摻入外源淀粉的魔芋豆腐體外消化和發(fā)酵性能研究

雷 雯 鐘 耕 張東霞 黃思雨

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

魔芋豆腐是魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)在堿性條件下加熱時(shí)脫除乙?；纬傻臒岵豢赡婺z。研究表明，脫乙?；筀GM分子間的氫鍵連接增強(qiáng)，螺旋結(jié)構(gòu)消失[1-2]，降低了聚合物固有的水溶性[3]，使KGM持水性變差，極易發(fā)生脫液收縮現(xiàn)象[4]，使魔芋豆腐在常溫下軟塌無(wú)彈性，影響商品性。此外，高純度KGM制作的魔芋豆腐加熱時(shí)口感偏硬。因此，為改善魔芋豆腐外觀和食用品質(zhì)，制作魔芋豆腐時(shí)常添加淀粉。孫健等[5]通過(guò)將羥丙基淀粉添加到魔芋精粉中制作魔芋豆腐，改善了魔芋豆腐的硬度和析水率。

KMG在上消化道中不被消化，但在大腸中會(huì)被腸道菌群酵解[6-7]。目前大量研究集中于KGM的抗肥胖和控制血糖[8]、降膽固醇[9]、降血脂[10]、抗炎活性[11]、改善結(jié)腸生態(tài)、緩解便秘[12-13]、抗醉解酒[14]等功能作用。而關(guān)于魔芋豆腐的研究大都集中于魔芋豆腐的凝固條件、魔芋粉與其他原料(黃原膠[15]、卡拉膠[5]、淀粉[6]等)復(fù)配改善魔芋的硬度與持水性、堿促進(jìn)KGM凝膠的機(jī)理[4,16]等。現(xiàn)有許多生產(chǎn)商為改善魔芋豆腐品質(zhì)向魔芋豆腐中添加淀粉，但添加淀粉后對(duì)魔芋豆腐的健康價(jià)值是否有影響尚無(wú)相關(guān)研究。

試驗(yàn)擬對(duì)純魔芋豆腐、摻入芭蕉芋淀粉和玉米淀粉的魔芋豆腐進(jìn)行體外模擬消化和小鼠盲腸體外模擬發(fā)酵，以芭蕉芋淀粉和玉米淀粉為對(duì)照，探討摻入淀粉對(duì)魔芋豆腐消化性能和盲腸發(fā)酵性能的影響，為魔芋制品的健康消費(fèi)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

純化花魔芋精粉：KGM含量74.81%(干基計(jì))，黏度41 400 mP·s，未檢出含淀粉，四川森態(tài)源食品有限公司；

玉米淀粉：河北省玉峰實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

芭蕉芋淀粉：貴州省興義市余江芭蕉芋淀粉廠；

小鼠：雄性SPF級(jí)成年KM小鼠，許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

Ca(OH)2、HCl、NaOH、NaCl、葡萄糖：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

胃蛋白酶(3 000～3 500 U/g)、糖化酶(10萬(wàn)U/g)：北京索萊寶科技有限公司；

MRS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

豬胰酶：10萬(wàn)U/g，美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

酸度計(jì)：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：SY-10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：759型，上海菁華科技儀器有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010型，日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 參照孫健等[5]的方法，修改如下：稱取一定量魔芋粉與淀粉置于250 mL燒杯中，加入蒸餾水將總質(zhì)量補(bǔ)為100 g。沸水浴中糊化20 min，糊化過(guò)程中不斷攪拌。糊化后補(bǔ)償糊化過(guò)程中散失的水分，于70 ℃水浴溶脹20 min，加入一定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Ca(OH)2懸濁液攪拌均勻，靜置30 min，在蒸鍋中蒸30 min即制成魔芋豆腐。真空冷凍干燥、粉碎、過(guò)100目篩置于干燥器中備用。

1.2.2 體外模擬消化

(1) 體外模擬口腔消化：根據(jù)Ruth等[17]的方法測(cè)定人體唾液及唾液中淀粉酶的活性。體外模擬口腔消化試驗(yàn)根據(jù)陳春[18]的方法，修改如下：將各樣品配置成2 mg/mL 的水溶液，向A1～A5試管中依次加入2 mL唾液和樣品溶液，向B1～B5試管中依次加入2 mL樣品溶液和蒸餾水，向C試管中加入2 mL唾液和蒸餾水。將上述試管置于37 ℃水浴鍋內(nèi)孵育5 min，沸水浴中滅酶5 min。用DNS法測(cè)定各管中還原糖含量，并按式(1)計(jì)算淀粉水解率。

