線粒體鐵蛋白和年齡相關(guān)性黃斑變性的研究進展

許致玉，董 晶，張 璐

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性 (age-related macular degeneration, ARMD)又稱老年性黃斑變性，是一種與年齡相關(guān)的致盲性退行性眼底病變。歐盟2015年大約有6700萬人受到任何ARMD的影響，并且由于人口老齡化，這一數(shù)字預(yù)計到2050年將增加15%[1]。隨著我國人口老齡化社會的到來,發(fā)病人數(shù)將逐年增加。由于ARMD的發(fā)病機制復(fù)雜，目前對于ARMD的治療發(fā)展并不完善，因此ARMD的治療效果并不能讓廣大患者感到滿意。線粒體鐵蛋白(mitochondrial ferritin，F(xiàn)TMT)是一個組織表達受限蛋白,僅表達于心臟、睪丸、腦和呼吸活動活躍的組織。進一步研究發(fā)現(xiàn),FTMT同樣具有鐵離子平衡和抗氧化功能。目前，已有越來越多的學(xué)者開始關(guān)注FTMT在ARMD中的發(fā)生、發(fā)展及作用機制。

1 FTMT

FTMT是一種新近發(fā)現(xiàn)的位于線粒體內(nèi)的鐵儲存蛋白。在體內(nèi)鐵代謝及調(diào)節(jié)中，F(xiàn)TMT起著重要作用。它是一種前體，以線粒體為目標，然后加工成一種功能蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于細胞質(zhì)中的鐵蛋白。與胞質(zhì)性鐵蛋白一樣，F(xiàn)TMT在體內(nèi)和體外都含有鐵，這與其保守的鐵氧化酶中心一致。與其不同的是，F(xiàn)TMT的成熟功能形式只分布于線粒體內(nèi)，并且FTMT的分布局限于特定的組織或者器官中；主要分布于睪丸、脊髓神經(jīng)炎、視網(wǎng)膜、心臟和胸腺等，不存在于肝臟或者脾臟等主要的鐵儲存器官中。FTMT可以將細胞外和胞漿內(nèi)的鐵離子以三價鐵的形式儲存在線粒體中，由此可以減少由二價鐵離子引起的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，但是FTMT的mRNA序列中，不含鐵調(diào)控元件序列，這意味著其表達不受鐵的調(diào)控。由于對鐵的獲取作用，體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平進一步被FTMT所抑制，在退行性神經(jīng)疾病中起到保護作用[2]。在一些免疫組化中顯示，F(xiàn)TMT表達于視網(wǎng)膜，并且表達量會隨著鐵的水平變化而改變(呈正相關(guān))[3]。

FTMT是一種鐵螯合蛋白，在具有高代謝活性和氧消耗的細胞類型(包括人類視網(wǎng)膜)中表達，提示其在保護線粒體免受鐵依賴性氧化損傷中起作用。此外，在一些ARMD患者中發(fā)現(xiàn)了FTMT基因的突變，這可能導(dǎo)致FTMT基因的缺失[4]。然而，F(xiàn)TMT已顯示出保護線粒體免受鐵細胞介導(dǎo)的毒性作用，從而延遲ARMD的進程。

2 ARMD

ARMD是黃斑區(qū)的退行性病變。主要表現(xiàn)為視物變形、中心暗點以及對比度下降等，患者多為50歲以上,隨著年齡增長發(fā)病率增加。一般表現(xiàn)為雙眼先后發(fā)病或同時發(fā)病，并且進行性損害視力，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量。有學(xué)者研究表明，在全球50歲以上的中國人群中，早期和晚期ARMD的總合并患病率分別為4.9%和0.7%[5]。

ARMD根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理改變的不同分為兩型：(1)萎縮型ARMD，或稱為非滲出型ARMD,或干性ARMD；(2) 滲出型ARMD，或稱為濕性ARMD。其中最常見的為干性ARMD，占ARMD患者中的80%～90%。臨床上，兩型病變的病程、眼底表現(xiàn)、治療和預(yù)后各異。干性ARMD患者一般起病緩慢，患者視力漸進性減退，視網(wǎng)膜外層、色素上皮層、Bruch膜、脈絡(luò)膜毛細血管等各層逐步萎縮、變性，眼底可見大小不一的玻璃膜疣，晚期可見到裸露的脈絡(luò)膜大血管。濕性ARMD患者臨床表現(xiàn)為突然單眼的視力下降，部分可見典型的新生血管或者黃斑區(qū)盤狀瘢痕[6]。目前臨床上公認的用于治療濕性ARMD的方法為抗VEGF治療，通常采用將可結(jié)合VEGF的特異性抗體通過球內(nèi)注射的方式給藥，臨床效果顯著。但是該藥藥物效果難以持續(xù)，并且費用昂貴，大大增加了治療的成本，使絕大多數(shù)中低收入患者群體難以維系治療。

