豬SLA-1分子結(jié)合多肽特性分析及功能驗證

巴利民,王振豹,齊 鵬,汪 明，肖 進，喻長遠

(1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 朝陽 100029；2.中牧實業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)中心，北京 海淀 100095；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

SLA I 類分子(豬白細(xì)胞抗原，Swine leukocyte antigen)在豬的免疫反應(yīng)中起到十分重要的作用[1]，內(nèi)源化病原微生物的加工、呈遞主要依賴該分子的介導(dǎo)，同時激活相應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL細(xì)胞)進而引起機體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。故而，SLA I 類分子對機體抵抗病原微生物的侵染、腫瘤治療等方面均起到極其重要的作用[2-3]。目前新一代獸用亞單位疫苗因其自身特點，研發(fā)相對較多，但是與全病毒疫苗相比，在免疫效果上要略差一些，因此，為了提高其免疫保護性，一個策略就是增加免疫反應(yīng)的種類，即增加一定程度的細(xì)胞免疫。另外對一些常見的以細(xì)胞免疫應(yīng)答“為主”的豬病毒性疫病疫苗的研發(fā)也有一定的積極意義。本試驗對豬群中表達頻率較高的豬SLA-1(SLA-1*080101)等位基因進行分析，考察其呈遞多肽錨定殘基特點，利用表位預(yù)測軟件對口蹄疫病毒進行抗原表位預(yù)測，并通過動物試驗進行功能驗證。該研究將為研發(fā)具有激發(fā)細(xì)胞免疫的亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)，另外對于加強市場現(xiàn)有口蹄疫疫苗的保護效果有一定的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胎牛血清(FBS)和RMPI 1640培養(yǎng)基，均購自北京邁晨科技有限公司；豬用淋巴細(xì)胞分離液，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；陽性刺激物和豬IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點檢測試劑盒，均購自北京旭和源生物科技有限公司。

1.2 豬SLA-1分子結(jié)合多肽特性分析 利用seq2Logo工具對豬SLA-1分子結(jié)合多肽特性進行分析，同時創(chuàng)建多肽特征并使其可視化。主要原理是基于SLA I 類分子呈遞多肽功能的特性，重點考察第2位和第9位的呈遞多肽殘基，以直觀圖例的方式將氨基酸基序表示出來。

1.3 表位多肽的預(yù)測與合成 本文通過計算機程序NetMHCpan-4.0對口蹄疫病毒CTL表位進行預(yù)測，同時結(jié)合1.2中方法結(jié)果，以期獲得豬SLA-1*080101等位基因的潛在結(jié)合多肽。按照此方法，獲得6條預(yù)測的可能性較高的CTL表位多肽，然后通過固相合成法合成并利用高效液相色譜純化，使其純度大于90%。

1.4 疫苗配制 為了減少實驗動物使用數(shù)量，保障動物福利，本試驗選取3種CTL表位多肽抗原混合為一組(第1組P1、P2、P3，第2組P4、P5、P6)配制疫苗。具體配制方法如下：每組苗各取多肽抗原3 mg，分別用50 mL PBS稀釋至每種多肽抗原濃度為60 μg/mL，過濾除菌制成抗原相；將上述液體與50 mL佐劑配制成疫苗。

1.5 動物免疫 按照表1進行動物免疫，所選動物為口蹄疫抗體陰性的三元雜交豬，每頭動物耳根后肌內(nèi)注射指定疫苗1 mL，每種疫苗免疫5頭動物，同時設(shè)置未免動物空白對照組3頭。

免疫動物28 d后，采集免疫動物全血，分離外周血淋巴細(xì)胞，進行細(xì)胞因子檢測試驗，該試驗可以用每種多肽抗原單獨刺激相應(yīng)外周血淋巴細(xì)胞，考察細(xì)胞因子的分泌情況，達到CTL表位肽篩選目的。

1.6 細(xì)胞因子的檢測(IFN-γ)

1.6.1 豬外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離 取抗凝血小心加到等體積的淋巴細(xì)胞分離液液面上，于20 ℃，2 000 r/min(700 g)離心20 min。離心后中間層為淋巴細(xì)胞分離層(灰白色云霧層)，吸取該層至15 mL的離心管中。用Hank′s液洗滌細(xì)胞2次，計數(shù)，用RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/mL待用。

1.6.2 Elispot試驗檢測IFN-γ水平 本試驗采用酶聯(lián)免疫斑點(Elispot)試驗對采集分離的免疫動物外周血淋巴細(xì)胞進行細(xì)胞因子IFN-γ的檢測，具體方法按照IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點檢測(Elispot)試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 豬SLA-1分子結(jié)合多肽特性 利用seq2Logo工具對豬SLA-1分子(SLA-1*080101)結(jié)合多肽特性進行分析，以直觀圖例的形式進行表示，具體如圖1。