(1)

式中：

H口腔——模擬口腔消化時(shí)淀粉水解率，%；

GA——反應(yīng)后A管還原糖含量，g；

GB——反應(yīng)后B管還原糖含量，g；

GC——反應(yīng)后C管還原糖含量，g；

m淀——樣品中淀粉質(zhì)量，g。

(2) 體外模擬胃、腸道消化：根據(jù)Román等[19]的方法略做修改。取1.00 g樣品于25 mL 磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中分散，37 ℃預(yù)保溫10 min，用2 mL HCl溶液(1 mol/L)將消化液pH調(diào)至2.0，然后加入0.75 mL胃蛋白酶溶液(2 mg/mL，含9 g/L NaCl)，孵育30 min。用2 mL NaOH溶液(1 mol/L)將pH調(diào)至6.8，加入5 mL豬胰酶溶液(50 mg/mL)，37 ℃溫育4 h，分別于模擬胃消化0，30 min，模擬小腸消化0，20，40，60，90，120，150，180，240 min 時(shí)取200 μL消化液加至含1 mL無(wú)水乙醇的離心管中以停止酶促反應(yīng)，將樣品在4 ℃下以10 000 r/min 離心5 min。沉淀物用400 μL 75%乙醇洗滌1次，合并上清液。取300 μL上清液用1 600 μL乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L pH 4.5)稀釋，加入100 μL糖化酶溶液(25 mg/mL)，50 ℃孵育30 min。取出后用DNS法測(cè)定還原糖含量，按式(2)～(4)分別計(jì)算模擬胃、小腸淀粉水解率及樣品中抗性淀粉含量。

(2)

(3)

(4)

式中：

H胃——模擬胃消化時(shí)淀粉水解率，%；

G胃——模擬胃消化30 min時(shí)還原糖含量，g；

G0——模擬胃消化0 min時(shí)還原糖含量，g；

m淀——樣品中淀粉質(zhì)量，g；

H小腸——模擬小腸消化時(shí)淀粉水解率，%；

ΔG——取樣點(diǎn)與模擬小腸消化0 min時(shí)還原糖含量變化，g；

RS——抗性淀粉含量，%；

G120——模擬小腸消化120 min時(shí)還原糖含量，g。

1.2.3 小鼠盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵 將1.2.2中模擬小腸消化4 h后的消化液置于孔徑為3 500 Da截留分子尺寸的透析袋中，4 ℃下用去離子水透析。透析后，通過(guò)DNS法測(cè)定透析袋中還原糖含量確保去除所有還原糖，并將保留物冷凍干燥[20]。

根據(jù)秦清娟等[7]的方法制備盲腸內(nèi)容物稀釋液，根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基。向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的消化后凍干樣品作為碳源，陽(yáng)性對(duì)照組加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的葡萄糖，陰性對(duì)照組不加任何碳源。再加入體積分?jǐn)?shù)10%的盲腸內(nèi)容物稀釋液，混合均勻，通入氮?dú)馀懦l(fā)酵罐中空氣，密封。以上操作均在無(wú)菌臺(tái)進(jìn)行，每組樣品設(shè)置5瓶，于37 ℃厭氧發(fā)酵箱中分別培養(yǎng)0，4，8，12，24 h，向瓶中加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的硫酸銅溶液終止發(fā)酵[8]。

1.2.4 發(fā)酵液pH的測(cè)定 在加入硫酸銅溶液前用酸度計(jì)直接測(cè)定發(fā)酵液的pH值[22]。

1.2.5 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(SCFA)含量測(cè)定 將發(fā)酵液5 000 r/min離心20 min，取0.5 mL上清液，分別加入 50%乙醇0.5 mL，濃鹽酸3 μL，渦旋振蕩3 min，40 W超聲處理20 min，再5 000 r/min離心20 min，取上清液過(guò)0.25 μL濾膜，經(jīng)氣相色譜測(cè)定SCFA含量[23]。以乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氣相色譜柱：DB-FFAP柱(30 m×0.53 mm×0.50 μm)；升溫程序：柱溫80 ℃，保持0.5 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min，以20 ℃/min 升溫至200 ℃，保持1 min；壓力60.1 kPa；進(jìn)樣量1 μL；尾吹流量30.0 mL/min，氫氣流量40.0 mL/min，空氣流量400.0 mL/min[24]。

