沈 璐,李勤超,田中貴,稻村達也,伊日布斯,*
(1.昆明理工大學 生命科學與技術(shù)學院,云南 昆明650504; 2.日本京都大學 農(nóng)學研究科,日本 京都 606-8502)
根腫病是由蕓薹屬根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)侵染十字花科蔬菜引起的一種世界性土傳疾病[1],該病原菌傳染性強,傳播速度快,一經(jīng)感染可以誘導植物根部細胞產(chǎn)生細胞分裂素和吲哚乙酸,導致感病植株根部膨大,形成大小不一、形狀各異的根瘤,幾乎沒有側(cè)根,嚴重阻礙植物根部對土壤養(yǎng)分和水分的吸收,使植物地上部分生長緩慢,植株矮小,甚至死亡[2-3]。研究表明,當植物形成根瘤后,其他的微生物更容易破壞植物根部,造成植物根部腐爛,同時將大量具有活性的根腫菌休眠孢子釋放到土壤中引起傳播[4]。根腫菌休眠孢子在自然條件下可在泥土中存活7~8年,因此田間地塊一旦感病將長期不再適合種植十字花科作物[5-6]。
目前針對根腫病的防治措施主要有:(1)農(nóng)業(yè)防治:在感病田間施用生石灰以提高土壤pH是防治根腫病的有效方法。然而近年來因施用生石灰所造成的土壤板結(jié)、石灰殘留等問題也日益嚴重,長期施用生石灰使土壤pH處于堿性環(huán)境,容易導致根腫菌產(chǎn)生抗堿性,Donald等[7]發(fā)現(xiàn)土壤pH在7.2及以上時仍有根腫病發(fā)生。(2)化學防治:使用化學藥劑防治十字花科蔬菜根腫病是目前市場上最常用的方法[8]。但是藥劑防治花費大、費時費力,且藥劑防治一般是在發(fā)現(xiàn)根腫病后才進行防治,一旦根腫菌完成了侵染植物的第一階段,藥劑防治將不會產(chǎn)生任何效果。不僅如此,近年來由于過多地使用化學藥劑,使土壤中的農(nóng)殘積累日益嚴重,威脅著蔬菜的品質(zhì)和人體的健康。(3)生物防治:隨著科學的進步以及微生物制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應用,越來越多的研究顯示,生物制劑對根腫菌休眠孢子的萌發(fā)及侵染有明顯的抑制作用,尤其是枯草芽孢桿菌[9]和解淀粉芽孢桿菌[10]在防治根腫病方面表現(xiàn)出良好的應用前景,但是目前仍然處于研究階段。(4)抗病育種[11-12]:理論上抗病育種是防治根腫病最直接有效的方法,然而根腫菌生理小種較多,不同的抗病品種對不同的根腫菌生理小種變種表現(xiàn)出不同的抗性,而且不能針對性地應用抗病品種,這是限制抗病品種種植的主要因素。因此,尋找經(jīng)濟環(huán)保且能有效防治根腫病的方法是目前十字花科蔬菜最急需解決的問題之一。
土壤太陽熱處理是一種環(huán)保、有效的土壤消毒方法,使用后無土壤板結(jié)及農(nóng)殘積累等問題。在早期的研究過程中,人們常認為太陽熱處理主要通過提高土壤的溫度,抑制或殺死了土壤中的病原菌,有利于植物的健康生長[13-14]。2012年Marahatta等[15]發(fā)現(xiàn)太陽熱不僅能夠通過提高溫度以殺死土壤中的病原菌、抑制雜草種子的萌發(fā),還可以明顯提高土壤微生物活性,增加植株產(chǎn)量。由于操作簡單、費用低且環(huán)保無污染,因此太陽熱處理具有廣闊的應用前景[16-17]。本研究以小白菜為供試材料,測定太陽熱處理前后的土壤理化性質(zhì)、根腫菌休眠孢子數(shù)量、土壤微生物多樣性及發(fā)病率等變化情況,對太陽熱處理于小白菜根腫病的影響作出評價。
試驗地設置在云南省嵩明縣小街鎮(zhèn),試驗地土壤為沙壤土,中等肥力,微生物群落豐富,是小白菜根腫病的高發(fā)區(qū)。
試驗所用小白菜品種為超級小黃白。
熒光增白劑(M2R):由Sigma公司提供;溴化乙錠(EB)、氫氧化鈉(NaOH)和六偏磷酸鈉(SHMP):均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。
