干細(xì)胞治療宮腔粘連及薄型子宮內(nèi)膜的研究進展

郭杉，劉英

隨著輔助生殖技術(shù)的日趨成熟，越來越多的不孕不育患者可以接受規(guī)范治療后成功受孕。但是，通過輔助生殖技術(shù)助孕的患者每一周期的臨床分娩率僅為30%，且近年趨于穩(wěn)定[1]。影響輔助生殖技術(shù)成功率的一個重要因素是不孕不育患者的子宮內(nèi)膜狀態(tài)。子宮內(nèi)膜損傷及子宮內(nèi)膜炎癥均可造成宮腔狀態(tài)異常，進而導(dǎo)致宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）及子宮內(nèi)膜薄等病癥[2]。

IUA是女性繼發(fā)性不孕的主要病因之一[3]。對于IUA患者，目前臨床上采取的治療手段主要為宮腔鏡手術(shù)治療，然而通過手術(shù)分離粘連、出血和穿孔風(fēng)險大，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，可能導(dǎo)致患者內(nèi)膜再次損傷[4]。臨床上子宮內(nèi)膜過?。ǎ? mm）的患者，移植的胚胎難以植入[5]。雖然臨床應(yīng)用諸多種類的藥物如芬嗎通、阿司匹林、西地那非等，以改善患者子宮內(nèi)膜的厚度和血流量，進而提高胚胎移植后的臨床妊娠率，但效果甚微[6]。

干細(xì)胞療法是21世紀(jì)的熱點研究領(lǐng)域，為這類患者帶來了希望。已有許多種類的干細(xì)胞被證實與子宮內(nèi)膜更新再生相關(guān)，可被應(yīng)用于子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)，如骨髓源性干細(xì)胞（bone marrow-derived stem cells，BMDSCs）[7]、 臍 帶 間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞（human umbilicalcord -derived mesenchymal stemcells，UC -MSCs）[8]、經(jīng)血干細(xì)胞 （menstrual blood-derived stromal cells，menSCs）[9]、 脂 肪 間 充 質(zhì) 干 細(xì) 胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）[10]、人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）等[11]。本文將從細(xì)胞實驗、動物實驗及臨床試驗三方面，對干細(xì)胞治療IUA及薄型子宮內(nèi)膜的研究進展進行綜述。

1 細(xì)胞實驗

1.1 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs） 分離于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團的hESCs，具有全能性，可向內(nèi)、中、外3個胚層方向分化[12]。已有研究表明，在適宜條件下hESCs可被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞[13]、視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞[14]、肝細(xì)胞樣細(xì)胞[15]、胰島素分泌細(xì)胞[16]和神經(jīng)前體細(xì)胞[17]等。

有學(xué)者曾將其生殖中心自主建系的hESCs向子宮內(nèi)膜細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，采用共培養(yǎng)、細(xì)胞因子以及擬胚體懸浮分化3種方法對在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast cell，MEF）飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的hESCs進行分化。在共培養(yǎng)組中，使用膜嵌套（transwell）共培養(yǎng)系統(tǒng)，將子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與hESCs進行共培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基為含有β雌二醇（β-E2）、轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）、表皮生長因子（EGF）、血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）及10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；在細(xì)胞因子組中，hESCs于MEF上培養(yǎng)4 d后，將培養(yǎng)基更換為含有β-E2、TGF-α、EGF、PDGF-BB及10%血清的分化培養(yǎng)基；在擬胚體分化組中，將hESCs種在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)4 d后，機械法將克隆切下，放入低吸附培養(yǎng)皿中，加入擬胚體懸浮培養(yǎng)基。5 d后，將擬胚體轉(zhuǎn)入經(jīng)0.1%明膠鋪底的培養(yǎng)皿中，使擬胚體貼壁。將培養(yǎng)基更換為含有β-E2、TGF-α、EGF、PDGF-BB及10%血清的分化培養(yǎng)基。3組均于第2周，將分化培養(yǎng)基中的血清濃度降為5%，第3周，將培養(yǎng)基更換為不含血清的分化培養(yǎng)基。誘導(dǎo)分化過程總歷時21 d。培養(yǎng)所得的終末細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，共培養(yǎng)組16.4%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞因子組7.1%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，擬胚體懸浮組6.2%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞[18]。分化細(xì)胞中，非經(jīng)典Wnt信號通路配體Wnt5a基因表達量明顯高于未分化細(xì)胞。后續(xù)實驗在分化過程中加入Wnt5a可促進分化，使分化效率提高；Wnt通路抑制劑分泌性卷曲相關(guān)蛋白（sFRP2）則抑制分化，使分化效率降低[19]。

