蛋白酶解對鰹魚肉乳化特性的改善

張繼磊，周 歡，曾小紅，蔡燕萍，丁玉庭，3，劉書來，3，*

(1.浙江工業(yè)大學 海洋學院，浙江 杭州 310014； 2.國家遠洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州 310014； 3.浙江工業(yè)大學 海洋研究院，浙江 杭州 310032)

根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)資料顯示，鰹魚產(chǎn)量約占世界金槍魚總產(chǎn)量的50%以上，是所有貿(mào)易鮪類中捕獲量最大的種類，具有很好的開發(fā)前景[1]。鰹魚中的暗色肉由于顏色深易氧化變質(zhì)，加工利用率很低。有大量關(guān)于提高鰹魚副產(chǎn)物暗色肉資源利用率的研究[2-5]。白色肉通常用于生產(chǎn)鰹魚罐頭、生魚片、干制鰹魚、調(diào)味品等低附加值的產(chǎn)品[6]。鰹魚肉是一種優(yōu)質(zhì)動物蛋白來源，不僅含有豐富的必需氨基酸，且具有較好的凝膠性；但由于天然的鰹魚蛋白分子量較大、溶解度小等原因?qū)е缕淙榛圆?，無法形成均勻穩(wěn)定的分散體系，使其在魚糜、乳飲料和蛋白活性劑等生產(chǎn)應(yīng)用中受到限制，需要通過蛋白質(zhì)改性提高其加工品質(zhì)。研究表明，蛋白質(zhì)改性還可以改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和生物利用率，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，獲得具有表面活性的酶解蛋白，可應(yīng)用于營養(yǎng)配方、活性肽和功能性蛋白的生產(chǎn)[7]。通過對鰹魚蛋白進行改性，使其具有良好的功能特性(包括溶解性、乳化性、穩(wěn)定性和起泡性)，可以拓寬其在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍并滿足實際生產(chǎn)的需要，增加其附加價值[8]。

蛋白改性包括物理改性、化學改性和酶法改性[9]。物理改性由于改性程度較低，改性效果不明顯，難以滿足生產(chǎn)需要?；瘜W改性通過化學試劑作用于蛋白質(zhì)，使部分肽鍵發(fā)生斷裂或者引入化學活性基團改善其溶解性、持水性和持油性，但會破壞蛋白質(zhì)的原有功能性質(zhì)且修飾后的蛋白水解物不易被人體消化吸收。酶法改性反應(yīng)條件溫和，且酶具有專一性，不會破壞蛋白質(zhì)的原有功能，已在食品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。Don等[10]采用真菌和細菌蛋白酶對變性大豆?jié)饪s蛋白進行水解，發(fā)現(xiàn)其顯著增加了蛋白質(zhì)的溶解度、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，但乳化能力沒有變化且乳化穩(wěn)定性有所下降。Kristinsson等[11]在酶解西洋鮭肌肉蛋白的動力學研究中發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶對魚肌肉基質(zhì)分解非常有效，且所用底物和蛋白酶的選擇，以及水解度可極大地影響所得水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)。目前，還沒有通過蛋白酶法改性提高鰹魚白色肉乳化活性和穩(wěn)定性的研究，本文采用胰蛋白酶、風味酶、木瓜蛋白酶對鰹魚白色肉進行改性，分析不同水解度下魚蛋白的乳化特性，找到一種具有優(yōu)良乳化性的改性魚蛋白制備方法，為鰹魚白色肉高值化利用提供理論支撐和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

冷凍鰹魚(Katsuwonuspelamis)由臺州興旺水產(chǎn)有限公司提供；一級大豆油購自中糧集團有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)責任有限公司；氫氧化鈉(分析純)購自西隴科學股份有限公司；甲醛(分析純)、冰乙酸(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司；五水硫酸銅(分析純)購自上海振欣試劑廠；硼酸(分析純)、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸鉀(分析純)購自上海凌峰化學試劑有限公司；硫酸(分析純)購自西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759型分光光度計，上海奧譜勒儀器有限公司；BS223S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-3C酸度計，上海精密儀器有限公司；CR21GII高速冷凍離心機，日本日立公司；IKA-T18高速分散機，德國IKA公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海江星儀器有限公司；Mastersizer2000激光粒度分析儀，英國Malvem公司；R/S-plus旋轉(zhuǎn)流變儀，美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 胰蛋白酶酶解工藝流程

