延長(zhǎng)酶的壽命，提高酶的穩(wěn)定性，可以多次回收反復(fù)利用，其酶的固定化工藝簡(jiǎn)單易行；缺點(diǎn)是載體需要從大量原料中提取制備，材料機(jī)械性強(qiáng)度差，易被微生物分解，載體壽命比較短，可重復(fù)利用次數(shù)少。

2.2 新型載體

2.2.1 人工合成高分子材料

天然高分子可以通過修飾或者由化學(xué)手段人工合成高分子材料作為固定化酶的載體，其性能更加優(yōu)秀。環(huán)氧樹脂進(jìn)行化學(xué)修飾后成為功能性環(huán)氧樹脂，可以使固定化酶提高性能[7]；陰離子交換樹脂D202固定酶后，可以提高酶的活性，可連續(xù)使用28批次[8]；D380樹脂固定酶后，重復(fù)使用6次，酶活力仍可達(dá)到48.9%；聚苯乙烯二乙烯苯樹脂和D001樹脂也常被用來磷脂酶的固定；D3 11離子交換樹脂固定酶后，底物轉(zhuǎn)化率可高達(dá)91.3%[9]。

人工合成高分子材料載體可以大規(guī)模生產(chǎn)，機(jī)械性強(qiáng)度較高，理化性質(zhì)確定；缺點(diǎn)是與酶分子結(jié)合不牢固，容易脫落，其材料的生物相容性比較差，有細(xì)胞毒性，因此，其發(fā)展受到一定的限制。

為了避免以上缺點(diǎn)，人們嘗試將天然高分子材料與人工合成高分子材料通過物理或者化學(xué)手段形成復(fù)合材料。復(fù)合材料可以由兩種或者兩種以上材料合成，通過復(fù)合效應(yīng)產(chǎn)生原材料不具備的新性能。常見的復(fù)合材料包括天然高分子復(fù)合載體、合成一天然高分子復(fù)合載體以及無機(jī)-有機(jī)復(fù)合載體等。

海藻酸鈉、殼聚糖和明膠進(jìn)行組合是天然高分子復(fù)合載體[10]最常見的一種復(fù)合方法，其固定酶后比單一性載體的穩(wěn)定性高；也可以將纖維素衍生物醋酸纖維與聚四氟乙烯基膜[11-12]制成合成-天然高分子復(fù)合載體，更加有利于酶的固定。

2.2.2 無機(jī)新型材料

傳統(tǒng)的無機(jī)材料大多是從自然界直接獲得或者聯(lián)合其它物質(zhì)制成的材料。它的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得、機(jī)械強(qiáng)度大、抗酸堿、抗有機(jī)溶劑、抗微生物分解等；缺點(diǎn)是其結(jié)構(gòu)不好控制，固定酶的能力較差。

隨著科技發(fā)展，近些年來開發(fā)了很多新型無機(jī)材料，比如納米材料、介孔材料等，這些變化使無機(jī)材料具有了很多新的優(yōu)異性能。

納米材料有很多優(yōu)點(diǎn)，它們粒徑小，比表面積較大，表面結(jié)合能較大，可以容易與酶結(jié)合穩(wěn)定，還能很好提高酶的負(fù)載量和酶的穩(wěn)定性[12]。在生物醫(yī)學(xué)比如臨床診斷、靶向藥物和酶標(biāo)中、在細(xì)胞學(xué)特別是細(xì)胞符號(hào)及細(xì)胞別離中、在生物工程的酶固定化中均可使用磁性納米材料，一般應(yīng)用各種基團(tuán)如-COOH、-CHO、-OH、-NH以及-SH等形成功能性分子[13]。磁性可以對(duì)使用的納米載體進(jìn)行回收，提高商品的純度。常用的Fe3O4納米粒子通過不同鏈長(zhǎng)的烷基硅烷修飾形成新型磁性納米材料；Fe3O4納米粒子還可以與聚乙二醇聚合，使酶固定性能進(jìn)行改善[14]。除此之外，磁性納米材料還包括二氧化硅納米粒子、磁性纖維素納米晶體、磁性氧化氮納米顆粒等。磁性納米材料載體不僅有磁性特點(diǎn)，還有納米材料的有點(diǎn)，因此發(fā)展迅速。 碳基納米復(fù)合材料是近年來發(fā)展起來的又一新型納米材料載體。由石墨烯制成的復(fù)合材料超薄，其導(dǎo)熱性能、機(jī)械強(qiáng)度、化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性方面都具有優(yōu)良性能。其中，氧化石墨烯及其衍生物可以吸附金屬氧化物和固定酶。碳納米管具有良好的導(dǎo)電性能、吸附性能、生物相容性等，也被廣泛應(yīng)用在酶固定上[15]。

無機(jī)新型介孔材料具有有序孔道結(jié)構(gòu)、容易進(jìn)行修飾、孔徑分布較窄、比表面積大、孔隙率高和機(jī)械穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[16]。此類載體常為介孔硅膠材料。應(yīng)用表面活性劑液晶模板法可以制備得到有序介孔M41S系列[17]，包括MCM-41(六方狀)、MCM-48(立方狀)、MCM-36(層柱狀)、MCM-22(片狀)[18]等；應(yīng)用溶膠-凝膠法可以合成HMS介孔材料系列[19]。