將試驗地大棚平均分為2個處理區(qū),包括非太陽熱處理區(qū)A和太陽熱處理區(qū)B。按照圖1采樣點的分布形式使用土壤采樣器分別采集深度為0~10 cm和10~20 cm處的土壤層樣品,每種樣品采集約2 kg。完成樣品采集后,對大棚進行深耕,并在每個處理區(qū)選擇適當?shù)脑囼烖c放置溫度計以測量在太陽熱處理期間土壤溫度的變化情況,隨后對大棚進行灌水處理,使土壤水分充分飽和,時間約30 min。最后在太陽熱處理區(qū)B覆蓋一層普通農(nóng)用聚乙烯薄膜,封閉大棚30 d。太陽熱處理結(jié)束后再次采集土壤樣品(采樣點同第一次),用于pH值和根腫菌休眠孢子數(shù)量的測定。
圖1 采樣點分布圖Fig.1 Sampling point distribution
第一次采樣時間:2015年5月1日(處理前的土壤樣品);第二次采樣時間:2015年6月2日(處理后的土壤樣品);太陽熱處理時間:2015年5月1日—2015年6月2日。
1.5.1 土壤溫度和pH值的測定
使用溫度計(Thermo Recorder TR-52)實時記錄溫度值。將溫度計從1開始編號,按編號順序?qū)⒚?個溫度計分為1組,將每組奇數(shù)編號溫度計的一端埋入土壤10 cm處進行測量,偶數(shù)編號溫度計的一端埋入土壤20 cm處進行測量,在距地面1 m處放置3個溫度計,測大棚內(nèi)溫度。太陽熱處理結(jié)束后使用T&D for Windows T-51/T-52讀取溫度計溫度并分析。
稱量10 g土壤樣品,加25 mL去離子水溶解,靜置25 min,使用pH計測土壤的pH值。
1.5.2 土壤根腫菌休眠孢子數(shù)量的測定
參照Shinoda等[18]的方法檢測土壤中根腫菌休眠孢子的數(shù)量。稱取20 g風干的土壤樣品與400 mL六偏磷酸鈉溶液混合均勻,并將pH調(diào)整到10,然后在180 W功率下對土壤泥漿溶液進行超聲波破碎,時間為10 min。將破碎過的土壤泥漿溶液pH調(diào)整到9,充分混勻后吸取40 mL混合液通過8層125 μm的篩網(wǎng)過濾,定容至100 mL。吸取300 μL混合液與等量的熒光增白劑和溴化乙錠充分混勻。在血球計數(shù)板兩側(cè)各加入10 μL染色的休眠孢子溶液,于400倍熒光顯微鏡下鏡檢。
1.5.3 太陽熱處理對小白菜根腫病防治效果
將采集的土壤樣品與腐殖土(121 ℃滅菌30 min)按體積比為1∶9的比例混合(采集的土壤樣品5 mL∶腐殖土45 mL),每個土壤樣品3次重復。在每個培養(yǎng)盤穴中播8~10粒白菜種子,出苗后6~8 d內(nèi)長出2~4片子葉時,剪去生長不良的白菜幼苗,只留一株健康的白菜幼苗,種植周期約32 d。
參考司軍等[19]的方法判斷小白菜根腫病的發(fā)病等級(圖2)。0級,根部無腫瘤,根系發(fā)育正常;1級,根系主根不發(fā)病或不明顯,側(cè)根有小腫瘤;2級,側(cè)根腫瘤大,且主根有小腫瘤;3級,主根明顯腫大,無須根。
發(fā)病率=感病植株/統(tǒng)計的總株數(shù)×100%。
病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病株數(shù)×各級代表數(shù)值)/(調(diào)查總株樹×最高病情級數(shù))。
1.5.4 太陽熱處理對土壤細菌微生物多樣性影響
(1)土壤總DNA的提取
稱取0.25 g土壤樣品,3個重復。用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA,詳細操作步驟參考試劑盒說明書,隨后用0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA條帶。土壤DNA保存于-20 ℃冰箱待用。
(2)土壤微生物的PCR擴增
將提取的土壤總DNA稀釋10倍作為聚合酶鏈式反應的模板,使用細菌通用引物擴增細菌16S rDNA V3~V5區(qū)[20-21],引物1為341F 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′,引物2為907R 5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′。
反應體系:10×TaqBuffer 2 μL、dNTP(10 mmol·L-1)1.6 μL、引物1為0.4 μL、引物2為0.4 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、模板1 μL、加入去離子水14.4 μL至20 μL反應體系,每次PCR反應均設置無菌水的陰性對照。