另有研究報道，使用共培養(yǎng)法及細(xì)胞因子法（β-E2，EGF，PDGF-BB）對自主建系的hESCs進行誘導(dǎo)分化，分為共培養(yǎng)加細(xì)胞因子組、共培養(yǎng)組和細(xì)胞因子組3組[11]。與前一報道[18]不同的是，此分化培養(yǎng)基為含有β-E2、EGF和PDGF-BB的DMEM/F12培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化12 d后，對各組細(xì)胞進行傳代，分化35 d后，對各組分化細(xì)胞進行免疫熒光檢測，共培養(yǎng)加細(xì)胞因子組約有80%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，15%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞；共培養(yǎng)組約有70%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，部分細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞因子組35%的細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，部分細(xì)胞分化為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞。以上結(jié)果表明，添加細(xì)胞因子的不同種類會影響hESCs向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化的方向，添加TGF-α可能利于hESCs向子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞方向分化。

1.2 UC-MSCs UC-MSCs來源于新生兒廢棄臍帶組織，易于體外培養(yǎng)，具有多向分化的能力，因其免疫原性低、增殖周期短和存活時間長被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植研究中[20-21]。有報道將人UC-MSCs向子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞分化，采用共培養(yǎng)加細(xì)胞因子法、單純共培養(yǎng)法，同時設(shè)置對照組。在共培養(yǎng)加細(xì)胞因子組中，將人UC-MSCs種于六孔板底，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞種入transwell嵌套中，加入含有β-E2、TGF-α、EGF、PDGF-BB及2%胎牛血清的分化培養(yǎng)液；在單純共培養(yǎng)組中，共培養(yǎng)體系加入含有2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。整個分化過程持續(xù)21 d后，免疫熒光結(jié)果顯示，共培養(yǎng)加細(xì)胞因子組的分化終末細(xì)胞大部分角蛋白表達陽性，波形蛋白表達陰性，向子宮內(nèi)膜上皮樣細(xì)胞分化；而單純共培養(yǎng)組及對照組細(xì)胞角蛋白及波形蛋白雙陽性，未見定向分化[22]。這表明在誘導(dǎo)人UC-MSCs向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化的過程中，需要子宮內(nèi)膜細(xì)胞與細(xì)胞因子的共同作用。進一步探究在分化過程中起重要作用的通路過程中發(fā)現(xiàn)，在加入蛋白激酶A（PKA）通路激活劑8-BrcAMP后，人UC-MSCs與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)21 d，并在其他細(xì)胞因子（β-E2，TGF-α，EGF，PDGFBB）的協(xié)同作用下，分化后的細(xì)胞波形蛋白表達陽性，角蛋白表達陰性，提示人UC-MSCs向子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞方向分化。這表明在誘導(dǎo)分化過程中，不同分子化合物的添加及不同通路的激活或抑制，會影響人UC-MSCs向不同種類子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分化方向。

