卵母細胞線粒體DNA與胚胎質(zhì)量的相關性研究進展

張敏，杜馨，李貝貝，姜宏

胚胎的線粒體全部來源于卵母細胞，卵母細胞質(zhì)量決定了胚胎的發(fā)育潛能。卵母細胞質(zhì)量低下的因素主要包括遺傳、高齡、超排卵、免疫和代謝等。近年，線粒體功能改變對卵母細胞及胚胎質(zhì)量的影響備受關注。有研究表明，線粒體基因缺陷或表達降低[1]及線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變累積[2]均可導致線粒體功能障礙和ATP產(chǎn)生減少，從而影響卵母細胞質(zhì)量、受精及胚胎的發(fā)育潛能。胚胎植入前遺傳學檢查（preimplanation genetic testing，PGT）的廣泛應用雖明顯降低了遺傳學異常胚胎的移植率，改善了輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）的臨床結局，但并不能改善患者的卵母細胞質(zhì)量，且PGT的常規(guī)使用仍存在爭議。因此，進一步闡明mtDNA與胚胎質(zhì)量之間的關系，對改善胚胎質(zhì)量及ART妊娠結局具有重要意義。本文主要綜述mtDNA的特點及與胚胎質(zhì)量的相關性。

1 MtDNA的結構特點

MtDNA是位于線粒體內(nèi)膜上的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，全長16 569 bp，其內(nèi)、外側鏈（分別稱為輕鏈、重鏈）均具有編碼功能。人mtDNA由一個編碼區(qū)和一個非編碼區(qū)（又稱D-loop區(qū)）組成。編碼區(qū)位于nt577-nt16023，重鏈編碼28個基因，輕鏈編碼9個基因，其中包括2個核糖體RNA（rRNA）基因、13個氧化磷酸化系統(tǒng)相關基因和22個轉運RNA（tRNA）基因。線粒體氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）依賴于5種多酶復合物的活性，復合物Ⅰ～Ⅳ構成電子傳遞鏈，復合物Ⅴ即ATP合酶，產(chǎn)生細胞能量合成所需的ATP。13個編碼線粒體呼吸多肽鏈的基因中，7個為復合物Ⅰ的亞基（ND1，ND2，ND3，ND4L，ND4，ND5和ND6），1個為復合物Ⅲ的亞基（cytochrome b，cytb），3個為復合物Ⅳ的亞基（COⅠ，COⅡ和COⅢ），2個為復合物Ⅴ的亞基（ATP6 和ATP8）。D-loop區(qū)位于nt16024-nt576，長1 122 bp，是mtDNA重鏈和輕鏈的啟動子區(qū)域。MtDNA 復制起始點和轉錄啟動子均位于此區(qū)。D-loop區(qū)是mtDNA變異的熱點區(qū)域，包含3個高突變區(qū)域（HVRⅠ：nt16024 -nt16383，HVR Ⅱ ：nt57 -nt372，HVR Ⅲ ：nt438-nt576）和一個周邊區(qū)（nt16384-nt56，nt373-nt437）。MtDNA的基因結構與核基因組明顯不同，全部為外顯子，無內(nèi)含子，使得大多數(shù)突變發(fā)生在編碼序列中，更容易出現(xiàn)其編碼RNA及蛋白異常，從而導致生物學上的后果。此外，mtDNA是裸露的，缺乏組蛋白的保護和mtDNA聚合酶γ的校對能力，且鄰近產(chǎn)生大量氧自由基的電子傳遞鏈，更容易受到損傷[3]。因此，mtDNA突變是造成線粒體結構和功能異常并影響細胞活性的主要原因。

2 MtDNA拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量

不同類型細胞中mtDNA拷貝數(shù)存在差異，成熟卵子的mtDNA含量明顯多于體細胞。原始生殖細胞中含有約200個mtDNA拷貝數(shù)，隨著卵子發(fā)生，線粒體數(shù)量和mtDNA拷貝數(shù)均逐漸增加，至卵子成熟完成受精時mtDNA拷貝數(shù)達到峰值。在囊胚階段，總體mtDNA拷貝數(shù)逐漸減少，但與內(nèi)細胞團相比，滋養(yǎng)外胚層中細胞的mtDNA拷貝數(shù)顯著增加，而內(nèi)細胞團則維持低水平的mtDNA復制。囊胚期內(nèi)細胞團的mtDNA拷貝數(shù)及代謝活動低于滋養(yǎng)外胚層可能與胚胎種植有關[4]。

