脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111對(duì)大鼠急性肝損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制*

胡泉東， 楊玉娟， 余珊珊

((1. 紹興職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 紹興 312000； 2. 南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 南昌 330006； 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 北京 100101)

脂氧素(lipoxin, LXs)是重要的內(nèi)源性脂質(zhì)抗炎遞質(zhì)，被稱(chēng)作炎癥的“剎車(chē)”信號(hào)。它由脂加氧酶(lipoxygenase)催化花生四烯酸而成，能發(fā)揮廣泛的抗炎促炎癥消退作用[1]。但由于其半衰期短，易降解等特點(diǎn)，使得其很難應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。而其受體激動(dòng)劑BML-111(5(S),6(R),-trihydroxyheptanoic acid methylester)具有與甲酰肽受體2(formyl peptidereceptor 2, FPR2，為主要的脂氧素作用受體)一致的特點(diǎn)，且性質(zhì)穩(wěn)定，商業(yè)化易獲得，故廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中[2]。已有研究證實(shí)，BML-111在多種疾病中都發(fā)揮保護(hù)作用[2-6]。課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)了BML-111對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用[6]。RAAS相關(guān)成分的含量在肝臟發(fā)生損傷時(shí)，會(huì)發(fā)生明顯變化[7]，而且ACE、Ang II濃度的增高與肝損傷程度呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)[8]。研究表明Ang II促進(jìn)肝纖維化與脂肪肝的進(jìn)展[9-10]，而Ang- (1-7)抑制肝臟炎癥反應(yīng)[11]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem, RAAS)在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。研究表明脂氧素對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚待闡明。因此為了進(jìn)一步明確脂氧素在大鼠急性肝損傷的保護(hù)機(jī)制，本研究利用CCL4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型為研究對(duì)象[12]，首先觀察脂氧素對(duì)急性肝損傷是否對(duì)急性肝損傷具有保護(hù)，然后通過(guò)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組相關(guān)RAAS含量的變化，觀察脂氧素在發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)時(shí)是否通過(guò)調(diào)節(jié)RAAS而發(fā)揮對(duì)急性肝損傷的保護(hù)，期望為臨床治療急性肝損傷提供更多的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，購(gòu)自南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，體重(200 ±20) g。大鼠在適應(yīng)條件下(溫度(23±2)℃，濕度55%±10%)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)飲。

1.2 主要試劑

BML-111購(gòu)自美國(guó)Enzo Life Sciences公司，BOC-2購(gòu)自GenScript公司，CCL4購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，MPO、ALT、AST試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Ang-(1-7)、ACE2 ELISA試劑盒購(gòu)自上海西塘生物科技有限公司；ACE、Ang II ELISA試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Ang II抗體，Ang-(1-7)抗體購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone Corp。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制

BML-111儲(chǔ)存液：2.5 mg BML-111加入DMSO 0.25 ml混勻，超凈臺(tái)中操作，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BML-111工作液：0.5 ml儲(chǔ)存液加入4.5 ml PBS，現(xiàn)配現(xiàn)用。

BOC-2儲(chǔ)存液：0.5 mg BOC-2加入0.25 ml DMSO和0.25 ml PBS混勻，超凈臺(tái)中操作，保存于 -20℃。(注：因DMSO對(duì)細(xì)胞有毒，所以在可以充分溶解的情況下盡量減少DMSO用量。)

BOC-2工作液：0.5 ml儲(chǔ)存液加入9.5 ml PBS，現(xiàn)配現(xiàn)用。

40%CCL4橄欖油溶液：40 ml CCL4加入80 ml橄欖油， 超凈臺(tái)中操作，攪拌過(guò)夜。

1.4 大鼠分組及肝損傷模型的建立

將大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，即正常對(duì)照組(CON)、肝損傷模型組(CCL4)、治療組(BML-111)和阻斷劑組(BOC-2)。正常對(duì)照組：皮下注射橄欖油，劑量1.8 ml/kg模型組：皮下注射40% CCL4油劑(橄欖油為溶劑)，劑量3 ml/kg。BML-111治療組組：皮下注射Lipoxin受體激動(dòng)劑BML-111，劑量1 mg/kg，30 min后處理同模型組。BOC-2阻斷劑組組：皮下注射Lipoxin受體阻斷劑BOC-2，劑量50 μg/kg，30 min后處理同BML-111組。