首先，將鰹魚解凍后取白色肉，加入3倍質(zhì)量的水進行勻漿，將勻漿液的pH調(diào)節(jié)至8，置于30 ℃水浴中預熱10 min，分別加入胰蛋白酶(加酶量為2 000 U·g-1)、木瓜蛋白酶(加酶量為2 000 U·g-1)和風味蛋白酶(加酶量500 U·g-1)進行酶解。然后，每間隔一段時間進行取樣，將酶解改性魚蛋白置于100 ℃水浴中10 min，進行滅酶處理，使用流水冷卻后測定其水解度、乳化性、乳化液的粒徑和游離氨基酸含量。最后，將酶解液進行冷凍干燥處理，分析酶解前后魚蛋白的溶解性、乳化性和起泡性等功能特性的差異。

1.3.2 水解度的測定

游離氨基態(tài)氮的測定采用GB/T 5009.39—2003的甲醛滴定法?？偟康臏y定采用國標GB 5009.5—2016中的微量凱氏定氮法。水解度(DH)計算公式如下：

(1)

式中，游離氨態(tài)氮含量是采用甲醛滴定法測得的酶解液中-NH2的含量(mmol·g-1)；總氮含量是每g原料中總氮的毫摩爾數(shù)(mmol·g-1)。

1.3.3 乳化液粒徑與分離度的測定

將乳化液分散均勻，用滴管吸取少量加入到分散劑(水)中，用激光粒度儀測定乳化液的粒徑和分離度。激光粒度儀的測定范圍是0.02～2 000 μm。粒徑分離度的計算公式如下：

(2)

式中，X10、X50和X90分別表示從最小粒徑累計到顆粒總量的10%、50%和90%時的乳化液粒徑。

1.3.4 乳化性測定

乳化性的測定參考Shaviklo等[12]方法。將等量大豆油加入到蛋白液中制得質(zhì)量分數(shù)為1%的蛋白質(zhì)溶液，用高速分散機15 600 r·min-1分散均質(zhì)，分散后的乳液分為2份，一份裝入離心管中立即離心(1 000g，15 min)，另一份置于50 ℃水浴30 min后離心。

1.3.5 酶解液中游離氨基酸組成的測定

取一定量未酶解的蛋白懸浮液和優(yōu)化條件下的酶解液，用3%的5-磺基水楊酸沉淀蛋白和多肽，5 400g離心10 min，用移液槍取上清液并稀釋至所需濃度。所得液體經(jīng)0.22 μm水性濾膜處理后，采用氨基酸自動分析儀進行測定。經(jīng)離心和干燥處理后得到酶解沉淀物，使用5%的乙酸溶液溶解沉淀物中的氨基酸，最后使用氨基酸自動分析儀測定分析。

1.3.6 魚蛋白功能性質(zhì)的測定

溶解度測定：通常用氮溶指數(shù)(NSI)來評價，取0.2 g樣品與20 mL去離子水混合，用NaOH溶液或HCl溶液調(diào)節(jié)pH，震蕩30 min或者用磁力攪拌器攪拌1 h后，于5 400 g條件下離心10 min，上清液采用雙縮脲法測定溶液中的蛋白含量(g)，采用微量凱氏定氮法進行總氮的測定。氮溶指數(shù)公式如下：

(3)

起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定：配制1%的蛋白液50 mL，用高速分散機(13 500 r·min-1)分散30 min后，立即轉(zhuǎn)移到量筒中，測定泡沫和液體的體積V0，以及1、10、30、60、120 min時泡沫和液體的總體積V1。起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計算公式如下：

(4)

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 鰹魚肉酶解條件的優(yōu)化

酶解常用于蛋白改性，為了改善蛋白質(zhì)的乳化性能，本文采用3種蛋白酶對魚蛋白進行改性，篩選確定乳化性能效果較好的酶種類和酶解工藝。

2.1.1 水解度

以水解度為指標考察了3種酶的酶解效果，魚肉蛋白的水解度隨水解時間的變化如圖1所示。風味蛋白酶的酶解液隨著水解時間的延長水解度逐漸變大，特別是在前30 min內(nèi)水解度上升較快，水解度由4.1%上升到12.5%以上，30 min后反應(yīng)速度逐漸變慢，120 min時水解度達到20.1%，水解時間繼續(xù)延長，水解度總體趨于恒定。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解蛋白質(zhì)的水解度在前10 min變化較快，10 min后增加平緩，120 min時胰蛋白酶解蛋白質(zhì)的水解度達到15.3%，而木瓜蛋白酶僅為7.7%。

