神經(jīng)元型一氧化氮合酶在先天性肥厚性幽門狹窄犬幽門的表達(dá)

魏 穎 張又祥

廣州市第一人民醫(yī)院新生兒科(廣州 510180)

先天性肥厚性幽門狹窄(congenital hypertrophic pyloric stenosis,CHPS)又稱嬰兒肥厚性幽門狹窄(infantile hypertrophic pyloric stenosis,IHPS)，是一種以幽門環(huán)肌增生、肥厚為特征的需手術(shù)介入的消化道疾病。其病因及致病機(jī)制目前尚不清楚，建立成功的CHPS動(dòng)物模型是研究CHPS的病因、致病機(jī)制與治療的很重要的方法。目前為止，國(guó)內(nèi)外未見成功的CHPS動(dòng)物模型。

有研究發(fā)現(xiàn)CHPS患兒幽門區(qū)存在nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元減少，推測(cè)幽門區(qū)nNOS表達(dá)減少與CHPS可能相關(guān)[1]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，幽門區(qū)nNOS mRNA表達(dá)下降及其基因多態(tài)性與CHPS密切相關(guān)[2]。既往有研究[3]證明NOS抑制劑L-NAME可引起新生鼠幽門環(huán)肌層肥厚。

本實(shí)驗(yàn)選取Beagle孕犬通過腹腔注射L-NAME制作CHPS犬動(dòng)物模型，觀察其新生犬生后的生長(zhǎng)發(fā)育情況和幽門環(huán)肌層的厚度及幽門組織中nNOS的表達(dá)情況，探討nNOS與CHPS的關(guān)系，為進(jìn)一步的CHPS的致病機(jī)制研究和干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4只成年Beagle孕犬，普通級(jí)，體質(zhì)量在10～12 kg左右，均由廣州醫(yī)藥研究總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究開發(fā)中心提供。本次研究遵循國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器 L-NAME(N-硝基—左旋精氨酸甲酯，N-nitro-L-arginine methylester hydrochloride，Sigma，美國(guó))，小鼠抗nNOS單克隆抗體(BD，美國(guó))，枸櫞酸鈉粉劑、PBS緩沖液粉劑、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自Solarbio公司，免疫組化染色SP試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，冰凍切片機(jī)(FSE型，Thermo，美國(guó))，凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，恒溫烤箱(HH-BH- 420,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，顯微鏡(Leica，德國(guó))，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國(guó))

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 將4只Beagle孕犬按3:1分為模型組和對(duì)照組，自孕期第1天至分娩前1天，模型組孕犬每天腹腔注射一次L-NAME 6 mg/(kg·d)，對(duì)照組給予同樣方式注射等量的生理鹽水。所有孕犬均飼喂用普通的自來水和飼料。

兩組新生犬生后母乳喂養(yǎng)，在生后第31天、38天、45天及52天分別稱重。

1.2.2 標(biāo)本制作 生后52天時(shí)，從模型組選取體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢的新生犬和對(duì)照組新生犬各5只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，外科手術(shù)取幽門組織，行胃空腸吻合術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)。幽門組織經(jīng)中性福爾馬林固定后經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋后制成厚約4 μm的石蠟切片，每個(gè)幽門組織隨機(jī)取4張切片，第1張和第3張切片做常規(guī)HE染色，第2張和第4張切片做免疫組化。采用自身對(duì)照作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗和二抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 免疫組化結(jié)果判定方法nNOS主要表達(dá)于幽門環(huán)肌的腸肌神經(jīng)叢細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為腸肌神經(jīng)叢細(xì)胞胞漿可見黃色或棕黃色顆粒。顯微鏡下隨機(jī)選4個(gè)視野拍片(放大倍數(shù)40×10)，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件定量分析，測(cè)定三項(xiàng)主要指標(biāo)，陽(yáng)性面積(Area)，積分光密度(IOD)，平均光密度(MD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組新生犬生長(zhǎng)發(fā)育情況

對(duì)照組產(chǎn)5只新生犬，模型組產(chǎn)14只新生犬，所有新生犬均發(fā)育正常。模型組新生犬與對(duì)照組新生犬相比，體質(zhì)量增長(zhǎng)慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型組幽門環(huán)肌肥厚度大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(見表1、表2、圖A、圖B)

表1 兩組新生犬生后體質(zhì)量變化情況

表2 正常組和模型組52日齡新生犬幽門環(huán)肌厚度比較

圖A 正常組52日齡新生犬幽門環(huán)肌厚度(6.3×10)

圖B 模型組52日齡新生犬幽門環(huán)肌厚度(6.3×10)

2.2 nNOS在兩組新生犬幽門的分布和定量分析

nNOS主要表達(dá)于幽門環(huán)肌與縱肌間的腸肌神經(jīng)叢細(xì)胞內(nèi)。與對(duì)照組新生犬相比，模型組新生犬幽門組織中nNOS表達(dá)減少(P<0.05)。(見表3,圖C、圖D)

圖C 對(duì)照組新生犬幽門肌間神經(jīng)纖維中nNOS的表達(dá)(40×10)

圖D 模型組新生犬幽門肌間神經(jīng)纖維中nNOS的表達(dá)(40×10)

表3 nNOS在對(duì)照組和模型組新生犬幽門的免疫組化圖像分析三項(xiàng)