擴增條件:預變性94 ℃;94 ℃ 30 s;58 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環(huán);72 ℃ 5 min。擴增結(jié)束后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測土壤細菌PCR產(chǎn)物。
(3)變性梯度凝膠電泳(DGGE)
DGGE膠的濃度范圍為45%~60%,在電壓60 V的條件下電泳13 h。電泳結(jié)束后進行照膠分析。
圖2 根腫病分級標準Fig.2 Different-grade symptom of clubroot
(4)DGGE圖譜顯著性條帶的割膠、克隆和測序
利用北京百泰克生物技術(shù)有限公司多功能DNA純化回收試劑盒對優(yōu)勢菌進行割膠回收,取優(yōu)勢條帶過夜溶解離心的上清液為模板進行PCR擴增,擴增體系和擴增條件均與PCR-DGGE相同。然后交由昆明碩擎生物科技有限公司測序,測得的序列通過BLAST進行比對分析。
1.5.5 數(shù)據(jù)處理與分析
通過Microsoft Excel整理實驗數(shù)據(jù),采用SPSS11.0和R軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并計算土壤微生物的香濃維納指數(shù)。利用Image Lab軟件(Bio-Rad)將不同位置和不同灰度的DGGE條帶進行數(shù)字化處理,隨后對得到的DGGE條帶數(shù)據(jù)信息進行標準化處理。
在太陽熱處理期間,大棚內(nèi)最高溫度56.2 ℃,最低溫度10.4 ℃,平均溫度27.8 ℃,30 ℃以上累計時間245.3 h,35 ℃以上累計時間189.8 h,40 ℃以上累計時間134 h。在非太陽熱處理區(qū)A,土壤10 cm處的最高溫度41.3 ℃,最低溫度18.1 ℃,平均溫度為29.1 ℃,30 ℃以上累計時間259.2 h,35 ℃以上累計時間108.7 h,40 ℃以上累計時間5.3 h,在土壤 20 cm處的最高溫度32.8 ℃,最低溫度20.3 ℃,平均溫度為27.3 ℃,30 ℃以上累計時間69.7 h。在太陽熱處理區(qū)B,土壤10 cm處的最高溫度可達46.1 ℃,最低溫度20.5 ℃,平均溫度為33.2 ℃,30 ℃以上累計時間451.5 h,35 ℃以上累計時間222.5 h,40 ℃以上累計時間73.2 h,在土壤20 cm處的最高溫度39 ℃,最低溫度20.8℃,平均溫度為31 ℃,30 ℃以上累計時間399.3 h,35 ℃以上累計時間62.2 h(圖3)。
分析結(jié)果表明,在太陽熱處理區(qū)B 10 cm和20 cm處土壤的最高溫度、最低溫度、平均溫度及>30 ℃、>35 ℃、>40 ℃的累計時間(h)均明顯高于非太陽熱處理區(qū)A,且在太陽熱處理區(qū)土壤10 cm處>40 ℃累計時間和溫度的提高幅度明顯高于土壤20 cm處。其中太陽熱處理區(qū)10~20 cm處>30 ℃累計時間(399.3 h)較非處理區(qū)(69.7 h)增加了330.6 h,累計時間明顯增加。大棚土壤溫差變化明顯小于大棚內(nèi)的溫度變化,而且0~10 cm處溫差(25.6 ℃)高于10~20 cm處溫差(12.5 ℃),表明土層越深,溫差變化越小(表1)。
試驗前,對照區(qū)A的0~10 cm和10~20 cm處土壤的pH分別為4.76、4.88,太陽熱處理區(qū)B的0~10 cm和10~20 cm處土壤的pH分別為4.96、5.02。試驗后,A區(qū)的0~10 cm和10~20 cm處土壤的pH分別為4.97、5.07,B區(qū)的0~10 cm和10~20 cm處土壤的pH分別為5.60、5.78,結(jié)果表明太陽熱處理明顯提高了土壤的pH值(P<0.05),在0~10 cm處土壤的pH值提高了0.64,而10~20 cm處土壤的pH提高了0.76(圖4)。
圖3 太陽熱處理期間土壤溫度的變化Fig.3 Changes of temperature during soil solarization
表1 太陽熱處理對溫度的影響Table 1 Effect of solarization on temperature
