眼斑芫菁在斑蝥素合成期的抑制性消減雜交文庫構(gòu)建及分析

王 宇， 張利萍， 殷幼平

（1.攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花617000； 2.攀枝花學(xué)院 附屬醫(yī)院，四川 攀枝花617000；3.攀枝花學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院，四川 攀枝花617000； 4.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶400030）

斑蝥素主要來源于芫菁科昆蟲中的眼斑芫菁，是我國《藥典》里面記載的一種傳統(tǒng)動物藥材［1］.近年來發(fā)現(xiàn)，斑蝥素及其衍生物如去甲斑蝥素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或者抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和增殖［2］，對于治療肝癌、淋巴癌、胃癌等腫瘤有很好的療效［3-5］.

眼斑芫菁斑蝥素合成具有性二型現(xiàn)象，雌性成蟲合成斑蝥素很少，主要由雄性成蟲合成.此外，雄性成蟲在不同發(fā)育階段其斑蝥素合成量具有顯著的差異.雄性成蟲羽化后第1—10 天雄性成蟲合成斑蝥素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.114% ～0.237%，羽化后第20—25 天斑蝥素質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇增加，從0.486%增加到0.942%，達(dá)到斑蝥素合成的高峰期［6］.同時，通過SDS-PAGE 和雙向電泳技術(shù)分析蘋斑芫菁在斑蝥素合成前期、大量合成早期和末期的蛋白質(zhì)組成的變化，發(fā)現(xiàn)3 個時期蛋白質(zhì)組成的變化趨勢與芫菁合成斑蝥素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著峰值變化相一致，表明芫菁體內(nèi)斑蝥素的合成是由多種蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程［7］.目前，由于眼斑芫菁的斑蝥素合成途徑仍不清楚，所以本研究通過構(gòu)建SSH篩選眼斑芫菁在斑蝥素合成期的差異表達(dá)基因，這為闡明斑蝥素合成途徑奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料眼斑芫菁成蟲采自貴州省羅甸縣，采回后在實驗室內(nèi)以室溫（30 ± 1）℃、相對濕度75% ±5%、光周期14 hL/10 hD 的條件下飼養(yǎng)，收集羽化后第6—10 天和第21—25 天的雄性成蟲作為供試材料.

1.2 主要試劑和儀器主要試劑包括TRIzol試劑（購于Invitrogen公司）、PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和SMART PCR cDNA Synthesis Kit（購于Clontech 公司）、RNase -free DNaseI（購于Fermentas公司）、mRNA純化試劑盒和pMD18 -T 克隆載體試劑盒（購于TaKaRa 公司）、標(biāo)記探針的DIG High Primer Kit（購于Roche 公司）、熒光定量PCR試劑盒（購于Bio -RAD 公司）、DNA 純化試劑盒（購于AXYGEN 公司）.主要儀器包括凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、PCR儀（Bio -Rad）、DU640 紫外分光光度計（Beckman）.菌株JM109 為本實驗室保存.所用引物及測序分別委托上海生工公司和華大基因公司完成.

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 分別取隔離飼養(yǎng)羽化后第6—10 天的雄性成蟲（driver）和第21—25 天的雄性成蟲（tester），液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中，-80 ℃保存，供提取RNA.

1.3.2 總RNA 提取和mRNA 純化 按照Invitrogen 公司提供的操作指南提取總RNA，然后用RNase-free DNaseI 進(jìn)行處理，隨后按照mRNA 純化試劑盒說明書要求純化mRNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA 的完整性和純度.

1.3.3 消減雜交文庫的構(gòu)建 參照消減文庫試劑盒說明進(jìn)行.將實驗組（tester）和驅(qū)動組（driver）的cDNA用RsaⅠ酶酶切和連接頭，2 組混合經(jīng)2 次液相雜交和2 次PCR 擴(kuò)增，最后將PCR 產(chǎn)物插入到pMD-18T載體中，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞JM109，構(gòu)建成cDNA消減雜交文庫.

1.3.4 斑點雜交篩選 用巢式PCR引物對插入的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增后，按照DIG High Primer Kit 說明進(jìn)行斑點雜交，進(jìn)一步去除假陽性克隆.

