亞硝酸鈉誘導(dǎo)的草魚肝細(xì)胞凋亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路的作用研究

陳思琪 謝麗霞 姚朝瑞 李大鵬 湯 蓉

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

在生態(tài)系統(tǒng)中, 亞硝酸鹽是氮循環(huán)的一個天然組成部分, 現(xiàn)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中一個潛在性問題[1]。在高密度集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 由于放養(yǎng)密度增大以及過度投餌造成的高蛋白殘餌和高含氮排泄物不斷沉積于池底, 超過養(yǎng)殖水體代謝能力, 硝化細(xì)菌的消化平衡遭到破壞, 進(jìn)而導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累,成為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中面臨的重要脅迫因子[2]。水體中亞硝酸鹽是由氨通過硝化細(xì)菌硝化作用形成的,其可以在水生系統(tǒng)中積累到很高的濃度[1]。已有研究表明, 養(yǎng)殖水體中高濃度亞硝酸鹽和氨氮是誘發(fā)魚病主要的環(huán)境因子[3], 亞硝態(tài)氮和氨氮引起的水質(zhì)惡化受到了養(yǎng)殖界和相關(guān)學(xué)者的高度重視。

水體中亞硝酸鹽濃度升高會對水生動物產(chǎn)生多種生理干擾, 如生長抑制、組織損傷、內(nèi)臟功能紊亂和內(nèi)分泌紊亂等[4]。亞硝酸鹽暴露對魚、蝦和蟹等養(yǎng)殖對象均具有一定的毒性作用, 影響生長發(fā)育, 誘發(fā)組織病理變化, 降低抵抗力, 甚至導(dǎo)致死亡[5]。水體中的亞硝酸鹽通過鰓上皮細(xì)胞進(jìn)入魚體, 主要將血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白, 從而導(dǎo)致血液載氧能力逐漸降低, 造成組織缺氧、神經(jīng)麻痹、攝食量降低、鰓組織出現(xiàn)病變、呼吸困難、騷動不安或反應(yīng)遲鈍, 嚴(yán)重時則使生物發(fā)生暴發(fā)性死亡[6,7]。此外, 水體中亞硝酸鹽濃度超過一定濃度會引起應(yīng)激, 從而誘導(dǎo)動物細(xì)胞凋亡[8]。目前關(guān)于亞硝酸鹽對細(xì)胞凋亡的研究報道主要集中在個體水平研究,通過細(xì)胞水平揭示亞硝酸鹽引起細(xì)胞凋亡的研究相對較少, 其潛在的作用機(jī)制還有待闡明。細(xì)胞凋亡存在于機(jī)體的整個生命過程, 參與了各種生理及病理過程?，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也參與細(xì)胞凋亡的途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)的專用細(xì)胞器, 對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外刺激的變化高度敏感[9]。環(huán)境應(yīng)激引起的未折疊、錯折疊、突變蛋白積累均可作為應(yīng)激信號干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress, ER Stress)。為了應(yīng)對這種環(huán)境應(yīng)激, 機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會作出未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)的保護(hù)性或適應(yīng)性策略, 以此恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)[10], 如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的不良作用過大, 細(xì)胞開始凋亡。UPR有三個通路： IRE1、PERK和ATF6。IRE1是一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜糖蛋白, 在胞內(nèi)段具有激酶活性和RNA酶活性。在哺乳動物細(xì)胞中有 IRE1α和IRE1β 兩種亞型, IRE1α普遍存在于所有的組織細(xì)胞中, 而 IRE1β 主要存在于腸上皮細(xì)胞中[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能導(dǎo)致IRE1腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域與BiP解離, IRE1寡聚化, 自身磷酸化激活其RNA酶活性[12]。兩者的底物都是X-box 結(jié)合蛋白 1(XBP1) mRNA, 其編碼堿性含有亮氨酸鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。IRE1的RNA酶活性切割 XBP1 mRNA, 使其成為成熟的 mRNA,其編碼的 XBP1 蛋白能增強(qiáng)分子伴侶蛋白 BiP 等的轉(zhuǎn)錄活性[13]。在持續(xù)性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下曾觀察到IRE1信號通路關(guān)閉, 而PERK信號通路仍然發(fā)揮作用直至細(xì)胞死亡。因此有研究認(rèn)為UPR的IRE1通路分支主要參與存活反應(yīng)[14], 而近來研究更是表明IRE1通路是決定細(xì)胞生存或者凋亡的關(guān)鍵途徑[15]。