圖4 太陽熱處理對土壤pH的影響Fig.4 Effects of solarization on soil pH
試驗前,太陽熱處理區(qū)B土壤0~10 cm處樣品中有活性的根腫菌休眠孢子數(shù)量為1.09×106g-1,10~20 cm處風干土壤中有活性的根腫菌休眠孢子數(shù)量為1.13×106g-1。太陽熱處理后,0~10 cm處的根腫菌休眠孢子數(shù)量減少至5.74×105g-1,而10~20 cm的根腫菌休眠孢子數(shù)量為9.74×105g-1,結(jié)果表明,太陽熱處理使土壤0~10 cm處根腫菌休眠孢子的數(shù)量明顯降低(P<0.05),而對10~20 cm處的根腫菌休眠孢子幾乎無影響(圖5)。
圖5 太陽熱處理對根腫菌休眠孢子的數(shù)量的影響Fig.5 Effects of solarization on resting spores of Plasmodiophora brassicae
分別使用試驗前在對照區(qū)A采集的0~10 cm和10~20 cm處的土壤栽培白菜,根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為84.62%、56.2以及87.1%、49.68,太陽熱處理區(qū)B發(fā)病率和病情指數(shù)分別為87.1%、45.24以及82.78%、49.89。太陽熱處理后,分別使用在A區(qū)采集的0~10 cm和10~20 cm處的土壤栽培白菜,根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為88.68%、52.83以及82.69%、46.80,而B區(qū)發(fā)病率和病情指數(shù)分別為49.12%、16.96以及73.68%、36.25。經(jīng)過太陽熱處理的B區(qū)植物根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)均降低,其中在0~10 cm和10~20 cm處土壤栽培的白菜根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)分別降低了37.98百分點、62.51%以及9.10百分點、27.34%。統(tǒng)計分析結(jié)果表明,太陽熱處理對0~10 cm處根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)影響顯著,而對10~20 cm處根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)無明顯的影響(圖6)。
2.5.1 16SrDNA片段PCR產(chǎn)物檢測
土壤細菌PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖7。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物條帶清晰,且無散帶現(xiàn)象。片段大小約680 bp,與預計大小一致。
2.5.2 土壤細菌DGGE圖譜指紋分析
圖6 太陽熱處理對根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響Fig.6 Effects of solarization on clubroot incidence rate and disease index
由圖8-A可知,在土壤0~10 cm處,土壤細菌的條帶數(shù)目較少,不同泳道條帶均含有條帶1、2、3(除條帶16),但這些條帶在不同泳道中的強弱并不相同,如條帶3在12~16泳道亮度明顯降低,表明在試驗后條帶3所代表的細菌微生物的數(shù)量明顯減少。條帶4只在13~16泳道中檢測到,表明在試驗后條帶4所代表的微生物種群富集,13~16泳道的條帶數(shù)目>9~12泳道的條帶數(shù)目>1~8泳道的條帶數(shù)目,說明太陽熱處理使土壤0~10 cm微生物群落結(jié)構(gòu)更加多樣化,且試驗后細菌群落的多樣化程度大于試驗前。土壤10~20 cm處的DGGE圖譜如圖8-B,不同泳道均含有共同條帶1、2、4,條帶3只在7~13泳道檢測到,說明在試驗后對照的條帶3代表了微生物富集,而太陽熱處理使該微生物的數(shù)量減少,條帶4在13~16泳道亮度明顯增加,說明太陽熱處理使條帶4所代表的物種數(shù)量明顯增加。