3 討 論

CHPS是由于幽門環(huán)肌增生肥厚引起新生兒和嬰兒嘔吐的幽門梗阻性疾病。主要臨床表現(xiàn)為生后2～4周開始出現(xiàn)非膽汁性噴射性嘔吐，多于喂奶后半小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，呈進(jìn)行性加重，常伴隨有消瘦、脫水及電解質(zhì)紊亂等臨床癥狀，體格檢查可見胃蠕動(dòng)波，于右上腹觸及一橄欖狀、質(zhì)較硬的可移動(dòng)包塊，胃腸道B超可見幽門肌層增厚，幽門狹窄，幽門管形成，消化道X線鋇餐檢查可見幽門管狹長(zhǎng)，胃排空延遲，可見典型的“雙肩征”、“線樣征”等本病特有的X線征象[4]。其病理學(xué)特征是幽門肌全層增生肥厚，尤其以幽門環(huán)肌細(xì)胞增生肥厚為主，肌纖維排列紊亂，黏膜充血、水腫。目前主要治療方式為幽門肌切開術(shù)，可直接解除幽門梗阻，且術(shù)后無長(zhǎng)期功能及形態(tài)異常，復(fù)發(fā)率低。也可靜脈或口服阿托品治療，其優(yōu)點(diǎn)是不需要手術(shù)，無創(chuàng)傷，但此方法治療時(shí)間較長(zhǎng)，治療期間控制電解質(zhì)紊亂難度大。其發(fā)病率在歐美國(guó)家為2.5‰～8.8‰,我國(guó)約為3‰，多見于男性[5]。其病因及致病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為,IHPS的發(fā)生可能與遺傳、胃腸激素、胃腸道神經(jīng)發(fā)育異常等因素密切相關(guān)[6]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種內(nèi)皮細(xì)胞來源的舒張因子，在調(diào)節(jié)幽門括約肌舒張中發(fā)揮作用[7]。其由底物左旋精氨酸(L-arginine,L-arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化作用下合成，NOS是其限速酶。目前已知，NOS有三種亞型，其中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和nNOS是其兩種亞型，nNOS位于神經(jīng)元細(xì)胞中，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著舒張血管、舒張平滑肌以及進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)等生理功能[8]。

胃的幽門處分布有密集NOS陽(yáng)性神經(jīng)元纖維[9]。有研究發(fā)現(xiàn)CHPS患兒幽門組織中的nNOS神經(jīng)元數(shù)量減少，推測(cè)CHPS的發(fā)生可能與幽門部nNOS的表達(dá)減少相關(guān)[2]。也有文獻(xiàn)報(bào)道nNOS與CHPS發(fā)病密切相關(guān)[10]。

L-NAME主要抑制eNOS，有研究表明nNOS的活性可被高濃度L-NAME抑制，其可與L-arg競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NOS，抑制NOS的活性，減少NO的合成。

本實(shí)驗(yàn)首先給予Beagle孕犬腹腔注射L-NAME,結(jié)果顯示，兩組新生犬生后均無肢體發(fā)育異常情況。表明腹腔注射L-NAME對(duì)新生犬的胚胎期發(fā)育無影響。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)IHPS動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道極少，且尚無模型建立成功的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要依據(jù)臨床癥狀、體征及病理學(xué)檢查等。本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)兩組新生犬生后30天內(nèi)的體質(zhì)量增長(zhǎng)的比較，無差異，自生后31天始，兩組新生犬的體質(zhì)量增長(zhǎng)出現(xiàn)差異，我們連續(xù)觀察和記錄了3周兩組新生犬的體質(zhì)量增長(zhǎng)情況，并用顯微鏡觀察測(cè)量HE染色后的幽門環(huán)肌層厚度。模型組新生犬與對(duì)照組新生犬相比，幽門環(huán)肌層明顯增厚，且體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01)。推測(cè)其可能原因是孕犬腹腔注射L-NAME，L-NAME經(jīng)胎盤進(jìn)入新生犬體內(nèi)，間接抑制新生犬胃腸道NOS陽(yáng)性神經(jīng)元內(nèi)nNOS的活性，減少NO的合成釋放，繼而導(dǎo)致幽門肌層增生肥厚和幽門括約肌舒張功能障礙，使進(jìn)入小腸的食物量減少，最終引起新生犬體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。本實(shí)驗(yàn)中，模型組新生犬雖無嘔吐、體質(zhì)量不增或下降等CHPS臨床癥狀，但體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯緩慢，病理組織學(xué)顯示幽門肌層明顯增生肥厚，尤其以幽門環(huán)肌為主，肌纖維排列紊亂，支持給予Beagle孕犬腹腔注射L-NAME可誘導(dǎo)建立類似CHPS犬模型。兩組新生犬幽門組織免疫組化結(jié)果顯示，nNOS主要表達(dá)于幽門環(huán)肌與縱肌間的腸肌神經(jīng)叢細(xì)胞內(nèi)。與對(duì)照組新生犬相比，模型組新生犬幽門組織中nNOS的表達(dá)明顯減少,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與趙煜等[1]研究相同，推測(cè)幽門區(qū)nNOS的表達(dá)減少與CHPS相關(guān)。

由于本實(shí)驗(yàn)條件受限，我們僅在蛋白水平研究nNOS與CHPS的關(guān)系，隨著相關(guān)研究的深入，nNOS在CHPS的作用將得以進(jìn)一步闡明。根據(jù)NO在胃腸道的生理作用機(jī)制，我們可研究使用NO的供體來提高CHPS患者幽門中NO的活性，為CHPS的臨床治療提供一種新的治療方法。