草魚(Ctenopharyngodon idella)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬。因其生長迅速, 飼料來源廣,是我國淡水集約化系統(tǒng)的主要物種之一, 目前正遭受著由氨氮和亞硝酸鹽等水污染引起的環(huán)境壓力。水產(chǎn)養(yǎng)殖中亞硝酸鹽含量的高低決定著養(yǎng)殖水質(zhì)的好壞, 亞硝酸鹽含量高對養(yǎng)殖動物帶來很大的危害, 當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致很多池塘亞硝酸鹽含量超標(biāo)。肝臟作為魚類體內(nèi)主要的解毒器官, 其在應(yīng)對外界污染物脅迫中起到關(guān)鍵性作用, 同時也是亞硝酸鹽主要靶器官之一[16—18]。本實(shí)驗(yàn)以草魚肝細(xì)胞系L8824為實(shí)驗(yàn)對象, 進(jìn)行亞硝酸鈉的急性暴露, 通過檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中內(nèi)鈣離子濃度變化, 探討亞硝酸鈉暴露對草魚肝細(xì)胞的凋亡影響以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中IRE1通路在其中發(fā)揮的作用, 以闡明亞硝酸鈉導(dǎo)致草魚肝細(xì)胞凋亡中可能的致毒機(jī)制, 以期為草魚的科學(xué)化養(yǎng)殖提供可靠的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚肝細(xì)胞系(L8824)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心; M199培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Trypsin-Ethylene diamine tetraacetic acid, Trypsin-EDTA)購自Gibco公司; CCK8試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所;STF-083010和2-APB購自美國APExBIO公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

L8824培養(yǎng)于含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液中, 置于28℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合達(dá)80%—90%時, 用0.25%胰蛋白酶消化,離心, 常規(guī)傳代。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×105/mL密度接種于96孔板, 每孔100 μL, 培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后分別換為不同濃度的亞硝酸鈉(0、5、20和50 mg/L) M199培養(yǎng)基分別孵育12h和24h, 每組4個平行, 在培養(yǎng)結(jié)束后, 每孔加入10 μL CCK8試劑, 孵育2.5h后用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度(A值); 用IRE1α抑制劑STF-083010 (50 μmol/L)[19]與20 mg/L NaNO2共同處理草魚肝細(xì)胞24h, 每組4個平行。在培養(yǎng)結(jié)束后, 每孔加入10 μL CCK8試劑, 孵育2.5h后用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度(A值)。

1.4 Annexin-FITC /PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種于六孔板中, 待細(xì)胞匯合達(dá)80%—90%時, 將培養(yǎng)基分別換為不同濃度的亞硝酸鈉(0、5、20 和50 mg/L) M199培養(yǎng)基分別孵育12h和24h, 用胰蛋白酶消化, 制成細(xì)胞懸液, 離心取細(xì)胞沉淀, 用PBS洗滌, 4℃ 300×g離心5min, 2次, 棄上清液, 將細(xì)胞重懸浮于100 μL Binding Buffer。加入5 μL Annexin-FITC和10 μL PI, 輕輕混勻, 避光室溫反應(yīng)10min, 加入400 μL Binding Buffer, 1h內(nèi)進(jìn)行檢測; 將細(xì)胞接種于六孔板中, 待細(xì)胞匯合達(dá)80%—90%時, 用IRE1α抑制劑STF-083010(50 μmol/L)與20 mg/L亞硝酸鈉共同處理草魚肝細(xì)胞24h, 用胰蛋白酶消化, 制成細(xì)胞懸液, 離心取細(xì)胞沉淀, 用PBS洗滌, 4℃ 300×g離心5min, 2次, 棄上清液, 將細(xì)胞重懸浮于100 μL Binding Buffer。加入5 μL Annexin-FITC和10 μL PI, 輕輕混勻, 避光室溫反應(yīng)10min, 加入400 μL Binding Buffer, 1h內(nèi)進(jìn)行檢測。每個處理組取200 μL加入培養(yǎng)皿中, 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡。