2.2.3 智能型酶固定化載體

研究發(fā)現(xiàn)，相比較傳統(tǒng)固定化酶方式，智能型載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，優(yōu)點(diǎn)是酶的負(fù)載量增加，酶的穩(wěn)定性和活力均提高，底物和產(chǎn)物抑制降低，酶回收操作被簡(jiǎn)化[20]。目前常用的智能型酶固定化載體有溫度敏感型、pH敏感型、離子敏感型、極性敏感型、光敏型、磁響應(yīng)型、多重因素敏感型[21]等。由于目前大多數(shù)研究還停留在一些傳統(tǒng)材料的研發(fā)上，智能型酶固定化載體進(jìn)行酶固定化受到了一些限制[22]。

3 酶的固定化方法

酶的固定化方法非常多，針對(duì)不同的載體，可以采用不同的方法，對(duì)酶進(jìn)行固定。有時(shí)候在研究中需要綜合使用多種方法來進(jìn)行固定。

3.1 化學(xué)固定化方法

化學(xué)固定化方法主要為共價(jià)鍵結(jié)合法。共價(jià)鍵結(jié)合法常通過醚、硫醚、酰胺或氨基甲酸酯鍵形成共價(jià)鍵，酶可以被不可逆固定化[23]。參與結(jié)合的官能團(tuán)常常有由半胱氨酸、賴氨酸和天冬氨酸及谷氨酸的側(cè)鏈。該方法的影響因素較多，可以受到載體的親水性和穩(wěn)定性、離子強(qiáng)度、pH和溫度等因素的影響，每一個(gè)因素的變化都可能導(dǎo)致固定化酶的性質(zhì)發(fā)生變化[24]。此方法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合牢固，缺點(diǎn)是成本比較高。目前，共價(jià)鍵結(jié)合法研究較為深入且應(yīng)用相對(duì)較廣泛。

交聯(lián)法是采用雙功能或多功能交聯(lián)試劑，通過在酶分子和交聯(lián)試劑之間形成共價(jià)鍵從而固定酶法。一般以幾丁聚糖、殼聚糖等為載體，使用戊二醛、乙二醛、乙二胺、鞣酸、順丁烯二酸酐及雙偶氮苯等多功能試劑作為交聯(lián)劑，可以將半乳糖苷酶、胃蛋白酶、脲酶等多種酶進(jìn)行固定[25]。此方法的優(yōu)點(diǎn)是：適用范圍很廣，既適用于固定化酶，又適用于固定化菌體。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)比較強(qiáng)烈，固定化后的酶的活性回收率通常較低。如果降低交聯(lián)劑的濃度、縮短反應(yīng)時(shí)間，可以提高酶活性的回收利用率，但因交聯(lián)劑的價(jià)格昂貴，因此單獨(dú)使用這種方法較少，通常采用兩種或多種固定法，將交聯(lián)法作為輔助方法。

3.2 物理固定化方法

物理吸附法是一種常用的物理固定化方法，原理主要是利用固體吸附劑把需要固定的酶吸附到其表面上從而實(shí)現(xiàn)固定化。吸附劑可以是活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷等有強(qiáng)吸附能力的不溶于水溶液的吸附材料[26]。還有人利用離子吸附法來固定酶，主要是應(yīng)用具有離子交換基團(tuán)的不溶性物質(zhì)來吸附，通常使用陽離子和陰離子交換劑。此方法的優(yōu)點(diǎn)是工藝非常簡(jiǎn)單，操作條件比較溫和，從而酶的催化活力下降少，酶的構(gòu)象基本或很少發(fā)生變化[27]；此方法可以采用的載體多、價(jià)格比較便宜；固定好的酶分子水平高，不容易發(fā)生斷裂，酶分子回收利用率高；載體也可以回收再利用。

包埋法是指將酶包埋在高聚物的凝膠型或微膠囊型的包埋劑里的固定化方法。包埋法是酶固定化研究中最為普遍的一種物理方法[28]。此方法可以將酶固定在包埋材料內(nèi)，這種包埋材料能夠讓小分子底物以及代謝產(chǎn)物自由通過，底物在包埋材料里與酶接觸并反應(yīng)[29]。包埋材料通常有海藻酸鈉(SA)、聚乙烯醇(PVA)、驟丙烯酰胺(PAM)、瓊脂等。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，固定酶的時(shí)候酶未發(fā)生化學(xué)和物理變化[30]，對(duì)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)改變較少，酶回收利用率高。因?yàn)榇朔椒ò衙腹潭ㄔ诎駝┲卸纬晒潭ɑ∏?，所以固定化小球結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，強(qiáng)度大，不易滲漏，不易受外界因素影響[31]。

物理固定化方法還可以采用熱處理法，可以進(jìn)行菌體固定。菌體是酶的供體，同時(shí)也是酶的載體。因?yàn)槊冈诟邷叵氯菀鬃冃允Щ睿圆⒉贿m合所有的酶，只能用于那些熱穩(wěn)定好的酶，并且還要嚴(yán)格控制處理溫度和加熱的時(shí)間。此方法可以和其它方法綜合使用。

4 結(jié) 語

由于酶作為生物催化劑具有價(jià)格昂貴、壽命有限等缺點(diǎn)，而酶固定化技術(shù)可以使酶重復(fù)使用，增加酶穩(wěn)定性等，因此在生物醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、環(huán)境工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前，各種載體固定化酶都各自有優(yōu)缺點(diǎn)，因此發(fā)展方向應(yīng)為：開發(fā)更多更實(shí)用的載體，或者進(jìn)行多種載體復(fù)合以消除單一載體的弊端；隨著大數(shù)據(jù)和互聯(lián)網(wǎng)+的到來，建立酶固定化技術(shù)的數(shù)據(jù)庫也是十分必要的；還可以采用計(jì)算機(jī)推測(cè)合理的載體結(jié)構(gòu)，然后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。