1.5 標(biāo)本收集

血 清：各組大鼠造模24 h后用戊巴比妥鈉麻醉，腹主靜脈取血并收集血液約5 ml于離心管中，靜置30 min，4 000 r/min離心20 min，小心吸取上層上清，放入-80℃冰箱備用。

肝組織：取出肝臟，冰PBS洗滌4次，于冰上切取大小約1.0×1.0×2.0 cm左右的組織塊，迅速浸泡于10%甲醛中，分裝約200 mg組織塊若干于1.5 ml EP管中，連同剩余肝組織一起放入-80℃冰箱備用。

1.6 肝臟大體形態(tài)觀察及HE染色

切取1.0×1.0×2.0 cm左右的組織塊，浸泡于10%甲醛中。常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

1.7 血清AST和ALT活性檢測(cè)

收集以后的血清4℃、4 000 r/min離心20 min，留取上清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(南京建成生物工程研究所)步驟測(cè)定血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)的含量。

1.8 檢測(cè)血清Ang II、ACE、Ang-(1-7)、ACE2含量

制備血清后，按說(shuō)明書(shū)(武漢云克隆科技股份有限公司)要求進(jìn)行ELISA檢測(cè)血清Ang II、ACE、Ang-(1-7)、ACE2含量。

1.9 肝組織勻漿液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg肝組織，用冰PBS清洗三次。加入1 ml冰PBS，在勻漿器中研磨充分。-80℃速凍，42℃解凍，反復(fù)凍融兩次。10 000 r/min，4℃離心15 min。取上清，-80℃保存或置于冰上繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè)

取離心上清液100 μl，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(南京建成生物工程研究所)步驟測(cè)定血清中髓過(guò)氧化物酶(MPO)。

1.11 免疫蛋白印跡法檢測(cè)組織Ang II、Ang-(1-7)蛋白表達(dá)

取肝組織勻漿液，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定(BCA法)，定量。配制10%分離膠(10 ml)和5%濃縮膠(3 ml)。100℃煮待檢測(cè)蛋白樣品5 min，于冰上冷卻10 min。先加入預(yù)染蛋白Marker 4 μl，然后按事先設(shè)定順序加入蛋白樣品各40 μg，以恒壓60 V電泳30 min，然后恒壓100 V電泳直至所需蛋白分離。然后蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)、封閉和孵育第一抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液室溫孵育1 h ；TBST清洗后用辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光液，于Image Lab凝膠成像系統(tǒng)曝光，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BML-111對(duì)CCL4誘導(dǎo)的大鼠急性肝臟損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

肝臟大體外觀顯示，CCL4組大鼠肝臟色澤變黃，肝組織呈顆粒狀，表面可見(jiàn)片狀瘀斑和多處出血點(diǎn)，質(zhì)地稍硬； BML-111治療的大鼠肝臟較CCL4組有明顯的改善，質(zhì)地顏色與CON組較接近；而B(niǎo)OC-2組肝臟可見(jiàn)散在瘀斑和出血點(diǎn)(圖1A)。

光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)CCL4組大鼠肝臟小葉中心部明顯壞死，壞死區(qū)域周?chē)梢?jiàn)肝細(xì)胞水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪變性。BML-111組肝細(xì)胞病變癥狀明顯減輕，BOC-2組肝細(xì)胞水腫、變性及空泡樣變，上述提示, BML-111抑制CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B，圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅳ)。

2.2 BML-111對(duì)血清MPO及ALT/AST活性的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟MPO及ALT/AST活性明顯升高(P<0.01)；與模型組對(duì)比，BML-111治療組MPO及ALT/AST活性明顯下降(P<0.01)。與BOC-2阻斷劑組相比，BML-111治療組MPO及ALT/AST活性明顯下降(P< 0.01，表1)。

Tab. 1 Changes of MPO activity and serum ALT/AST in each n=6)

2.3 BML-111對(duì)血清ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量的影響

實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組血清中ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)的含量。與對(duì)照組相比，模型組ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量明顯升高(P<0.01)；與模型組對(duì)比，BML-111治療組ACE、Ang II含量明顯下降(P<0.01,P<0.05)，ACE2、Ang-(1-7)含量明顯升高(P<0.01)；與BOC-2阻斷劑組相比，BML-111治療組ACE、Ang II含量下降(P<0.05)，ACE2、Ang-(1-7)明顯升高(P< 0.01，P<0.05，表2)。

Tab. 2 Changes of ACE, Ang II, ACE2 and Ang-(1-7) in each group(ng/ml, n=6)