圖1 酶解時間對水解度的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.1.2 乳化液粒徑分布與離散度2.1.2 乳化性

結(jié)合圖1、圖2和圖3可知，酶解前10 min，改性魚蛋白的乳化特性和水解度均隨胰蛋白酶酶解時間的延長而增加。在第10 min時，改性魚蛋白的水解度為8.2%，此時的改性魚蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均達到最大值；10 min之后，改性魚蛋白的水解度不斷增大，但其乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸降低。因此，8.2%是魚蛋白改性的最佳水解度。

由圖2和圖3可知，在酶解過程中，使用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解改性的魚蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨酶解時間的變化呈先增加后減少的趨勢。而風味酶酶解改性的魚蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨酶解時間的延長逐漸降低。不同酶對魚蛋白乳化性的改善效果不同，其中胰蛋白酶改性效果最佳。

冷凍干燥過程中，由于油脂氧化、冷凍干燥不均等因素，會造成蛋白質(zhì)乳化性發(fā)生改變，不同水解度的酶解液受影響的程度可能不一樣。為了進一步驗證8.2%是否為改性魚蛋白的最佳水解度，將不同水解度的魚蛋白酶解液進行冷凍干燥得到不同改性魚蛋白，測定其乳化性活性和乳化穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。對比圖2、圖3和圖4可知，冷凍干燥前后改性魚蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性有所變化，但總體趨勢并未變。干燥后的濃縮酶解改性魚蛋白的最佳水解度為8.2%，此時，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均最大，約是未酶解魚蛋白的3倍。

2.1.3 乳化液粒徑分布與離散度

魚肉蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后，不同酶解程度下蛋白乳化液粒徑與分離度如表1所示。表中X10、X50、X90分別表示從最小粒徑累計到顆?？偭康?0%、50%、90%時的乳化液粒徑，其中X50幾乎接近顆粒的平均粒徑。由表1可知，水解度10%時其平均粒徑最大，水解度8.2%的次之，水解度13.7%和水解度15.3%時蛋白乳化液平均粒徑較小。從分離度來看，水解度為15.3%時分離度最小，乳化液更易保持穩(wěn)定，但此時的平均粒度小于水解度8.2%和水解度10%的改性魚蛋白。

圖2 酶解時間對魚蛋白乳化活性的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on fish protein emulsifying activity

圖3 酶解時間對魚蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on fish protein emulsifying stability

圖4 胰蛋白酶作用下水解度對乳化性的影響Fig.4 Effect of hydrolysis degree on emulsibility under trypsin

2.2 游離氨基酸

對酶解前后魚蛋白游離氨基酸進行測定，比較酶解前后氨基酸的組成和含量的變化。由表2可知，魚蛋白中含有各種豐富的氨基酸，游離氨基酸中主要有賴氨酸和精氨酸等，經(jīng)胰蛋白酶酶解后游離賴氨酸和游離精氨酸含量分別為287.043 μg·mL-1和262.377 μg·mL-1，較酶解前分別增加2.04%和1.76%。酶解后游離氨基酸總量617.466 μg·mL-1，較酶解前提高了2.15%，沉淀物中各種游離氨基酸的比例由0.76%至15.00%不等。

表1 魚肉蛋白水解后的分子粒徑與分離度Table 1 Molecular particle size and resolution after proteolysis of fish protein

表2 酶解前后游離氨基酸的組成與含量Table 2 Composition and content of free amino acid of protein hydrolysates before and after hydrolyzing

2.3 冷凍干燥魚蛋白的功能性質(zhì)

在不同pH條件下用胰蛋白酶酶解魚蛋白，然后進行冷凍干燥，研究冷凍干燥魚蛋白的溶解度、乳化性。由圖5可知，冷凍干燥后，未酶解的魚蛋白樣品溶解性較差，pH 4～9時溶解度僅為10%左右，等電點出現(xiàn)在pH 6，此時溶解度最低。經(jīng)酶解的樣品，溶解度有了明顯改善，pH 2～12時，溶解度均在45%以上。