2 動物實驗

2.1 干細(xì)胞異種移植 在動物實驗中，不同種類、不同來源的干細(xì)胞移植治療子宮內(nèi)膜損傷的效果顯著。來源于脂肪組織的脂肪干細(xì)胞具有多系分化的能力，具有臨床應(yīng)用價值。有報道將綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞注入子宮內(nèi)膜損傷的模型大鼠中。30 d后，大鼠損傷的子宮內(nèi)膜微血管密度增高，子宮內(nèi)膜厚度及腺體數(shù)量增加，并且在后續(xù)的妊娠實驗中，60%的大鼠成功受孕，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）[10]。在另一項研究中，UCMSCs經(jīng)尾靜脈注射入子宮內(nèi)膜損傷的模型大鼠體內(nèi)，SD大鼠內(nèi)膜損傷部位的纖維化及炎癥狀態(tài)顯著緩解，子宮內(nèi)膜細(xì)胞及新生血管顯著增多[23]。但單純使用干細(xì)胞移植，移植后細(xì)胞種植率較低，促進子宮內(nèi)膜修復(fù)再生的效率較低。

2.2 組織工程研究 隨著人們對不同種類干細(xì)胞的深入研究，組織工程學(xué)得到了長足的發(fā)展。組織工程學(xué)是一門交叉學(xué)科，旨在制造新的組織，替代因疾病或創(chuàng)傷受損的人體器官[24]。在組織工程學(xué)中，組織由三個重要部分構(gòu)建而成：支架、細(xì)胞因子及細(xì)胞。支架可以通過分泌可溶性因子，為細(xì)胞提供生存微環(huán)境；也可通過固相支持，使細(xì)胞黏附、遷徙，進一步形成組織。目前，研究報道的支架種類有膠原蛋白支架、透明質(zhì)酸支架等。種植于膠原支架上的UC-MSCs，可以通過旁分泌的方式促進子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖，減輕子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡[25]。細(xì)胞因子影響了細(xì)胞的表型、代謝、遷徙等過程，所添加的細(xì)胞因子種類的選擇，可參照器官生理形成過程中起重要作用的細(xì)胞因子。而細(xì)胞則是最重要的組成部分，細(xì)胞具有很多功能，包括合成組織基質(zhì)、維持組織穩(wěn)態(tài)、與機體原有組織整合等作用。分化終末態(tài)細(xì)胞因其安全性高被廣泛應(yīng)用于組織工程學(xué)中[26]。

已有多個實驗將干細(xì)胞治療方案與組織工程學(xué)結(jié)合，應(yīng)用于動物實驗中。有學(xué)者采用MSCs分泌因子與透明質(zhì)酸凝膠結(jié)合，在體外的劃痕實驗中，與對照組相比，24 h后，MSCs-透明質(zhì)酸凝膠組劃痕間距變小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。將含有MSCs分泌因子的透明質(zhì)酸凝膠注射入子宮內(nèi)膜損傷的SD大鼠子宮中后，子宮內(nèi)膜損傷情況得到改善，子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體數(shù)量明顯增多。并且在后續(xù)的妊娠實驗中，接受MSCs-透明質(zhì)酸凝膠治療的SD大鼠子宮妊娠囊數(shù)量明顯多于單用MSCs分泌因子組及單用透明質(zhì)酸凝膠組[27]。另有研究將SD大鼠的骨髓MSCs 在體外培養(yǎng)擴增，與維生素C 及水凝膠（Pluronic F-127）混合后注射到子宮內(nèi)膜機械損傷的SD大鼠模型中，移植8周后，維生素C增強了骨髓MSCs在水凝膠內(nèi)的活性，SD大鼠子宮內(nèi)膜增厚，腺體數(shù)量增多，纖維化區(qū)域明顯減少，且細(xì)胞角蛋白表達量上升，炎性因子IL-1β表達量明顯下降[28]。也有研究報道，將由hESCs誘導(dǎo)分化而成的子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞種入膠原支架，注射入子宮角機械損傷的SD大鼠模型中，與對照組相比，子宮無明顯水腫，并于后續(xù)的妊娠實驗中，在子宮損傷區(qū)域出現(xiàn)妊娠囊[11]。這些實驗雖然獲得了較好的前期結(jié)果，但尚不能得到臨床應(yīng)用。