2.4 BML-111對(duì)肝組織中Ang-(1-7)、AngII含量的影響

肝組織中Ang-(1-7)、Ang II的蛋白表達(dá)水平通過(guò)Western-blot進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示： 與正常組對(duì)比，模型組Ang-(1-7) 、Ang II 含量明顯升高；與模型組相比，BML-111治療組Ang-(1-7) 含量明顯升高，Ang II含量明顯降低；與BOC-2阻斷劑組對(duì)比，BML-111治療組Ang-(1-7) 含量明顯升高，Ang II含量明顯下降(圖2，表3)。

Fig. 2 The contents of Ang II and Ang(1-7) in liver tissue were assessed by Western blot

Tab. 3 Analysis of Ang II and Ang(1-7) in liver tissue in each n=5)

3 討論

脂氧素是一種重要的脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)特殊G-蛋白偶聯(lián)受體(ALX)，發(fā)揮抗炎以及促炎癥消散作用[13]。而課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111抑制LPS/D-GalN誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而且應(yīng)用脂氧素受體阻斷劑BOC-2對(duì)肝臟無(wú)直接損傷[6]。本實(shí)驗(yàn)在用CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清中ALT,AST活性明顯升高，而B(niǎo)ML-111降低這些反應(yīng)肝功能指標(biāo)的酶活性。有實(shí)驗(yàn)研究表明非酒精性脂肪肝損傷中ALT、AST、IL-6、IL-17 水平明顯升高[14]。在大鼠糖尿病性肝硬化損傷和纖維化發(fā)生中，AST和ALT顯著升高，鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)和膠原Ⅰ(COⅠ)、膠原Ⅲ(COⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)蛋白表達(dá)上調(diào)[15]。髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一種血紅素蛋白，富含于中性粒細(xì)胞中，由粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并存儲(chǔ)于噬天青顆粒內(nèi)。外界刺激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，從而釋放髓過(guò)氧化物酶。有研究表明急性肺損傷時(shí)MPO活性增高，而B(niǎo)ML-111在發(fā)揮急性肺損傷的保護(hù)作用時(shí)與降低MPO活性有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M中MPO活性明顯升高，而B(niǎo)ML-111能夠降低MPO活性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看BML-111能夠抑制CCL4誘導(dǎo)急性肝損傷時(shí)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而且此結(jié)果與(圖1B)HE染色結(jié)果一致。BML-111的抗急性損傷作用的確與降低MPO活性有關(guān)[6-7]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem, RAAS)的主要成分包括ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)；這些成分在體內(nèi)廣泛分部，主要存在于肝、肺等器官；當(dāng)肝、肺受到損傷時(shí)，體內(nèi)ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量發(fā)生變化[17-18]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量。結(jié)果顯示ACE、Ang II在模型組中含量明顯升高，而ACE2、Ang-(1-7)同樣會(huì)升高。而B(niǎo)ML-111治療組在降低ACE、Ang II含量的同時(shí)還能夠進(jìn)一步升高ACE2、Ang-(1-7)含量。表明急性肝損傷時(shí)BML-111對(duì)ACE、 Ang II、ACE2、Ang-(1-7)進(jìn)行了重新調(diào)整。有研究報(bào)道肝損傷程度與Ang II、ACE濃度正相關(guān)，應(yīng)用ACE抑制劑明顯減輕了CCL4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激壓力和炎癥反應(yīng)[19]。有研究表明敲除ACE2基因會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力和炎癥損傷程度加重，造成肝損傷[20]。由此推測(cè)，模型組ACE2、Ang-(1-7)含量的升高可能是一種應(yīng)激性的保護(hù)反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組中ACE、Ang II含量高于正常組，而B(niǎo)ML-111能降低ACE、Ang II的表達(dá)，在一定程度上減輕炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)Ang II對(duì)肝損傷的機(jī)制可能與下調(diào)miR-590-5p表達(dá)，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激壓力有關(guān)，炎癥細(xì)胞在Ang II誘導(dǎo)下，加速在肝損傷部位的浸潤(rùn)[21]，亦有研究表明抑制ACE合成，能夠減輕炎癥反應(yīng)[22]。已有研究表明Ang-(1-7)在急性肺損傷時(shí)，含量升高，而且在加用Ang-(1-7)后有較好的抗急性肺損傷作用[23]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111具有一定的抗急性肝損傷作用，而且ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量在肝損傷時(shí)發(fā)生了變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示脂氧素受體激動(dòng)劑BML-111可能通過(guò)調(diào)節(jié)ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)的含量發(fā)揮一定的抗急性肝損傷作用。