蛹蟲草優(yōu)良菌株的篩選

郭尚，徐莉娜,，李艷婷，周偉，陳楠，張生萬，李銀生

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學院 食用菌研究所，山西 太原 030031；2.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006；3.山西師范大學 生命科學學院，山西 臨汾 041000；4.山西省太原市陽曲縣農(nóng)委，山西 太原 030100)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)，別稱北蟲草，與野生冬蟲夏草同屬肉座菌目(Hypocreales)[1]。蛹蟲草資源生態(tài)分布廣闊，我國主要分布在遼寧、陜西、廣西、福建、甘肅等地區(qū)；國外主要集中在法國、德國、英國、美國以及加拿大等國家的一些地區(qū)。蛹蟲草營養(yǎng)價值豐富，富含多種活性物質(zhì)，如蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、多酚等，在抑制腫瘤、抗疲勞、提高人體免疫力等方面起到重要作用[2,3]。有研究對比分析蛹蟲草與冬蟲夏草的化學成分及營養(yǎng)價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者化學成分含量相當，而且有些對人體有益成分的平均含量還要高于冬蟲夏草，這一發(fā)現(xiàn)使得蛹蟲草可作為冬蟲夏草的良好代替品進行生產(chǎn)和消費[4]。

蛹蟲草因生態(tài)適應(yīng)性較強，現(xiàn)已在全國各地實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，山西呂梁有多家公司投資種植。食用菌培育的關(guān)鍵在于菌種的選擇，菌種的優(yōu)劣在很大程度上決定了生產(chǎn)的效益。本實驗團隊在日常指導蛹蟲草培育中發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌株退化現(xiàn)象嚴重，即使最初引進的是最優(yōu)菌株，在出草2～3個周期之后，一些出草周期延長，一些出草率降低或者長出畸形子實體，有的甚至沒到成熟期就停止生長，出現(xiàn)白化現(xiàn)象。蛹蟲草菌種退化嚴重是目前蟲草產(chǎn)業(yè)存在的普遍問題，因此亟待高效穩(wěn)產(chǎn)菌株解決此問題[5]。

為解決菌種退化問題和選育適于山西省境內(nèi)培育的優(yōu)良菌種，本研究對不同來源的9個蛹蟲草菌株進行了菌絲生物學特性研究、液體菌種制備、出菇篩選等試驗，以期獲得高效穩(wěn)產(chǎn)的優(yōu)良蛹蟲草菌株，為推進山西省蟲草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

本試驗所用菌株(1號、2號、5號、6號、7號、8號、9號)由山西省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供，菌株(3號、4號)由中國科學院微生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，自來水1 000 mL，自然pH。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1.5 g，KH2PO41.5 g，自來水1 000 mL，自然pH。

培養(yǎng)基滅菌條件：121 ℃，滅菌 25 min。

1.1.3 供試菌種制作

固體菌種：用接種棒挑取蟲草菌菌塊接種到PDA平板培養(yǎng)基中心位置，放置恒溫培養(yǎng)箱中，22 ℃避光培養(yǎng)，進行活化。活化好的菌株采用直徑8 mm的打孔器打取1塊，接種至PDA平板培養(yǎng)基中心位置，放置恒溫培養(yǎng)箱中，22 ℃避光培養(yǎng)，待菌絲體布滿平板二分之一時，備用。

液體菌種：用直徑5 mm的滅菌打孔器在PDA平板上選取5塊帶培養(yǎng)基的菌塊接種至含有100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶(容量250 mL)中，置恒溫搖床，22 ℃，135 r·min-1，避光培養(yǎng)3 d左右，待出現(xiàn)顆粒菌球，均勻懸浮在液體培養(yǎng)基中，即液體菌種。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌落培養(yǎng)

選取蛹蟲草菌塊接種至PDA平板中央，置于光照培養(yǎng)箱(100 Lux)，22 ℃培養(yǎng)5 d后，每隔2 d觀察記錄菌絲形態(tài)，并量取菌落直徑。

1.2.2 液體培養(yǎng)