1.2.6 發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量測(cè)定 按GB 4789.35—2016執(zhí)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示有顯著差異。采用Origin lab 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋豆腐配方優(yōu)化

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魔芋豆腐中摻入淀粉可改善魔芋豆腐的軟硬度，但不同淀粉理化性質(zhì)差異較大，要達(dá)到同等品質(zhì)的魔芋豆腐，不同種類淀粉的添加量不同。以魔芋豆腐的硬度和持水性為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到純魔芋豆腐、芭蕉芋淀粉魔芋豆腐、玉米淀粉魔芋豆腐的配方，如表1所示。

表1 魔芋豆腐配方Table 1 Konjac tofu formula %

由表2可知，芭蕉芋魔芋豆腐和玉米魔芋豆腐的持水性顯著高于純魔芋豆腐，且25 ℃時(shí)，芭蕉芋魔芋豆腐和玉米魔芋豆腐硬度顯著大于純魔芋豆腐，改善了常溫時(shí)魔芋豆腐的外觀。人進(jìn)食魔芋豆腐的溫度在45 ℃左右，此時(shí)芭蕉芋魔芋豆腐和玉米魔芋豆腐的硬度顯著低于純魔芋豆腐，改善了純魔芋豆腐加熱后食用口感偏硬的問(wèn)題。

表2 魔芋豆腐的持水性與硬度?Table 2 Water holding capacity and hardness of konjac tofu

? 小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 純魔芋豆腐在體外模擬消化時(shí)的還原糖生成量

體外模擬口腔、胃、小腸消化過(guò)程中，純魔芋豆腐組均無(wú)還原糖產(chǎn)生，表明脫乙?；в笃细示厶?D-KGM)不會(huì)在口腔、胃、小腸中被水解生成還原糖，淀粉魔芋豆腐中生成的還原糖均來(lái)自摻入的淀粉。

2.3 體外模擬口腔和胃消化時(shí)的淀粉水解率

碳水化合物消化過(guò)程中，人體口腔主要有兩個(gè)作用：① 通過(guò)咀嚼將食物轉(zhuǎn)化為小顆粒；② 通過(guò)分泌α-淀粉酶將多糖大分子分解成小分子[15]。試驗(yàn)中樣品均通過(guò)粉碎、過(guò)100目篩，分子顆粒大小相同，因此主要模擬唾液α-淀粉酶對(duì)多糖的水解作用。試驗(yàn)測(cè)得收集的唾液中α-淀粉酶活力為(82±5) D/mL，與Ruth等[17]的結(jié)果相吻合。

由表3可知，純芭蕉芋淀粉和純玉米淀粉在口腔中的水解率無(wú)顯著差異，而對(duì)應(yīng)的淀粉魔芋豆腐中淀粉的水解率顯著降低，說(shuō)明D-KGM可以阻礙淀粉在口腔中消化。消化過(guò)程中，胃部不分泌分解糖類相關(guān)的水解酶，但胃中的強(qiáng)酸環(huán)境能使多糖糖苷鍵斷裂、相對(duì)分子質(zhì)量降低[25]。體外模擬胃消化過(guò)程中，各魔芋豆腐組均無(wú)還原糖產(chǎn)生。

表3 體外模擬口腔和胃消化時(shí)的淀粉水解率?Table 3 Hydrolysis rate of starch during simulating oral and gastric digestion in vitro %

? 小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 體外模擬小腸消化時(shí)的淀粉水解率

由圖1可知，淀粉水解率均先快速上升后緩慢上升再趨于穩(wěn)定。大部分水解在0～20 min內(nèi)完成，為快消化淀粉，能使血糖快速升高[26]。純玉米淀粉的水解率高于純芭蕉芋淀粉，是由于淀粉品種差異。與純淀粉相比，對(duì)應(yīng)的淀粉魔芋豆腐的淀粉水解率均降低，但0～20 min的降低效果顯著(圖2)，而最終水解程度差異不顯著，說(shuō)明D-KGM在腸道消化中可以延緩摻入淀粉的消化性能，但不能阻止淀粉消化。研究[27]表明KGM會(huì)使食物黏度增加而降低消化程度，試驗(yàn)中D-KGM黏度遠(yuǎn)低于KGM，淀粉水解程度并未降低，但由于D-KGM與淀粉共混，一定程度地阻礙了淀粉與酶的接觸，延緩了淀粉的水解。經(jīng)120 min消化后，未被水解的淀粉為抗性淀粉，純芭蕉芋淀粉、芭蕉芋魔芋豆腐、純玉米淀粉、玉米魔芋豆腐中抗性淀粉占總淀粉的比例分別為(22.36±1.11)%，(23.57±2.85)%，(17.41±1.78)%，(19.47±1.68)%，與未被水解的D-KGM一起進(jìn)入大腸中被微生物酵解。