2.3 富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）聯(lián)合干細(xì)胞治療 PRP是包含高濃度血小板及自體血漿的血液衍生物，富含多種血漿蛋白、生長因子及細(xì)胞因子，具有抗菌殺菌、促進組織傷口愈合等作用[29]。已有研究表明，薄型子宮內(nèi)膜患者宮腔灌注自體PRP后，子宮內(nèi)膜顯著增厚，后續(xù)胚胎移植臨床妊娠率顯著提升[30-32]。2018年“輔助生殖技術(shù)中異常子宮內(nèi)膜診治的中國專家共識”中，國內(nèi)生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)＜医ㄗh對薄型子宮內(nèi)膜患者選擇藥物、PRP灌注、干細(xì)胞移植等聯(lián)合治療方案[33]。有研究將PRP與經(jīng)血干細(xì)胞注射到子宮內(nèi)膜機械損傷的大鼠子宮內(nèi)，18 d后大鼠子宮內(nèi)膜增厚，新生血管增多，炎癥及纖維化狀態(tài)明顯改善，PRP與經(jīng)血干細(xì)胞聯(lián)合治療組效果優(yōu)于單用經(jīng)血干細(xì)胞或單用PRP治療組[34]。也有研究表明，PRP可提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)IUA模型大鼠子宮角的效果，促進胰島素樣生長因子1（IGF-1）和白細(xì)胞介素10（IL-10）在再生的子宮內(nèi)膜組織的表達，增強骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三系分化能力[35]。這些實驗表明，PRP與干細(xì)胞療法聯(lián)用，對臨床患者治療效果更佳。

3 臨床試驗

3.1 骨髓源性干細(xì)胞 從骨髓中分離的干細(xì)胞具有多向分化能力，可在適宜條件下誘導(dǎo)分化為目的細(xì)胞。骨髓源性干細(xì)胞參與了人子宮內(nèi)膜的修復(fù)再生過程[36]，在人體內(nèi)可以分化為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞[37]。但目前尚未明確參與子宮內(nèi)膜修復(fù)過程的骨髓源性干細(xì)胞的具體亞群。

有研究報道，抽取患者自身的骨髓組織進行體外流式分選后，將骨髓源性干細(xì)胞經(jīng)宮頸注入患者子宮宮腔中，后續(xù)補充雌激素并服用阿司匹林，137 d后，患者子宮內(nèi)膜厚度增至6.9 mm，胚胎移植后患者成功妊娠[38]。

另有研究分別獲取16例30～45歲女性患者的骨髓源性干細(xì)胞，流式分選出CD133陽性細(xì)胞后，經(jīng)動脈回輸對患者進行治療，2個月后患者子宮內(nèi)膜厚度顯著增加（4.3 mm vs.6.7 mm，P=0.004），宮腔粘連情況改善，16例患者中有3例在治療后自然受孕，其中1例患者成功誕下嬰兒。但抽血及回輸操作會對患者造成一定的感染風(fēng)險，并且不利于反復(fù)操作[39]。同時，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力與患者年齡相關(guān)，在臨床應(yīng)用中仍需注意這一問題。

也有研究使用集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，G-CSF） 動員患者產(chǎn)生造血干細(xì)胞，抽血經(jīng)流式分選后將獲得單核細(xì)胞經(jīng)陰道側(cè)穹隆穿刺注射入子宮肌層與內(nèi)膜交界處，后續(xù)使用口服雌激素治療9個月后，患者的子宮內(nèi)膜由（1.38±0.39）mm增至（5.48±1.14）mm，其中5例患者恢復(fù)月經(jīng)。而這些患者此前均接受過2～3次宮腔鏡治療并規(guī)律服用雌激素，但并未起效。這一試驗未報道經(jīng)治療后患者妊娠情況[40]。