MtDNA拷貝數(shù)變異的機制與遺傳、缺氧等線粒體微環(huán)境變化有很大關系。有研究發(fā)現(xiàn)，不同患者間及同一患者不同卵細胞內(nèi)的線粒體拷貝數(shù)存在高度異質(zhì)性，因此不同卵母細胞、胚胎的發(fā)育潛能也不盡相同[5]。受精失敗或退化的卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)明顯低于成功受精的卵母細胞[6]，且早期胚胎及發(fā)育阻滯的受精卵均存在線粒體分布、結構異常及mtDNA含量降低等現(xiàn)象[7]。然而，在不同的研究中存在許多差異，結果相互矛盾，這可能與許多混雜變量有關。近年研究顯示，高齡、非整倍體和植入潛能較差的囊胚中，mtDNA拷貝數(shù)顯著增加，mtDNA拷貝數(shù)顯著升高的胚胎均種植失敗[8-10]，與卵母細胞及卵裂期胚胎的研究結果相反。因此，有學者認為高水平的mtDNA僅能反應卵母細胞質(zhì)量及胚胎早期的發(fā)育潛能，在胚胎后期（囊胚期）較高水平的mtDNA可作為線粒體異常激活的證據(jù)，可能與胚胎發(fā)育異?；蚓€粒體功能不足代償性增加有關[11]。在染色體異常及植入潛能較差的胚胎中觀察到的mtDNA水平異常升高可能是胚胎的應激性反應，可作為胚胎發(fā)育異常的標志[8]。

人類卵母細胞及胚胎珍貴，且來源有限，難以用于科學研究，尋找無創(chuàng)的胚胎發(fā)育潛能生物學標志具有重要的臨床應用價值。目前研究主要聚焦于卵母細胞及胚胎培養(yǎng)液、顆粒細胞、卵丘細胞等。有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎培養(yǎng)液中mtDNA與基因組DNA比值（mtDNA/gDNA）與胚胎發(fā)育潛能相關，認為其可作為胚胎發(fā)育潛能的預測指標[12]。卵丘顆粒細胞（cumulus granulosa cells，CGCs）線粒體作為細胞能量代謝途徑的中心細胞器，直接參與了胚胎上游的卵子發(fā)生過程[11]，是評估卵母細胞質(zhì)量的最佳的非侵入性方法。有研究發(fā)現(xiàn)，豬卵母細胞中的mtDNA含量與其CGCs的mtDNA含量相關，CGCs的mtDNA含量增加有助于卵母細胞及胚胎的正常發(fā)育[13]。在卵母細胞成熟的不同階段，CGCs的mtDNA可進行自我降解和復制，以滿足相應卵母細胞的能量需求和卵母細胞細胞質(zhì)的成熟[14]，且CGCs mtDNA的拷貝數(shù)與胚胎質(zhì)量及胚胎植入潛能均呈正相關[11,15]，是體外受精（in vitro fertilization，IVF）過程中胚胎質(zhì)量的良好預測因子，陽性和陰性預測值分別為84.4%和82.1%[16]，支持將mtDNA量化后作為衡量胚胎質(zhì)量、預測胚胎植入潛力的生物標志物。

3 MtDNA突變與胚胎質(zhì)量

鑒于mtDNA自身結構特點和獨特的生物學環(huán)境，其突變比核基因組DNA（nDNA）更頻繁[17]。環(huán)境和代謝因素、病原體等應激源會損害線粒體相關基因的表達，特別是一些與mtDNA復制、轉錄和編碼OXPHOS復合體以產(chǎn)生ATP有關的基因。卵母細胞線粒體是各種應激源的關鍵靶點，當受到高強度的活性氧攻擊時，大量的氧化應激可導致卵母細胞內(nèi)線粒體形態(tài)和功能改變，引起生物體直接能量來源ATP合成障礙，當ATP水平降低到所需閾值以下會影響卵母細胞的減數(shù)分裂過程，造成胚胎發(fā)育異常，引發(fā)不良妊娠結局[18]。