1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RT-RCR) 檢測mRNA表達(dá)量變化

取對數(shù)生長期L8824, 接種于6孔板。每孔2 mL培養(yǎng)液, 每組3個平行。按照上述處理方法, 對細(xì)胞進(jìn)行處理, 培養(yǎng)完成后收集各組細(xì)胞。Trizol法提取細(xì)胞總RNA, 測定其濃度、純度并按試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄cDNA。引物為擎科生物公司設(shè)計合成, 引物名稱序列擴(kuò)增片段長度見表1。qPCR反應(yīng)配置為蒸餾水7.2 μL, SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL, 上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL, 下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL, 樣品cDNA溶液2 μL, 總體積20 μL。

表1 引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.6 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的L8824細(xì)胞接種于六孔板中, 接種濃度約為1×106個細(xì)胞/孔, 依照上述處理方法, 對細(xì)胞進(jìn)行處理。在培養(yǎng)結(jié)束后,除去培養(yǎng)基。用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)溶液洗滌3次, 加入FLuo-4 AM工作液(5 μmol/L), 37℃培養(yǎng)箱孵育30min, 除去FLuo-4 AM工作液, 用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次, 加入HBSS溶液覆蓋細(xì)胞, 37℃培養(yǎng)箱孵育30min, 用熒光顯微鏡檢測。

1.7 數(shù)據(jù)分析

各處理組設(shè)置3個重復(fù), 數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”, 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析, 差異顯著表示為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 亞硝酸鈉對L8824細(xì)胞活力的影響

在亞硝酸鈉暴露12h后, 在暴露濃度為5 mg/L時, 細(xì)胞活力下降并不顯著, 此后隨著暴露濃度的增加, 與對照相比, 細(xì)胞活力均顯著性下降, 亞硝酸鈉暴露24h后, 隨著暴露濃度的增加, 與對照相比,細(xì)胞活力均顯著性下降, 暴露濃度為50 mg/L時細(xì)胞活力下降最為顯著(表2)。

2.2 亞硝酸鈉誘導(dǎo)L8824細(xì)胞凋亡

在亞硝酸鈉暴露12h后,jnk、bax、caspase9、caspase3表達(dá)量在最高濃度50 mg/L時均顯著上升,bcl-2表達(dá)量顯著下降。亞硝酸鈉暴露24h后,jnk表達(dá)量在20 mg/L時顯著性升高,bax、caspase9、caspase3表達(dá)量在20和50 mg/L時均顯著性上升, 而bcl-2表達(dá)量在20 mg/L時顯著下降, 其中,bax表達(dá)量在20 mg/L時達(dá)到最大值, 而caspase9、caspase3表達(dá)量在50 mg/L時達(dá)到最大值。

由圖1可見, 亞硝酸鈉暴露濃度為20 mg/L時,隨著暴露時間的增加,jnk、caspase9、caspase3表達(dá)量均顯著上升, 而bcl-2表達(dá)量顯著下降。亞硝酸鈉暴露濃度為50 mg/L時, 隨著暴露時間的增加,bax、caspase9 和caspase3表達(dá)量均顯著性上升。

在亞硝酸鈉暴露12h和24h后, 與對照相比, 暴露濃度在5 mg/L時L8824 細(xì)胞凋亡率沒有顯著性變化, 在高濃度20和50 mg/L暴露時, L8824 細(xì)胞凋亡率均顯著性上升。在亞硝酸鈉暴露濃度為20和50 mg/L時, 隨著時間的增加, L8824細(xì)胞凋亡率均顯著性上升(圖2)。

2.3 亞硝酸鈉誘導(dǎo)草魚肝細(xì)胞L8824內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

亞硝酸鈉暴露12h后,ire1α、xbp1s、grp78表達(dá)量在20和50 mg/L時均顯著性上升, 其中,ire1α表達(dá)量在50 mg/L時達(dá)到最大值, 而xbp1s、grp78表達(dá)量在20 mg/L時達(dá)到最大值。在亞硝酸鈉暴露24h后,ire1α、xbp1s和grp78表達(dá)量在5、20和50 mg/L時均顯著性上升, 其中ire1α和grp78表達(dá)量在50 mg/L時達(dá)到最大值, 而xbp1s表達(dá)量在20 mg/L時達(dá)到最大值(圖3)。