3.2 經(jīng)血干細(xì)胞 經(jīng)血干細(xì)胞是從女性月經(jīng)中分離出來的成體干細(xì)胞，表達干性標(biāo)記物OCT-4[41]和階段特異性表面抗原3/4（SSEA-3/4）[42]，具有多向分化能力，因獲取過程無創(chuàng)，而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。有研究收集患者的月經(jīng)，體外培養(yǎng)分離患者的經(jīng)血干細(xì)胞，再回輸入宮腔，對宮腔重度粘連（Ⅲ～Ⅳ級）的患者進行為期3年的治療。7例患者的經(jīng)血干細(xì)胞在體外條件下被成功分選培養(yǎng)，回輸入患者宮腔內(nèi)后，5例患者的子宮內(nèi)膜增至7 mm，其中1例患者自然受孕，4例患者接受了后續(xù)的凍胚移植，2例患者成功受孕[9]。但對于月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)的患者，經(jīng)血干細(xì)胞難以培養(yǎng)成功，這是在臨床應(yīng)用中需要考慮的問題。

3.3 UC-MSCs 具有低免疫原性的UC-MSCs，因其獲取過程容易，體外培養(yǎng)技術(shù)成熟，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞實驗及動物實驗中。但由于其異體性來源，UCMSCs的臨床應(yīng)用存在爭議。有研究將同種異體UCMSCs種植于膠原支架中，經(jīng)導(dǎo)管注入26例宮腔粘連患者宮腔內(nèi)，后續(xù)進行雌孕激素替代治療；3個月后患者子宮內(nèi)膜增厚，宮腔粘連狀況改善；DNA短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）分析結(jié)果顯示，患者再生的內(nèi)膜組織未檢測出異體性核酸；30個月隨訪過程中，10例患者成功受孕，8例患者誕下無出生缺陷的健康新生兒[43]。這為IUA的臨床治療提供了新的治療思路。

3.4 ADSCs 人體中含有大量的脂肪組織，可從大腿、腹壁、手部等皮下脂肪組織中獲取ADSCs。ADSCs具有多向分化能力，因其來源廣泛、易于獲取和體外培養(yǎng)增殖活性高，而被應(yīng)用于傷口修復(fù)及皮膚組織再生。同時，ADSCs分泌的細(xì)胞因子，具有抗炎作用，已被應(yīng)用于多發(fā)性硬化、克羅恩病等炎性及免疫疾病中[44]。

有研究通過抽脂獲得患者的脂肪組織，將含有脂肪干細(xì)胞、脂肪基質(zhì)血管成分的組織經(jīng)宮頸注入患者子宮中，后續(xù)進行雌激素補充治療；5例患者中有2例恢復(fù)月經(jīng)，3例月經(jīng)量增多，子宮內(nèi)膜由（3.0±1.0）mm增至（6.9±2.9）mm（P=0.043）；接受胚胎移植后，其中1例患者懷孕，但在妊娠第9周自然流產(chǎn)。這表明脂肪組織治療可使IUA患者月經(jīng)恢復(fù)，但患者妊娠率并沒有明顯提升[45]。后續(xù)研究應(yīng)關(guān)注ADSCs治療是否能改善患者的妊娠率。

4 局限性及展望

干細(xì)胞療法雖在動物實驗及一些臨床前驅(qū)性試驗中獲得了積極成果，但樣本量均較小，且并未設(shè)置對照組。在大范圍推廣過程中仍有以下兩個因素需要考慮：①干細(xì)胞培養(yǎng)及分化過程中不能有動物源性成分存在；②所使用干細(xì)胞的來源上，自體來源為最佳選擇，異體來源需考慮臨床應(yīng)用安全性及倫理學(xué)問題?；谄鋸姶蟮脑偕?、分化及修復(fù)能力，干細(xì)胞療法為臨床上宮腔粘連及薄型子宮內(nèi)膜患者提供了除藥物治療、手術(shù)治療外新的可能，期待未來干細(xì)胞療法能夠盡快完成從基礎(chǔ)實驗到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，造福廣大患者。