1.3.5 測序和序列分析 將點雜交陽性克隆送華大基因公司測序，用DNA Star軟件將測序序列除去兩端載體序列和接頭序列，即得到EST 序列；用PHRAP拼接程序?qū)㈩A(yù)處理后的EST序列進(jìn)行聚類分析、數(shù)據(jù)拼接.將ESTs 提交到Genbank（http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov.）的BLASTN 和BLASTX，對拼接后所得非冗余序列進(jìn)行同源性比對，確定各序列對應(yīng)的基因功能.使用KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：/ /www.genome.jp/kegg/）和AMIGO（http：/ /amigo.geneontology.org/cgi - bin/amigo/go.cgi）對所得ESTs進(jìn)行基因功能分析，全部ESTs 提交NCBI 的dbEST數(shù)據(jù)庫.

1.3.6 差異表達(dá)基因的熒光定量檢測 隨機(jī)抽取9 個EST序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計特異性定量PCR引物，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行引物特異性比對，引物具體信息見表1.以TAF5、UBE3A 和RPL22e為內(nèi)參基因，用qRT -PCR 對差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證.反應(yīng)體系（25 μL）為：1 μL cDNA、12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM II（2 ×）、上下游引物（10 μmol/L）各0.5和10.5 μL 水.反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性10 min；然后95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s進(jìn)行42 個循環(huán)，添加熔解曲線，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，每個樣品重復(fù)測定3次.采用IQ5 軟件對qRT-PCR得到的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

表1 qRT-PCR分析中的基因的引物序列Tab.1 The primers of selected genes analyzed by qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 RNA的檢測經(jīng)紫外分光光度計檢測，tester和driver總RNA的A260/A280比值在1.85 ～2.0之間，表明純度較高.經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，總RNA的18S和28S rRNA條帶清楚，無任何拖尾現(xiàn)象，表明沒有發(fā)生降解，完整性好（圖1）.用紫外分光光度計測定分離的mRNA，其A260/A280 比值在1.9 ～2.0 之間，mRNA 總量為3.0 μg，表明mRNA的純度和質(zhì)量滿足構(gòu)建文庫的要求.

2.2 斑點雜交分別以正向消減和反向消減的cDNA作為正向和反向探針，利用斑點雜交對本文庫中的1 500 個克隆進(jìn)行篩選，在正向探針的雜交結(jié)果中顯示為陽性信號，而在反向探針的雜交結(jié)果中顯示為陰性信號或正向探針雜交信號明顯強(qiáng)于反向探針雜交信號的克隆作為陽性克?。▓D2）.經(jīng)過篩選，選出陽性克隆285 個.

圖1 總RNA凝膠電泳鑒定Fig.1 The electrophoresis identification of total RNA

圖2 斑點雜交結(jié)果Fig.2 Differential screening of positive clones by dot blotting

2.3 測序結(jié)果和分析對文庫中的285 個差異表達(dá)克隆進(jìn)行測序分析.利用DNAStar和PHRAP軟件對EST序列去除載體序列和接頭序列，聚類分析、數(shù)據(jù)拼接，共拼接成130條ESTs，其中72條singletons，58條contigs，將處理后的ESTs提交到Genbank進(jìn)行blastn比對.在130條ESTs中，34條（26%）與假設(shè)蛋白質(zhì)基因有同源性；51 條（39%）與已知功能蛋白基因有同源性；而剩下的45 條（35%）與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性，可能代表了新的未知功能基因（圖3）.對51 條己知功能的同源ESTs 進(jìn)行功能分析，這些基因涉及多種代謝和應(yīng)答過程，如生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和解毒、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝和合成等（表2）.所有ESTs提交到NCBI中的dbEST數(shù)據(jù)庫，序列號為JZ139169-JZ139298.

圖3 130 條ESTs序列的功能分類Fig.3 Functional classification of 130 ESTs

2.4 差異表達(dá)基因的qRT -PCR 檢測為了準(zhǔn)確鑒定SSH 文庫中差異表達(dá)基因的可靠性，使用qRT -PCR分析9個EST序列在第6—10天和第21—25 天的雄性成蟲中的表達(dá)變化.在這些EST序列中，有3 個基因是編碼已知蛋白的基因，分別預(yù)測的是轉(zhuǎn)錄因子myb（JZ139170）、細(xì)胞色素P450單加氧酶（JZ139184）、異檸檬酸脫氫酶（JZ139199）和3 個假設(shè)蛋白質(zhì)基因JZ139223、JZ139225、JZ139236）；其余3 個基因是未知功能基因.結(jié)果顯示這9 個基因在雄性成蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)水平差異從（3.8 ±1.1）倍到（14.5 ±2.1）倍變化，差異顯著（圖4）.