圖1 體外模擬小腸消化時(shí)淀粉水解率隨消化時(shí)間的變化Figure 1 The hydrolysis rate of starch changes with digestion time during simulating small intestine digestion in vitro

圖2 體外模擬小腸消化20 min時(shí)的淀粉水解率Figure 2 The hydrolysis rate of starch when simulating small intestine digestion for 20 min in vitro

2.5 酵解過(guò)程中pH的變化

由圖3可知，小鼠盲腸體外發(fā)酵過(guò)程中，空白組pH值無(wú)顯著變化，其他各組pH值呈下降趨勢(shì)，且0～4 h下降最快。純芭蕉芋淀粉和純玉米淀粉組在8 h后pH值不再下降，玉米魔芋豆腐組在12 h后pH值不再下降，純魔芋豆腐、芭蕉芋魔芋豆腐和葡萄糖組在發(fā)酵24 h內(nèi)pH值持續(xù)下降，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值下降速度持續(xù)減緩。整個(gè)過(guò)程中，葡萄糖組pH值下降得最快最多，葡萄糖最易被腸道微生物利用，其次為純芭蕉芋淀粉組和純玉米淀粉組，純魔芋豆腐組下降得最慢最少。綜上可知，發(fā)酵過(guò)程中，玉米和芭蕉芋抗性淀粉組降低發(fā)酵液pH值能力高于D-KGM，前者降低pH值的持續(xù)時(shí)間短，而后者能持續(xù)緩慢降低pH值，摻入淀粉的魔芋豆腐組趨勢(shì)介于二者之間。

圖3 發(fā)酵液中pH值隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 3 The pH of the fermentation broth changes with the fermentation time

2.6 酵解過(guò)程中SCFA含量的變化

在SCFA中，乙酸是人體腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵多糖最主要的產(chǎn)物[28]。由表4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中乙酸產(chǎn)量均顯著增加，且大于空白組和葡萄糖組。發(fā)酵0～4 h，純魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸較少，但隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，純魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸速率不斷增加，發(fā)酵24 h時(shí)，乙酸產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組。發(fā)酵24 h時(shí)，各含淀粉魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸量顯著(P<0.05)高于不含魔芋粉的純淀粉組，說(shuō)明D-KGM被微生物利用，產(chǎn)生乙酸的能力顯著大于抗性淀粉。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，丙酸產(chǎn)量逐漸增加，發(fā)酵0～8 h時(shí)，純魔芋豆腐組和芭蕉芋魔芋豆腐組產(chǎn)丙酸速率極為緩慢，發(fā)酵8 h后產(chǎn)丙酸速率增加。發(fā)酵24 h時(shí)，純魔芋豆腐組丙酸產(chǎn)量顯著高于其他組，芭蕉芋魔芋豆腐組丙酸產(chǎn)量顯著高于純芭蕉芋淀粉組，說(shuō)明D-KGM被微生物利用，產(chǎn)生丙酸的能力顯著大于抗性淀粉。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，樣品組丁酸產(chǎn)量增加且高于葡萄糖組。發(fā)酵24 h時(shí)，純淀粉組產(chǎn)丁酸量顯著高于純魔芋豆腐組，但摻入淀粉的魔芋豆腐組產(chǎn)丁酸量均低于純淀粉組和純魔芋豆腐組，說(shuō)明淀粉和魔芋粉復(fù)配形成的凝膠被微生物利用，生產(chǎn)丁酸的能力低于淀粉和魔芋粉各自產(chǎn)丁酸的能力。各樣品組總短鏈脂肪酸生成量均大于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。發(fā)酵24 h時(shí)，純魔芋豆腐組總短鏈脂肪酸生成量最多，純芭蕉芋淀粉組和純玉米淀粉組生成量最少，且二者無(wú)顯著差異(P>0.05)。玉米魔芋豆腐摻入淀粉量遠(yuǎn)高于芭蕉芋魔芋豆腐，而前者生成總酸量顯著低于后者，說(shuō)明D-KGM發(fā)酵產(chǎn)短鏈脂肪酸的能力顯著大于抗性淀粉，與2.5中pH值的變化曲線不相符，可能是因?yàn)槠咸烟呛涂剐缘矸郯l(fā)酵的主要產(chǎn)物是長(zhǎng)鏈脂肪酸或其他有機(jī)酸[29]。

