提高免疫組化染色質(zhì)量的經(jīng)驗總結(jié)

秦永亭

（江蘇護理職業(yè)學院，江蘇 淮安 223300）

免疫組化染色技術(shù)是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，利用化學反應將顯色劑標記于特異抗體上，借助于顯微鏡，通過觀察抗原抗體結(jié)合部位從而確定組織細胞結(jié)構(gòu)的一門新技術(shù)[1]。免疫組化染色技術(shù)周期長、程序復雜，任何一個環(huán)節(jié)失誤都可能會導致實驗的失敗。我們在多年實踐過程中，對其方法和步驟進行了一定的改進和優(yōu)化，明顯提高了免疫組化染色的效果，現(xiàn)將經(jīng)驗總結(jié)如下。

1 免疫組化染色不理想的原因

抗原是一類能誘導免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答并產(chǎn)生抗體的物質(zhì)?？贵w是由漿細胞合成和分泌的一種特殊性蛋白質(zhì)，它能夠與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。人體組織中不同的蛋白質(zhì)可能會存在相同的抗原，在應用克隆抗體時可能會存在交叉反應。因此，我們在免疫組化染色過程中應注意此問題，應將交叉反應的不利影響降到最低。

組織在制作過程中，化學試劑可能會封閉抗原，加熱也可能會使抗原的肽鏈發(fā)生扭曲，導致抗原在染色過程中不易顯示出來。因此，在免疫組化染色過程中需要選取合適的方式對抗原進行修復，常用的修復方式有酶修復法、高溫高壓熱修復法、微波加熱修復法等。

在染色過程中，組織固定位置的好壞也影響著實驗結(jié)果。如果組織固定不及時，可能會導致組織溶解、干硬甚至變形。一旦出現(xiàn)組織自溶，則可能會引起抗原的丟失。組織干硬會導致蛋白質(zhì)變性，引起抗原功能的改變，導致染色失敗。

2 實驗過程及注意事項

2.1 試劑準備

所有試劑在未使用時應置于冰箱4℃儲存，而且應定期監(jiān)控冰箱的恒定制冷功能。對于使用頻率較低的試劑，應標明過期時間。批量配置的修復液，應逐次使用，并用標簽做好標記，并做好防霉措施。蒸餾水不宜過早準備，且在制備過程中應避免污染，并且要預防盛蒸餾水的水桶內(nèi)壁長菌和發(fā)霉。

2.2 組織的處理

組織的處理包括固定、脫水、透明、浸蠟等多個環(huán)節(jié)。組織的固定是獲取最佳組織的前提，而且會直接影響免疫組化染色的結(jié)果。選擇合適的固定液，能最大限度地保存好組織細胞的形態(tài)和抗原性，并防止抗原彌散，增強抗原的定位。組織的固定可根據(jù)不同組織選取合適的固定液，淋巴組織可選取B-5固定液，腦組織選用4%的甲醛溶液效果最好。固定時間小標本為4～6小時，大標本為18～24小時。組織固定時間不宜超過24小時，否則由于甲醛和組織蛋白間的交聯(lián)等作用會導致抗原決定簇被覆蓋甚至丟失，從而影響抗原表達活性[2]。此外，為了保證組織固定的效果，固定液的使用量應為組織塊體積的4～10倍。組織脫水也是保證免疫組化染色質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。如果組織脫水不徹底，容易導致組織脫片的現(xiàn)象。為了保證組織脫水的效果，實驗室應定期更換試劑，并做好相應的記錄。

2.3 制片

在制片過程中，皺褶、氣泡、厚薄不一等問題都可導致切片在后期修復、浸洗過程中發(fā)生脫片現(xiàn)象。因此，我們在切片過程中要根據(jù)組織的特點選用最合適的處理方法。例如，對于甲狀腺組織，可采用細削慢切、浸化蠟面、增加展片時間的方法。切片的厚度2～3 um最佳，且應無刀痕、氣泡、皺褶等?？酒臏囟群蜁r間關(guān)系著切片貼附的牢固程度，建議溫度為65℃～68℃，時間為60～90分鐘。對于容易發(fā)生脫片的組織，烤片時間可適當延長，但應避免烤片時間過長?？酒瑴囟炔荒苓^高，否則會對組織造成損傷。同時，烤片溫度也不能過低，如果低于60℃，切片在后面修復和浸洗過程中容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。

2.4 抗原修復

抗原修復是免疫組化染色的關(guān)鍵步驟?？乖迯涂梢允菇M織中抗原決定簇充分暴露，從而增強抗原與抗體的免疫反應。針對不同抗體，應選擇不同的抗原修復方法。目前常用的抗原修復法有高溫高壓熱修復法、酶修復法、微波加熱修復法等。高溫高壓熱修復法因為受熱均勻，易掌握等優(yōu)點，已成為目前使用最廣泛的一種修復方法[3]。當高壓鍋內(nèi)水沸騰后，在高壓閥的作用下，鍋內(nèi)溫度可達130℃。該法通過高壓和高熱使組織在甲醛固定過程中形成的醛鍵發(fā)生斷裂，從而充分暴露抗原的決定簇。一些較難修復的組織完全可以通過此法進行修復，近幾年關(guān)于抗原修復的研究表明此法效果較好。但由于高溫高壓會導致溶液的分子處于高速運動狀態(tài)，因此容易出現(xiàn)組織與玻片分離現(xiàn)象。因此，在暴露抗原決定簇的前提下，可針對不同的抗原選擇不同的修復方法。對于胞質(zhì)或胞膜陽性的抗原，可選擇微波加熱修復法；而對于胞核陽性的抗原，可采用高溫高壓熱修復法[4]。采用高溫高壓對抗原修復時，為了更好地控制時間和鍋內(nèi)溫度，可采用電磁爐進行加熱。鍋內(nèi)溫度控制在130℃左右即可，溫度過低會導致抗原修復效果不佳，溫度過高則容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。

2.5 染色過程

免疫組化染色是一種酶促反應，標有顯色劑（酶、熒光素等）的抗體與抗原結(jié)合后，通過化學反應使顯色劑顯色，從而確定組織細胞中的抗原部位。在染色過程中，如果組織塊固定脫水不充分或切片過厚時，劇烈的洗滌可能會導致組織出現(xiàn)脫片現(xiàn)象[5]。對于此類切片，洗滌要注意輕柔，可將緩沖液順著被抬高的玻片一側(cè)進行沖洗，也可選用浸泡法洗滌，但不能直接沖洗組織。孵育盒內(nèi)應加入少量的蒸餾水，保證切片在整個染色過程中保持濕潤，不會出現(xiàn)干片現(xiàn)象。但加入的蒸餾水不宜過多，否則水蒸氣在盒蓋上會聚成水滴，可能會滴落到切片上。因此，最后加入抗體時，應注意切片上是否有水滴。如果有，應將切片上的水弄干，避免抗體被稀釋影響實驗結(jié)果。

3 結(jié) 論

免疫組化染色技術(shù)是一種程序較復雜的技術(shù)，其中部分環(huán)節(jié)很難把握，容易影響實驗結(jié)果。因此，實驗人員應嚴格執(zhí)行標準化實驗步驟，深入掌握每一步驟的技術(shù)原理，認真對待每一個細節(jié)處理，遇到問題及時分析原因，總結(jié)經(jīng)驗，從而不斷提高免疫組化染色的質(zhì)量。