由圖6和圖7可知，pH為4～9時，未酶解魚蛋白的溶解性較差，魚蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均較低，但pH<4和pH>9時呈現(xiàn)出較好的乳化性。pH值3～10時，酶解蛋白質(zhì)的乳化性有明顯提高，但在pH<3和pH>10時低于未酶解的蛋白。

圖5 pH對酶解前后魚蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of pH on solubility of fish protein before and after enzymolysis

圖6 pH對酶解前后魚蛋白乳化活性的影響Fig.6 Effect of pH on emulsifying activity of fish protein before and after enzymolysis

起泡性和泡沫穩(wěn)定性與蛋白溶解有關(guān)，濃度越大起泡性越好，溶解性越好，泡沫穩(wěn)定性越好。未酶解魚蛋白的起泡性僅為31.8%，酶解魚蛋白起泡性為53.1%，是酶解前的1.67倍。酶解前樣品的泡沫體積在第1 min內(nèi)減少了70%，60 min時，泡沫完全消失；而酶解后樣品的泡沫體積30 min僅減少了50%，泡沫持續(xù)時間長達120 min，為酶解前樣品泡沫持續(xù)時間的2倍(圖8)。

圖7 pH對酶解前后魚蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on emulsifying stability of fish protein before and after enzymolysis

圖8 酶解前后魚蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性Fig.8 Foaming and foam stability of fish protein before and after enzymolysis

3 討論

采用鰹魚白色肉為原料，通過酶解改性技術(shù)，得到了乳化性等功能性質(zhì)較好的改性魚蛋白，為鰹魚蛋白資源加工利用提供了依據(jù)。胰蛋白酶對鰹魚蛋白酶解改性提高其乳化性的效果優(yōu)于木瓜蛋白酶和風味蛋白酶。使用胰蛋白酶改性制備功能性改性魚蛋白，加酶量2 000 U·g-1、酶解時間10 min時，蛋白乳化特性較好，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性均是未酶解蛋白的2倍以上；與未酶解蛋白相比，改性魚蛋白溶解度有較大的提高。改性魚蛋白的溶解度在pH 2～10時都保持在45.0%以上，起泡性和泡沫穩(wěn)定性也有明顯提高，起泡性為酶解前的1.67倍，泡沫持續(xù)時間延長了1倍。因此，制備的改性魚蛋白具有優(yōu)良功能特性，可廣泛應(yīng)用于魚糜、乳飲料和蛋白活性劑等生產(chǎn)。