表4 不同發(fā)酵時(shí)間各種短鏈脂肪酸生成量?Table 4 The yield of various short chain fatty acid at different fermentation times mmol/L

? NP表示未生成；同行小寫字母不同表示有顯著差異(P<0.05)，同列大寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

綜上，純淀粉組短鏈脂肪酸的生成主要在發(fā)酵0～12 h，純魔芋豆腐組主要在12～24 h，純魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸和丙酸能力高于純淀粉組，產(chǎn)丁酸能力反之，與Zhao等[30-31]對(duì)KGM和抗性淀粉的研究結(jié)果一致。摻入淀粉的魔芋豆腐組產(chǎn)乙酸和丙酸能力介于純魔芋粉和純淀粉之間，產(chǎn)丁酸能力低于二者，而芭蕉芋魔芋豆腐產(chǎn)短鏈脂肪酸能力顯著高于玉米魔芋豆腐。

2.7 酵解后乳酸菌含量的變化

由表5可知，各試驗(yàn)組乳酸菌含量顯著增加，其中純魔芋豆腐組的含量最高，純淀粉組的含量最少，淀粉魔芋豆腐組介于二者之間，且均高于葡萄糖組。多數(shù)乳酸菌不能利用淀粉，由于其不能產(chǎn)生水解淀粉的酶，但仍有研究[29,32]發(fā)現(xiàn)抗性淀粉會(huì)促進(jìn)腸道乳酸菌的增長(zhǎng)，可能是因?yàn)槟c道菌群是復(fù)雜的體系，存在許多協(xié)同作用，其他細(xì)菌降解抗性淀粉產(chǎn)生的物質(zhì)足以支持乳酸菌的生長(zhǎng)[33]。試驗(yàn)結(jié)果證明D-KGM、芭蕉芋抗性淀粉、玉米抗性淀粉都能促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)，但抗性淀粉的益生作用低于D-KGM，與2.6中生成短鏈脂肪酸的規(guī)律相同。

表5 發(fā)酵24 h后發(fā)酵液中乳酸菌含量?Table 5 Lactic acid bacteria content in fermentation broth after fermentation for 24 h lg(CFU/mL)

? 小寫字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，純魔芋豆腐在上消化道中不被消化，摻入魔芋豆腐中的淀粉會(huì)被快速消化，但與純淀粉相比，摻入魔芋豆腐中的淀粉在體外模擬口腔和小腸消化的0～20 min內(nèi)水解率顯著降低，但小腸消化結(jié)束后水解率無(wú)顯著變化，說(shuō)明D-KGM在短時(shí)間內(nèi)可以阻礙淀粉消化，但并不能阻止淀粉最終消化；體外模擬小鼠盲腸發(fā)酵結(jié)果顯示魔芋豆腐中摻入淀粉后腸道益生作用會(huì)減弱；為改善魔芋豆腐食用品質(zhì)和商品性而加入淀粉后其健康價(jià)值降低，但在魔芋豆腐達(dá)到相同食用品質(zhì)和持水性時(shí)，芭蕉芋淀粉添加量遠(yuǎn)低于玉米淀粉。因此，向魔芋豆腐中添加芭蕉芋淀粉能在提高魔芋豆腐品質(zhì)的同時(shí)盡可能少地降低其健康價(jià)值。后續(xù)可對(duì)摻入淀粉后魔芋豆腐微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行深入研究，為淀粉在魔芋豆腐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)；研發(fā)一種簡(jiǎn)便地鑒別魔芋豆腐中淀粉摻入量和摻入淀粉種類的方法，為消費(fèi)者自主選擇是否購(gòu)買摻入淀粉的魔芋豆腐提供保障。