2.4 亞硝酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂

由圖4可見, 亞硝酸鈉暴露12h和24h后, 對照組無明顯綠色熒光, 亞硝酸鈉濃度從5到50 mg/L, 細(xì)胞內(nèi)綠色熒光開始變多且趨于明亮, 鈣離子熒光強(qiáng)度相對于對照均顯著性上升。亞硝酸鈉暴露相同濃度時, 隨著時間的增加, 細(xì)胞內(nèi)綠色熒光開始變多且趨于明亮, 鈣離子熒光強(qiáng)度相對于對照均顯著性上升, 呈現(xiàn)濃度與時間依賴性。

表2 不同濃度亞硝酸鈉對L8824 細(xì)胞活力的影響Tab. 2 The effect of sodium nitrite on the viability of L8824 cells

2.5 IRE1α抑制劑STF-083010通過抑制IRE1通路減少亞硝酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

在20 mg/L亞硝酸鈉暴露組中加入IRE1α抑制劑STF-083010 (50 μmol/L)作用24h, 與對照相比, STF-083010對L8824細(xì)胞活力沒有顯著性影響, 亞硝酸鈉單處理組細(xì)胞活力顯著下降。與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組細(xì)胞活力顯著上升(表3)。

圖1 亞硝酸鈉對L8824細(xì)胞jnk、bcl-2、bax、caspase9和caspase3表達(dá)量的影響Fig. 1 Effects of sodium nitrite on the expression of jnk, bcl-2,bax, caspase9 and caspase3 in L8824 cells

圖2 亞硝酸鈉對L8824細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 The effect of sodium nitrite on apoptosis of L8824 cells

由圖5可見, 與對照相比, 20 mg/L亞硝酸鈉單處理組中ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bax、caspase9和caspase3的表達(dá)顯著上升,bcl-2表達(dá)量顯著下降。與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組ire1α、jnk、bax和caspase3的表達(dá)顯著下降,bcl-2表達(dá)量顯著上升,caspase9表達(dá)量無顯著性變化。與對照相比, 20 mg/L亞硝酸鈉處理組凋亡率顯著上升; 與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組細(xì)胞凋亡率顯著下降(圖6A)。在熒光顯微鏡下觀察, 與對照相比, 亞硝酸鈉處理組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng); 與亞硝酸鈉單處理組相比, STF-083010處理組熒光強(qiáng)度顯著降低(圖6B)。

2.6 2-APB和STF-083010減弱亞硝酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂

與對照相比, 20 mg/L亞硝酸鈉處理組綠色熒光變多且強(qiáng)度顯著增強(qiáng), 與亞硝酸鈉單處理組相比,2-APB組和STF-083010組綠色熒光變少且強(qiáng)度顯著減弱(圖7)。

3 討論

3.1 亞硝酸鹽誘導(dǎo)L8824細(xì)胞發(fā)生凋亡

圖3 亞硝酸鈉對L8824細(xì)胞ire1α, xbp1s和grp78表達(dá)量的影響Fig. 3 Effects of sodium nitrite on the expression of ire1α, xbp1s and grp78 in L8824 cells

圖4 亞硝酸鈉對L8824細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響Fig. 4 The effect of sodium nitrite on the intracellular calcium content in L8824 cells