取相同量的菌塊置于搖瓶中，液體培養(yǎng)3 d后，培養(yǎng)液過濾，所得菌絲體在65 ℃條件下烘干至恒重，記錄重量。

1.2.3 人工栽培試驗

栽培試驗在山西省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所栽培溫室進行。栽培容器采用高15 cm、直徑8 cm的組培瓶，用無菌透氣膜封口。將菌球大小均一、無污染的液體菌種用無菌水稀釋2倍，8層紗布過濾即為栽培種。選取新鮮無霉變大米20 g，加入20 mL液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌45 min，冷卻至室溫接種，接種量以2 mL為宜，用無菌微量注射器接種于基質(zhì)表面，接種完成后，透氣膜封口，置于發(fā)菌室，18 ℃黑暗條件下發(fā)菌。待基質(zhì)表面出現(xiàn)白色凸起進行22 ℃培養(yǎng)并提供光照進行轉(zhuǎn)色，轉(zhuǎn)色完成后，在封口膜上均勻打孔增大通氣量，促進子實體生長。觀察記錄不同菌種子實體的出草時間以及子實體的形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS.16.0進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，方差分析采用單因素方差分析法(LSD)進行，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株在培養(yǎng)基上的菌絲生長情況

由表1可見，來源不同的9株蟲草菌在PDA平板培養(yǎng)基上的生長速率和菌落形態(tài)存在明顯差異，日均生長速度范圍在1.98～3.75 mm之間；生長初期，菌絲處于適應(yīng)期，生長緩慢，各個菌株生長速率差異不明顯，到了培養(yǎng)后期，由于各菌株生物學的特異性，長勢差異明顯。其中 1號、6號、7號和9號菌株的菌絲生長一直處于平緩狀態(tài)，菌落邊緣不平整，且菌絲顏色較淡； 2號、4號和8號菌株在培養(yǎng)后期菌絲生長速度加快，這說明菌絲對培養(yǎng)環(huán)境有一定的適應(yīng)期，等完全適應(yīng)了新環(huán)境之后，生長速率加快，進一步說明該3株菌的菌絲適應(yīng)能力強，生長周期結(jié)束之后，菌落邊緣整齊、菌絲呈絨毛狀、淡黃色；3號和5號菌株生長速率較慢，菌落不規(guī)則，菌絲稀疏呈放射狀。

表1 不同菌株菌絲生長試驗結(jié)果Table 1 Results of different strains on mycelia growth 單位：mm

2.2 各菌株在液體培養(yǎng)基中的菌絲生長情況

不同菌株液體培養(yǎng)所得菌絲生物量測定結(jié)果見圖1。9 株菌菌絲生物量在0.28 ～0.89 g范圍之間，差異顯著。其中3號和6號菌株的生物量較小，說明液體培養(yǎng)菌絲生長能力較弱；8號和9號菌株的菌絲生物量較大，其中 8號菌株的菌絲生物量最大；1號和2號菌生物量相近，說明這兩株菌在液體培養(yǎng)基中的長勢一樣；4號、5號和7號菌株生物量相差不大，說明這3個菌株對液體培養(yǎng)條件的適應(yīng)性一致。綜上可知，9株菌種的生長趨勢為：8號>9號>2號>1號>4號>5號>7號>3號>6號。

圖1 不同菌株菌絲體生物量試驗結(jié)果Fig.1 Rsults of different strains on mycelium biomass

2.3 各菌種栽培蛹蟲草試驗

2.3.1 不同菌株子實體形態(tài)描述

不同菌株子實體形態(tài)描述：1號菌株子實體呈橙黃色，柄短、粗，有子囊殼，部分頭部發(fā)白；2 號菌株子實體淡黃色，柄稍彎曲、較細，有子囊殼，長勢稀疏； 3 號菌株子囊殼少，顏色橘黃，出草整齊均勻，出草率高，柄較短，粗細均勻，出草疏密度適當； 4號菌株子實體橘黃色，柄粗短，小尖頭；5號菌株子實體淡黃色，柄細高、光滑，根部粗；6號菌株子實體橙黃色，柄矮、粗，頭部細小，有子囊殼，部分頭部發(fā)白；7號菌株子實體橘黃色，柄彎曲扁平，有子囊殼，出草不均勻；8號菌株子實體淡黃色，子囊殼豐富，頭部發(fā)白，出草整齊均勻，出草率高，柄粗細均勻，出草疏密度適當；9號菌株子實體稀少，出草率低，基質(zhì)布滿絨毛狀菌絲(表2、圖 2)。