A,0~10 cm處的土壤樣品;B,10~20 cm處的土壤樣品;1~4,試驗前對照的土壤樣品;5~8,試驗前太陽熱處理區(qū)的土壤樣品;9~12,試驗后對照的土壤樣品;13~16,試驗后太陽熱處理區(qū)的土壤樣品;M,2 000 DNA marker。A, Soil samples at 0-10 cm; B, Soil samples at 10-20 cm; 1-4, Soil samples in the control zone before experiment; 5-8, Soil samples in the treatment zone before experiment; 9-12, Soil samples in the control zone after experiment; 13-16, Soil samples in the treatment zone after experiment; M, 2 000 DNA marker.圖7 細菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.7 The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification product of bacteria 16S rDNA
1~4,試驗前對照的土壤樣品;5~8,試驗前太陽熱處理區(qū)的土壤樣品;9~12,試驗后對照的土壤樣品;13~16,試驗后太陽熱處理區(qū)的土壤樣品;A,土壤0~10 cm處細菌微生物DGGE圖譜;B,使用Image-Lab對A圖進行數(shù)字化處理;C,土壤10~20 cm處細菌微生物DGGE圖譜;D,使用Image-Lab對C圖進行數(shù)字化處理。1-4, Soil samples in the control zone before experiment; 5-8, Soil samples in the treatment zone before experiment; 9-12, Soil samples in the control zone after experiment; 13-16, Soil samples in the treatment zone after experiment; A, DGGE profiles of bacterial at 0-10 cm; B, Digitized Fig. A with the Image-Lab; C, DGGE profiles of bacterial at 10-20 cm; D, Digitized Fig. C with the Image-Lab.圖8 土壤細菌DGGE圖譜Fig.8 DGGE profiles of soil bacteria
2.5.3 土壤細菌微生物多樣性的影響
土壤細菌微生物的香濃維納指數(shù)如表2。試驗前,太陽熱處理區(qū)B和非太陽熱處理區(qū)A 0~10 cm處土壤細菌群落的香濃維納指數(shù)分別為1.55、1.51,10~20 cm處土壤細菌微生物群落的香濃指數(shù)為0.83、0.91。試驗后,土壤0~10 cm處A區(qū)和B區(qū)細菌微生物的香濃維納指數(shù)分別為1.61、1.98,10~20 cm處A區(qū)和B區(qū)細菌微生物的香濃維納指數(shù)分別為1.19、1.53。結(jié)果表明,試驗前后A區(qū)不同深度的土壤細菌微生物多樣性無明顯變化;而在B區(qū),不同深度的土壤微生物多樣性均明顯提高,其中0~10 cm處和10~20 cm處土壤微生物多樣性分別提高了31%和68%。
表2 土壤細菌香濃維納多樣性指數(shù)Table 2 Shannon-Wiener index of soil bacteria
同列數(shù)據(jù)后沒有相同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。
The values with different letters in the same column represented significant differences (P<0.05).