表2 部分ESTs與已知基因的同源性比較Tab.2 Partial ESTs similarity analysis by comparing with the identified function genes in Genbank

表2 （續(xù)）

圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析Fig.4 qRT-PCR analysis of differentially expressed genes

3 討論

通過構(gòu)建SSH文庫，共篩選到130 個在眼斑芫菁雄性成蟲斑蝥素合成高峰期特異表達(dá)的基因，其中65%的ESTs與NR庫中的蛋白質(zhì)有高度的同源性，涉及多種代謝和應(yīng)答過程，如生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和解毒、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝與合成等，表明芫菁體內(nèi)斑蝥素的合成是由多種蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程.而35%的ESTs與數(shù)據(jù)庫中的序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性，可能代表了新的未知功能基因，由于目前昆蟲的遺傳信息比較缺乏，而鞘翅目昆蟲的遺傳背景更為缺失，因此這些基因的功能尚不清楚.

現(xiàn)有研究表明斑蝥素是一類倍半萜的衍生物，而倍半萜的形成需要通過甲羥戊酸途徑（MVA）［8-10］.此外，McCormick 等［11］以原野豆芫菁雄性為材料，同位素18O 標(biāo)記氧氣或水的實驗證明，原野豆芫菁的斑蝥素是由降解的法尼醇的碳骨架生成，斑蝥素中的四氫呋喃環(huán)上的氧原子及另外2 個氧原子都來自分子氧，另外一個氧原子來自于水，并提示斑蝥素可能是保幼激素（JH）的代謝產(chǎn)物.本文庫中也發(fā)現(xiàn)了幾個參與倍半萜合成及JH合成代謝的相關(guān)基因，這些基因可能參與了斑蝥素的合成.異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，它能催化異戊烯醇焦磷酸（IPP）與二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）合成牻牛兒焦磷酸（GPP），IPP和GPP被催化生成法尼焦磷酸（FPP）；FPP是合成倍半萜、法尼醇和JH 的前體物質(zhì)，倍半萜又能參與昆蟲防御物質(zhì)及激素的合成［12］.本實驗室已經(jīng)克隆到該基因的全長序列，在斑蝥素合成持續(xù)增長期內(nèi)（第5—25 天），該基因在雄蟲體內(nèi)的表達(dá)量也不斷升高并達(dá)到最大，而雌蟲的該基因在斑蝥素合成旺盛期（第22—25 天）的表達(dá)量極低，表明該基因在斑蝥素合成途徑中可能發(fā)揮重要作用［13］.EST（JZ139216）編碼乙醇脫氫酶，它能氧化法尼醇和法尼醛.法尼醇轉(zhuǎn)化為法尼醛、法尼醛轉(zhuǎn)化為法尼酸是JH 合成途徑中的2 個關(guān)鍵反應(yīng)［14］.EST（JZ139184）編碼細(xì)胞色素P450單氧酶，該酶不僅在昆蟲解毒中發(fā)揮重要作用，而且在一些昆蟲中細(xì)胞色素P450 單氧酶能使甲基法尼醇環(huán)氧化，有助于JH合成［15-16］.同時，還有一個EST（JZ139186）編碼保幼激素酯酶（JHE），它參與JH 代謝，可以在昆蟲的不同時期調(diào)節(jié)JH 的水平［17］.

本研究不僅豐富了眼斑芫菁的遺傳信息，而且發(fā)現(xiàn)一些與斑蝥素合成的相關(guān)基因，這些基因可能在調(diào)控斑蝥素合成中發(fā)揮重要作用.本實驗室正在采用基因敲除、RNA 干擾［18］等技術(shù)對這些相關(guān)基因進(jìn)行功能驗證，為最終揭示斑蝥素的合成機(jī)理奠定基礎(chǔ).