在圖1中，縱坐標(biāo)方向每個字母的相對高度與該位置上相應(yīng)氨基酸的頻率成比例。由此可見，SLA-1*080101等位基因結(jié)合多肽的第2位氨基酸偏好L、V、I、T、M，第9位氨基酸偏好于Y、F和M。故而本試驗確定該等位基因的結(jié)合多肽殘基基序為：X-(L/V/I/T/M)-X-X-X-X-X-X-(Y/F/M)。

結(jié)合以上第2位和第9位結(jié)合氨基酸的種類特點，輔以計算機程序NetMHCpan-4.0對口蹄疫病毒緬甸98株的VP1結(jié)構(gòu)蛋白序列進行預(yù)測，結(jié)果獲得如下表2中口蹄疫病毒CTL表位。這些表為具有預(yù)測分值高，同時具有SLA-1*080101等位基因結(jié)合多肽的第2位和第9位氨基酸特性，故而選擇其作為后續(xù)功能驗證用多肽抗原。

表2 預(yù)測獲得的口蹄疫CTL表位Table 2 The CTL epitope peptides from the FMDV by silico prediction methods

2.2 Elispot試驗結(jié)果 動物免疫28 d后采集全血，使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用試劑盒檢測細(xì)胞因子含量。具體結(jié)果如圖2，對照組為6條多肽抗原混合后分別刺激空白對照組的3頭豬只的外周血淋巴細(xì)胞的結(jié)果；P1、P2和P3為該3條多肽分別單獨刺激免疫組1的5頭豬只外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ數(shù)量；P4、P5和P6為該3條多肽分別單獨刺激免疫組2的5頭豬只外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ數(shù)量。

圖2 豬只免疫28 d后IFN-γ的表達水平Fig.2 The expression level of IFN-γ in swines at 28 days post immunization

從圖2可以看出，本文通過軟件預(yù)測和seq2Logo工具確定的6條多肽抗原免疫試驗動物以后，有4條多肽抗原相對于空白對照組，可以不同程度上導(dǎo)致實驗豬只的IFN-γ水平上調(diào)。但是在這4條多肽抗原的試驗結(jié)果中，多肽抗原P1和P4導(dǎo)致IFN-γ表達水平上調(diào)最為明顯，與空白對照組差異極顯著。而多肽抗原P3和P6對IFN-γ表達水平上調(diào)作用相較于多肽抗原P1和P4要弱。多肽抗原P2和P5沒有導(dǎo)致IFN-γ表達水平的上調(diào)，這2條肽中，P2的第9位和P5的第2位氨基酸殘基與seq2Logo工具確定的氨基酸基序不符，可能是導(dǎo)致未刺激明顯IFN-γ的原因，這也從另一方面證實本試驗確定的結(jié)合多肽殘基基序的可靠性。

3 討論

通過解析的SLA I類分子結(jié)構(gòu)可以知道，一般情況下該分子包含6個口袋，在結(jié)合槽上從N端到C端的順序分別為A、B、C、D、E和F口袋[4]。研究表明，構(gòu)成這些口袋的氨基酸的大小、帶電性質(zhì)和化學(xué)特性等特征均有所差別，導(dǎo)致了結(jié)合的錨定殘基的種類也不同[5]。這就決定了SLA I類分子結(jié)合抗原肽的序列有特定的規(guī)律和特點。在這6個口袋中，B口袋和F口袋對SLA I類分子與多肽形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性影響相對較大，其所容納的多肽殘基稱為初級錨定殘基(即多肽的第2位和第9位氨基酸殘基)，為多肽抗原的特征殘基，故而本文重點研究在商品豬中出現(xiàn)頻率較高的SLA-1*080101等位基因所遞呈多肽的特點，結(jié)果獲得了這個等位基因蛋白結(jié)合多肽殘基基序為：X-(L/V/I/T/M)-X-X-X-X-X-X-(Y/F/M)。該基序?qū)τ陬A(yù)測和設(shè)計針對SLA-1*080101等位基因的多肽抗原有重要指導(dǎo)意義。

另外本文通過動物試驗，利用測定細(xì)胞因子方法進一步證實了口蹄疫病毒上針對SLA-1*080101等位基因的CTL表位多肽，獲得2條具有細(xì)胞免疫反應(yīng)的多肽抗原(P1和P4)。目前在研和在售的口蹄疫合成肽疫苗產(chǎn)品均是以體液免疫為主，很少能夠刺激起較強的細(xì)胞免疫反應(yīng)，為了提高此類合成肽疫苗的免疫反應(yīng)和保護效果，有必要研究細(xì)胞免疫反應(yīng)多肽抗原。本文獲得的2條CTL表位多肽將有助于開發(fā)口蹄疫細(xì)胞免疫疫苗，完善現(xiàn)有產(chǎn)品性能，對口蹄疫的防治工作具有重要的意義。