亞硝酸鹽作為氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物, 其對魚、蝦和蟹等水生生物均具有較強(qiáng)的毒性作用, 是養(yǎng)殖水域中誘發(fā)暴發(fā)性疾病的重要因素。關(guān)于亞硝酸鹽對魚類的致毒機(jī)理, 國內(nèi)外已在多種魚類中開展了相關(guān)研究[20,21]。亞硝酸鹽進(jìn)入水生動物的體內(nèi)主要通過鰓的吸收作用, 在淡水魚和甲殼動物中, 其體液離子濃度相對于外界水環(huán)境處于高滲狀態(tài), 因此必須通過鰓的主動吸收以彌補(bǔ)機(jī)體離子的流失[22]。亞硝酸鹽進(jìn)入水生生物體內(nèi)主要通過離子交換機(jī)制。在淡水魚類的鰓上皮上面存在一種Cl-/離子交換機(jī)制, 一般在碳酸酶(CA)作用下。H2CO3被水解為H+和, 而H+-ATPase主動運(yùn)輸為排出胞外的濃度梯度。在Cl-/離子交換機(jī)制作用下,得以排出細(xì)胞膜外而環(huán)境中存在的Cl-被主動吸收進(jìn)入鰓上皮細(xì)胞[23]。而當(dāng)水生生物處于較高濃度的亞硝酸鹽暴露下, Cl-/離子交換機(jī)制受到影響, 一部分Cl-吸收能力被的吸收代替, 從而造成了水生生物體內(nèi)亞硝酸鹽的堆積。亞硝酸鹽通過陰離子交換機(jī)制進(jìn)入鰓上皮以后, 在細(xì)胞外液中往往能夠積累到很高的濃度[24]。而隨著亞硝酸鈉不斷進(jìn)行積累, 其導(dǎo)致血液中高鐵血紅蛋白的毒性越發(fā)的明顯, 失去部分氧氣運(yùn)輸?shù)哪芰υ斐婶~體最終窒息死亡[25]。此外, 亞硝酸鹽暴露往往能夠引起魚體的氧化應(yīng)激, 因此魚類中抗氧化酶活性水平的變化往往作為不同水生生物應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物[26]。在對羅非魚(Tilapia nilotica)的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)水環(huán)境中的亞硝酸鹽濃度高于羅非魚自身的耐受范圍時, 其丙二醛的含量隨著氧自由基積累而增加[27]。而魚體內(nèi)為了防止氧自由基的積累, 常常依賴于由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶類組成的抗氧化系統(tǒng)的作用, 而長期暴露可能會對抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生一定的抑制作用。魚類肝臟在調(diào)控基礎(chǔ)代謝、降解與排泄外源有毒物質(zhì)中發(fā)揮重要作用, 并且可以作為魚體健康狀況的指示性參數(shù), 肝臟作為亞硝酸鈉的主要解毒器官之一, 肝細(xì)胞可以將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽以達(dá)到解毒目的[28]。簡而言之, 亞硝酸鹽作為強(qiáng)氧化劑, 進(jìn)入機(jī)體后會削弱其血紅細(xì)胞運(yùn)氧能力,并引起自由基增多、生理紊亂、組織缺氧, 體內(nèi)多種生理機(jī)能的障礙和下降, 產(chǎn)生氧化應(yīng)激、擾亂內(nèi)分泌、造成組織損傷、引起細(xì)胞凋亡, 從而影響正常的生理機(jī)能[29,30]。目前有關(guān)于亞硝酸鈉對肝臟細(xì)胞凋亡的研究還比較局限, 亞硝酸鈉誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡可能存在的分子機(jī)制還有待闡明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞硝酸鈉暴露下凋亡相關(guān)基因,jnk、bax、caspase9、caspase3表達(dá)量顯著性上升, 亞硝酸鈉暴露12h和24h后L8824細(xì)胞凋亡率顯著上升。以上結(jié)果表明, 急性亞硝酸鈉暴露能導(dǎo)致草魚肝細(xì)胞凋亡。Al-Gayyar 等[31]在研究黑藻油對亞硝酸鈉引起的大鼠細(xì)胞凋亡的影響中發(fā)現(xiàn)亞硝酸鈉引起大鼠腎組織損傷, 并引起了大鼠腎組織發(fā)生細(xì)胞凋亡;Al-Rasheed 等[32]研究槲皮素對亞硝酸鈉所致缺氧大鼠肝、肺、腎、心肌組織的保護(hù)作用中, 發(fā)現(xiàn)亞硝酸鈉會下調(diào)大鼠組織中bcl-2表達(dá)量, 誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡, 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

表3 亞硝酸鈉和STF-083010共同作用對L8824細(xì)胞活力的影響Tab. 3 Effects of sodium nitrite and STF-083010 on the viability of L8824 cells

圖5 亞硝酸鈉和STF-083010及其配伍對L8824細(xì)胞ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bcl-2、bax、caspase9和caspase3表達(dá)量的影響Fig. 5 Effects of sodium nitrite, STF-083010 and their combination on the expression of ire1α, xbp1s, grp78, jnk, bcl-2, bax, caspase9 and caspase3 in L8824 cells

3.2 亞硝酸鹽誘導(dǎo)L8824細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

圖6 亞硝酸鈉和STF-083010及其配伍對L8824細(xì)胞凋亡的影響Fig. 6 Effects of sodium nitrite, STF-083010 and their combination on the cell apoptosis of L8824 cells