2.5.4 DGGE條帶回收測序結(jié)果
優(yōu)勢條帶序列及與GenBank數(shù)據(jù)庫的比較結(jié)果如表3,結(jié)果表明,土壤中所檢測的條帶大部分為未培養(yǎng)的細菌,且測序的條帶與已發(fā)表的序列相似度均達到95%以上。
表3 DGGE膠中回收條帶序列分析結(jié)果Table 3 The comparative results of DGGE bands recovered with the sequence from GenBank
Matheron等[22]研究發(fā)現(xiàn),太陽熱處理可以通過改變土壤理化環(huán)境以影響活性根腫菌休眠孢子的數(shù)量并降低根腫病發(fā)病率。本研究結(jié)果表明,太陽熱處理使土壤在10 cm和20 cm處的溫度升高4.1 ℃和3.7 ℃,雖然不同深度土壤的溫度均得到提高,但幅度較小,不過溫度累計時間卻明顯不同:在土壤10 cm處,太陽熱處理區(qū)B的高于30 ℃、35 ℃和40 ℃累計時間與非太陽熱處理區(qū)A相比明顯增加。推測太陽熱處理區(qū)B溫度提高幅度較小是由于研究期間試驗區(qū)平均氣溫低于往年(僅27 ℃),且半月以上為多云天氣而導致(數(shù)據(jù)來自天氣預報)。
研究表明[23],低pH土壤更容易發(fā)生根腫病,其最適發(fā)病率的pH值為4.5~5.5,將土壤pH值調(diào)節(jié)至6.5以上可有效減輕根腫病的發(fā)生情況。本研究供試土壤試驗前的pH值為4.76~5.02,呈弱酸性,太陽熱處理使0~10 cm處土壤的pH值比試驗前提高了0.64,在10~20 cm處提高了0.76。
根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)與根腫菌休眠孢子的濃度和活性呈明顯正相關(guān),Gilardi等[24]認為,土壤太陽熱處理主要通過提高土壤溫度,直接殺死土壤中的病原菌或降低土壤微生物的活性,性,從而達到抑制土壤染病的目的。龍同等[25]認為,根腫菌休眠孢子在1×103mL-1以上時均能侵染白菜,而且隨著休眠孢子數(shù)量的增加感染率逐漸升高。本研究結(jié)果顯示,太陽熱處理使土壤中根腫菌休眠孢子的數(shù)量明顯降低,但風干的土壤中根腫菌休眠孢子的數(shù)量仍達到5×105g-1以上,該濃度依舊會導致根腫病的發(fā)生。因此,如何將根腫菌休眠孢子的濃度降低至不可使植物受到侵染還有待進一步研究。
目前,土壤微生物多樣性已成為評價土壤健康的重要指標之一[26],苗則彥等[27]研究表明,病原菌侵染植物后通過改變其生理代謝導致分泌物成分和含量的變化,從而造成健康植株和非健康植株根際微生物種類及數(shù)量的區(qū)別;劉琴等[28]實驗結(jié)果表明,受侵染土壤微生物功能的多樣性明顯低于健康土壤。目前普遍認為太陽熱處理主要通過提高土壤的溫度而改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)[29-31]。PCR-DGGE技術(shù)是研究土壤中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的重要方法[32],本文利用PCR-DGGE技術(shù)研究太陽熱處理對土壤細菌微生物多樣性的影響,結(jié)果顯示:在太陽熱處理區(qū)B不同深度土壤的細菌微生物多樣性均明顯提高,其中0~10 cm處和10~20 cm處土壤微生物多樣性分別提高了31%和68%,該結(jié)論與Smalla等[33]和Rumberger等[34]研究結(jié)果相似,提高土壤細菌微生物的多樣性能夠緩解土壤根腫病發(fā)病情況。
云南省嵩明縣是十字花科蔬菜根腫病的高發(fā)區(qū),本研究對該地區(qū)根腫病發(fā)病嚴重的菜地進行太陽熱處理,提高土壤的溫度,升高土壤的pH值,提高土壤細菌微生物的多樣性,使根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)均得到降低。后續(xù)可將太陽熱處理與有機改良土壤或生物防治等技術(shù)相結(jié)合,對土壤理化性質(zhì)、根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)、土壤氮磷含量、EC值及土壤酶類有所調(diào)節(jié),以效果明顯且綠色環(huán)保的方式降低根腫病發(fā)病率及病情指數(shù)。因此,太陽熱處理在根腫病的防治方面具有廣闊的研究前景和應用價值。