圖2 不同菌株子實體形態(tài)Fig.2 The morphology of fruiting body of different strains

2.3.2 不同菌株人工栽培試驗結(jié)果

由表2可見，1號、2號、3號、6號、8號和9號菌株原基出現(xiàn)時間相近，且1號和2號菌株轉(zhuǎn)色時間一致，生長速率一致，最終子實體鮮重也相近；但3號、6號和8號菌株轉(zhuǎn)色時間較長，生長速率差異明顯，最終結(jié)實周期也不相同，新鮮子實體重量以8號菌最高，3號菌次之；9號菌起初生長狀態(tài)與其余菌種相似，但最終結(jié)實率不高，菌絲體布滿基質(zhì)表面。4號、5號和7號菌株原基出現(xiàn)時間較長，均在9 d以上，4號菌株所需轉(zhuǎn)色時間少，但3株菌生長速率相近，生長周期完成后，5號菌子實體長勢最好，7號菌污染嚴重。

由以上試驗結(jié)果可知，不管是固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)，還是人工栽培，8號菌株均表現(xiàn)出了良好的適應(yīng)性和較好的生長趨勢，因此8號菌可以作為優(yōu)勢菌株進行生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。

3 討論與結(jié)論

通過對 9 株蛹蟲草菌株的菌絲形態(tài)和生長速率、液體培養(yǎng)生物量以及子實體形態(tài)、重量、采收周期以及污染率的對比研究，最終篩選出 8 號菌株為最佳生產(chǎn)菌種，其菌絲萌發(fā)快、長勢好，液體培養(yǎng)生物量積累量高，子實體形態(tài)優(yōu)良、產(chǎn)量高，污染率較低。

菌種退化問題是目前蛹蟲草產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中面臨的最普遍難題[6]。菌種退化是不可逆的，而且這種退化還具有可遺傳性，這不僅會造成當期蛹蟲草生產(chǎn)質(zhì)量受阻，還會直接影響菌種質(zhì)量，給后續(xù)的批量生產(chǎn)帶來極大的風險。如何克服蛹蟲草菌種退化技術(shù)難題問題已成為國內(nèi)外學者研究的焦點[7]。一旦菌種出現(xiàn)退化現(xiàn)象，其最明顯的表現(xiàn)就是菌絲體培養(yǎng)階段出現(xiàn)原基時間延長，原基量少且大小不均一；除此之外，轉(zhuǎn)色期延長或直接不轉(zhuǎn)色，導致后續(xù)出草管理時，遲遲沒有子實體長出，或者長出形態(tài)各異、長短不一、粗細不等、顏色不均的畸形子實體[8]。更有甚者，還會有白色子實體出現(xiàn)，這可能與蟲草菌菌絲體色素減少有關(guān)。有研究者對退化菌株做了詳細顯微觀察，結(jié)果顯示，對于出現(xiàn)了退化現(xiàn)象的菌株，其差異不僅表現(xiàn)在外觀上，即原基不轉(zhuǎn)色或轉(zhuǎn)色不徹底，其內(nèi)在的結(jié)構(gòu)亦發(fā)生了變化，比如退化菌株菌絲纖細、彎曲，在顯微鏡下孢子粘連在一起呈頭狀、山丘狀，而正常菌株菌絲挺立、粗壯，分生孢子呈念珠狀[9]。另外，有研究表明退化菌株子實體顏色發(fā)生變化主要與菌株本身的脫氫酶活性有關(guān)[10]。關(guān)于蛹蟲草菌種退化的機理有很多說法，但主要集中在核型改變、基因突變和有害物質(zhì)積累方面。單就蛹蟲草子實體培育過程所需的營養(yǎng)條件及管理原則來看，其子實體是否能夠正常發(fā)育主要有2方面的原因：一是菌種選擇；二是培養(yǎng)條件的設(shè)定[11～14]。而這2個因素都可以人為改變，所以選育高效優(yōu)產(chǎn)的蛹蟲草菌株指日可待。

表2 不同類型菌種栽培蛹蟲草試驗結(jié)果比較Table 2 Comparison of experimental results of different strains

在本研究中，我們僅對現(xiàn)有蛹蟲草菌種進行了簡單篩選，采用的是常規(guī)的組織分離法，并沒有從遺傳學方面對菌種進行修飾，不能保證菌種的優(yōu)勢特征在后續(xù)的生產(chǎn)中可以持續(xù)穩(wěn)定遺傳，而且傳代試驗也只進行到第三代，因此如果要采用此菌種進行大規(guī)模生產(chǎn)，還需進一步的研究，務(wù)必從遺傳學方面進行干預，保證菌種的優(yōu)良性狀可以穩(wěn)定遺傳。