UPR是由一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78和3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白所介導(dǎo)的, 分別是PERK (PKR-like ER kinase)、ATF6 (Activating transcription factor 6)和IRE1。IRE1被認(rèn)為是UPR信號中最后一個被激活的分子, IRE1一旦被激活, 首先通過剪接XBP1誘導(dǎo)UPR, 隨后誘導(dǎo)P58IPK的表達(dá)恢復(fù)蛋白質(zhì)合成, 使細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)。但如果應(yīng)激繼續(xù)加重, IRE1 就會通過激活JNK激酶, 削弱Bcl-2的抗凋亡功能, 從而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Bax和Bak構(gòu)象變化并寡聚化最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜完整性的破壞和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加, 激活Caspase9 最終激活Caspase3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]。在本實(shí)驗(yàn)中ire1α和grp78表達(dá)量在高濃度亞硝酸鈉暴露12h和24h后顯著性上升, 但xbp1s在亞硝酸鈉暴露24h后表達(dá)量顯著下降, 這表明隨著暴露時間的增加, UPR中IRE1-XBP1通路被抑制, 原因可能是因?yàn)殡S著暴露時間的增加,IRE1減少對XBP1的剪接作用, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減弱,IRE1激活JNK, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Dickhout 等[34]通過檢測到GRP78和GPR94的蛋白表達(dá)量上調(diào)發(fā)現(xiàn)過氧化亞硝酸鹽在人血管內(nèi)皮引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。同時, 熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)現(xiàn), 不同濃度和不同時間的亞硝酸鈉暴露都引起了不同程度的鈣離子紊亂, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮作用需要鈣離子的參與, 因此鈣離子紊亂會誘導(dǎo)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[35]。而在本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶grp78 mRNA 表達(dá)量在亞硝酸鈉暴露后顯著上升支持了這個結(jié)論, GRP78是鈣離子的緩沖伴侶, 能夠影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴的鈣離子穩(wěn)態(tài)[36,37], 亞硝酸鈉通過引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高, 阻礙了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的功能, 從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[38]。以上結(jié)果表明, 亞硝酸鈉能夠通過激活I(lǐng)RE1通路引起草魚L8824細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖7 2-APB和STF-083010 對亞硝酸鈉暴露L8824細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響Fig. 7 Effects of 2-APB and STF-083010 on the intracellular calcium content under sodium nitrite exposure in L8824 cells

3.3 IREI通路在亞硝酸鹽誘導(dǎo)L8824細(xì)胞發(fā)生凋亡中發(fā)揮重要作用

近年來大量研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑[39], 為研究IRE1 通路在亞硝酸鈉誘導(dǎo)L8824細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用, 本實(shí)驗(yàn)用IRE1α抑制劑STF-083010與20 mg/L亞硝酸鈉共同作用于L8824細(xì)胞24h, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在IRE1被抑制后, 細(xì)胞凋亡率顯著下降,jnk、bax、caspase3表達(dá)量也顯著下降, 而抗凋亡分子bcl-2表達(dá)量顯著上升, 說明JNK誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也被抑制。同樣地, Kato 等[40]發(fā)現(xiàn)在深部組織損傷的大鼠腎小管上皮細(xì)胞中, 抑制IRE1通路可顯著降低細(xì)胞凋亡; Huang 等[41]研究發(fā)現(xiàn)乙型腦炎病毒誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中, 抑制IRE1通路也可顯著降低BHK-21細(xì)胞凋亡。此外, 在本實(shí)驗(yàn)中熒光顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度結(jié)果顯示, 加入STF-083010顯著減弱了鈣離子紊亂, 減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[38]。由此可見, 亞硝酸鹽和其他的致凋亡因子相似, 可以通過抑制IRE1通路降低其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述, 高濃度亞硝酸鈉會誘導(dǎo)L8824細(xì)胞發(fā)生凋亡, 激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路, 顯著降低細(xì)胞活力, 并引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子紊亂; 加入了IRE1抑制劑后, 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度顯著降低, 細(xì)胞活力顯著升高。以上結(jié)果表明, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1通路在高濃度亞硝酸鈉誘導(dǎo)的L8824細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。