水解度用于表示蛋白質(zhì)被蛋白酶水解的程度，蛋白質(zhì)的乳化活性、乳化穩(wěn)定性與水解度之間有一定關(guān)聯(lián)，在較低水解度時，蛋白質(zhì)的乳化性隨著水解度的增加而提高，超過一定范圍，乳化性隨著蛋白質(zhì)的水解度增加而降低[11，13]。研究表明，乳化性最佳的蛋白水解度低于15%，因此將水解度控制在15%以下，以比較不同水解度魚蛋白酶解液的乳化性能[14-16]。大量預實驗發(fā)現(xiàn)，選用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，加酶量為2 000 U·g-1時，2 h內(nèi)水解度基本上處于15%以下；風味蛋白酶的加酶量500 U·g-1較適宜。不同蛋白酶酶解過程中魚蛋白水解度隨時間的延長逐漸增加，但存在較大差異，這是因為酶具有專一性，不同種類的酶其底物特異性與作用位點不同。風味蛋白酶屬于外切酶，對蛋白的水解不受作用位點的影響，只受其酶活性的限制，而胰蛋白酶和木瓜蛋白酶屬于內(nèi)切酶，同時受作用位點和酶活性的限制。與此同時，不同水解度的魚蛋白乳化液粒徑的大小分布與分離度不同，水解度越大，蛋白乳化液平均粒徑越小，分離度也越小。分離度表示粒徑的分散寬度和不均勻程度。分離度越小，蛋白乳化液被剪切得越均勻，粒徑的分布越窄，形成的乳化液分子越穩(wěn)定[17]。隨著水解度的增加，蛋白乳化液粒徑先增大后減小，這是因為未酶解的樣品中有部分不溶性大分子蛋白未參與形成乳化液，經(jīng)酶解后，這些蛋白被切割形成的肽類參與乳化液的形成，從而使乳化液平均粒徑增大；隨著酶解反應(yīng)的進行，大分子蛋白被水解成小分子肽，使得平均粒徑不斷下降。雖然分離度較小時，蛋白質(zhì)乳化液更易保持穩(wěn)定，但由于蛋白質(zhì)分子被過度水解，小分子肽之間交聯(lián)性降低，難以形成均勻的分散體系[18]。此外，魚蛋白的酶解液中游離氨基酸總量有少量升高，主要是因為胰蛋白酶是內(nèi)切酶，同時剪切位點只有賴氨酸和精氨酸殘基，酶解是從分子內(nèi)切割位點開始，不會造成氨基酸含量大幅度的增加，酶解程度較小時的主要產(chǎn)物是小分子蛋白或多肽，而不是游離氨基酸，而小分子蛋白和多肽的增加有利于增加蛋白的功能性質(zhì)；另外，酶解產(chǎn)生的疏水性氨基酸不易溶于溶液而產(chǎn)生沉淀[19]。本研究中魚蛋白在胰蛋白酶作用下，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性均隨時間的延長先增加后減小，這與Kristinsson等[13]的研究結(jié)果一致，酶解后的魚蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性也隨水解度增大先增加后減小。酶解制備的鰹魚蛋白在廣泛pH范圍內(nèi)具有更好的功能性質(zhì)，應(yīng)用范圍更廣。溶解性是保證蛋白質(zhì)其他功能性質(zhì)的先決條件，與蛋白質(zhì)的乳化性、起泡性和起泡穩(wěn)定性有著密切的關(guān)系[20]。通常魚蛋白的溶解度較低，有關(guān)鰱魚的研究中發(fā)現(xiàn)，新鮮魚蛋白在一定pH范圍內(nèi)的溶解度均在20%以下[21-22]。蛋白質(zhì)酶解是改善蛋白溶解性的重要方式，隨著水解程度的增大，蛋白質(zhì)溶解度不斷增加。

蛋白質(zhì)乳化特性主要受其溶解度、表面電荷、疏水相互作用、蛋白質(zhì)分子之間相互作用、擴散速率的影響[23]。隨著酶解時間的變化，水解度逐漸增加，酶解使得蛋白質(zhì)分子量減小，蛋白質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞，酶解產(chǎn)生的大量親水性和可電離的極性基團降低了蛋白質(zhì)分子的疏水相互作用，同時，也增加了與水分子的親和力和擴散到表面的速度等，從而使蛋白乳化性得到提高[20]。超出一定的水解度范圍，會導致蛋白質(zhì)分子量太小，多肽表面的活性作用和分子間的交聯(lián)作用降低，使得乳化性降低。因此，蛋白質(zhì)的改性要兼具良好的乳化性和溶解度。在不同pH條件下，酶解前后蛋白質(zhì)的溶解度和乳化性發(fā)生了明顯變化，溶解度的增加是因為酶解使蛋白質(zhì)之間不會發(fā)生凝聚；此外，胰蛋白酶的切割位點是賴氨酸和精氨酸殘基，酶解會使賴氨酸和精氨酸游離出來，這2種氨基酸是親水性氨基酸，增加了親水基團的總數(shù)，從而使蛋白質(zhì)溶解度增加。酶解前后蛋白質(zhì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性的差異，是由于強酸強堿條件下胰蛋白酶酶解產(chǎn)生的大量氨基酸殘基的親水性受到了限制，隨著pH的增加，蛋白乳化性表現(xiàn)為先減小后增大，這是因為pH>9或pH<4時，蛋白質(zhì)表面帶有大量的相同電荷，分子之間相互排斥而分散開，不易團聚沉淀，使得乳化活性和穩(wěn)定性大幅提高，這與張強等[24]在羊肚菌菌絲體蛋白理化特性的研究中得出的結(jié)果一致。經(jīng)過酶解的魚蛋白，起泡性有較大的改善，起泡穩(wěn)定性也有明顯提高，這是因為酶解使參與成膜的多肽和混入的空氣增加，在酶解過程中肽鏈的相互作用增加了界面膜強度，促使泡沫形成，并保持穩(wěn)定[25]。