MtDNA突變包括單個堿基替換、插入或大片段缺失。目前已鑒定出700余種mtDNA突變，其中一些與不孕癥有關[6]。由于線粒體只遺傳自母親，卵子質(zhì)量對不孕癥治療干預和生殖結局至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA的缺失在退化或發(fā)育阻滯的卵母細胞中更為普遍[5]。高齡女性的卵子mtDNA 4 977 bp片段缺失率及mtDNA突變率明顯高于年輕女性，認為高齡婦女卵子發(fā)育潛能降低與含有更多的缺失mtDNA有關。MtDNA 4 977 bp缺失可以作為卵子老化的標志物[19]。而高齡婦女mtDNA突變率高可能與氧化應激損傷有關，ATP合成減少，影響卵母細胞減數(shù)分裂，形成非整倍體胚胎，從而導致患者反復種植失敗和復發(fā)性流產(chǎn)。棄卵母細胞和棄胚胎中4 977 bp缺失率較高，且與卵母細胞相比，胚胎中的缺失率明顯較低，提示卵母細胞mtDNA 4 977 bp缺失與受精失敗相關[20]。MtDNA與卵巢、卵子功能密切相關，線粒體相關基因突變可能導致原發(fā)性卵巢功能不全[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體D-loop區(qū)域的變異會導致mtDNA復制和轉錄的異常，可影響線粒體呼吸鏈的功能，導致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平升高和不穩(wěn)定，阻礙mtDNA的復制，減少mtDNA含量和線粒體數(shù)量，還可影響編碼OXPHOS相關蛋白mtDNA基因的表達，影響線粒體代謝和氧化呼吸功能，導致細胞內(nèi)ATP含量降低，影響卵子、胚胎質(zhì)量及妊娠結局，認為不孕婦女外周血線粒體D-loop區(qū)突變的增加對IVF臨床結局有預測價值[22]。由此可知，mtDNA突變對卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育具有重要影響。

顆粒細胞中mtDNA是否存在4 977 bp缺失報道不一。有學者發(fā)現(xiàn)人顆粒細胞存在mtDNA 4 977 bp片段缺失，并可導致卵母細胞、胚胎發(fā)育異常及流失等，且與妊娠率呈負相關，與年齡呈正相關[23-24]。38歲以下婦女顆粒細胞mtDNA 4 977 bp片段的缺失率為5/12，而38歲以上婦女缺失率高達100%[25]。但也有研究顯示，不論是否高齡，其卵丘顆粒細胞[26]、壁顆粒細胞[27]均不存在mtDNA 4 977 bp的缺失，這有待于進一步的研究。

4 問題與展望

綜上所述，線粒體是影響卵母細胞質(zhì)量及妊娠結局的重要因素。目前改善卵母細胞質(zhì)量的方法主要是通過線粒體替代療法增加線粒體數(shù)量和使用線粒體營養(yǎng)劑改善線粒體質(zhì)量。改善卵母細胞線粒體質(zhì)量的藥物主要包括：生長激素、輔酶Q10、硫酸脫氫表雄酮等。線粒體替代治療包括線粒體移植、卵胞質(zhì)移植和原核移植等。線粒體異體移植由于引發(fā)的倫理問題已被禁用。自體移植以自體細胞為材料，可避免倫理問題，為改善卵母細胞質(zhì)量提高妊娠率提供了新思考和新方向，逐漸成為近年研究的熱點。目前通過移植來源于顆粒細胞、骨髓干細胞等體細胞的線粒體來改善卵母細胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能已取得一定療效，但其效果及遠期安全性尚待進一步研究證實。來源于體細胞的線粒體具有組織特異性，在不同細胞中的作用并不相同，對促進胚胎發(fā)育的影響有限。線粒體最可靠的替代來源可能是生殖系細胞，尤其未經(jīng)歷有絲分裂后停滯的生殖系干細胞。有學者發(fā)現(xiàn)，移植來自生殖干細胞的線粒體后，卵母細胞質(zhì)量差的受精率有顯著提高[28]，也有研究顯示此技術似乎不能改善卵巢早衰及IVF周期胚胎質(zhì)量差的不孕患者的胚胎質(zhì)量及臨床結局，但該研究樣本量較小，盡管妊娠率相似，但不能得出活產(chǎn)率相關的結論[29]。這些研究為改善卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能開辟了新的思路。所以對卵子及其相關細胞線粒體結構和功能的研究將有助于生殖醫(yī)學的發(fā)展和進步，為臨床解決實際問題提供理論基礎和臨床依據(jù)。