由于ARMD的發(fā)病機制和進展機制復(fù)雜，因此很難找到病因，并且難以運用干預(yù)手段來治療疾病。它可能與遺傳因素、環(huán)境影響、慢性視網(wǎng)膜光損傷、營養(yǎng)不良、代謝紊亂等有關(guān)。但是氧化應(yīng)激和自由基損傷已被確定為ARMD的危險因素。下面將探討FTMT對ARMD的影響。

3 FTMT通過穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1α影響ARMD

低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是20世紀90年代發(fā)現(xiàn)的一種依賴于氧的轉(zhuǎn)錄因子。HIF最初是在人肝癌細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)并表征的，其影響促紅細胞生成素基因的轉(zhuǎn)錄。后有研究表明，HIF亞型HIF-1在ARMD患者脈絡(luò)膜新生血管膜中同樣存在。由于人視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的產(chǎn)生受HIF調(diào)控，任何對HIF和PAS蛋白結(jié)構(gòu)域抑制功能的干擾都會影響眼睛的氧化應(yīng)激、炎癥和脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的生成[7]。

CNV的發(fā)展是對ARMD患者快速永久性視力喪失的最重要威脅。各種臨床研究表明，隨著年齡的增長，視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells，RPE)，Bruch膜和絨毛膜的變化會導(dǎo)致氧向神經(jīng)視網(wǎng)膜中的視桿和視錐的擴散減少。因此，通過刺激RPE細胞中VEGF的過表達導(dǎo)致外部視網(wǎng)膜缺氧被認為是CNV形成的最重要驅(qū)動因素之一[8]。一旦擾亂了血管生成刺激劑和抑制劑之間的局部平衡，便可能發(fā)生CNV。VEGF是CNV的主要刺激因子，Zhao等[9]研究表明RPE細胞過度表達VEGF可誘導(dǎo)CNV的發(fā)生，而抑制RPE細胞中VEGF的表達則抑制新生血管的形成。HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活可上調(diào)RPE細胞和一般RPE細胞中VEGF的表達。因此，它是觸發(fā)CNV形成的中心分子[10]。因此，HIF是治療滲出性ARMD的一個有趣的治療靶點。

Wang等[11]發(fā)現(xiàn)小鼠RPE中的FTMT和HIF-1α與年齡相關(guān)性是有聯(lián)系的。他們通過Western blotting和免疫熒光法比較了幼齡和老年小鼠RPE和絡(luò)膜中FTMT蛋白的水平。控制研究進行了評估的特異性FTMT抗體。結(jié)果顯示，與3mo大的小鼠相比，使用RPE和脈絡(luò)膜勻漿的Western印跡顯示20mo大的小鼠的FTMT和HIF-1α蛋白水平顯著升高。免疫組織化學(xué)顯示，20mo大小鼠的神經(jīng)節(jié)細胞(ganglion cells，GCS)，外神經(jīng)叢層(outer plexiform layer，OPL)和內(nèi)部節(jié)段(inner segment，IS)主要被FTMT染色。在20mo時，染色強度增加。特別是，RPE和外部脈絡(luò)膜節(jié)段被強烈染色。所以，小鼠RPE中FTMT和HIF-1α水平隨著年齡的增長而升高。

與此同時，該實驗還證明FTMT穩(wěn)定了HIF-1α并上調(diào)了VEGF的表達。研究者在人視網(wǎng)膜上皮細胞(ARPE-19細胞)中過表達FTMT 。 Western印跡結(jié)果顯示，在正常缺氧條件下，F(xiàn)TMT過表達的ARPE-19細胞中的HIF -1α蛋白水平顯著增加。在低氧條件下(1%O2)HIF-1 α蛋白水平高于未處理的細胞。FTMT過表達顯著增加了VEGF的分泌，而這種增加被HIF-1 α修飾因子所消除，表明FTMT過表達時VEGF的上調(diào)是依賴于HIF-1α的[8]。因此，增高的氧化應(yīng)激水平影響著FTMT在ARMD患者中的表達，并且HIF-1α調(diào)節(jié)FTMT來控制ARMD的發(fā)展。

4 FTMT基因突變影響ARMD

胞質(zhì)鐵主要完成了鐵在細胞中的儲存，是一條24亞基(重-h和輕-l鏈)的雜合聚蛋白。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的功能性鐵蛋白基因有三個，分別是：11號染色體上183個氨基酸編碼的胞質(zhì)重鏈(h鏈)； 19號染色體上175個氨基酸編碼的胞質(zhì)輕鏈(l鏈)和5號染色體上的無內(nèi)含子基因編碼的FTMT，并表達為前體，在轉(zhuǎn)移到線粒體基質(zhì)后被加工成成熟蛋白[7]。

在人類中，F(xiàn)TMT在睪丸、大腦和視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)表達， FTMT的表達影響細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，使鐵進入線粒體，F(xiàn)TMT通過氧化潛在的有毒亞鐵并且消耗活性氧(reactive oxygen species，ROS)，保護HeLa細胞免受氧化損傷[12]。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TMT的主要功能是通過調(diào)節(jié)線粒體不穩(wěn)定鐵池和ROS的產(chǎn)生，以防止氧化損傷[12]，并提示FTMT在線粒體中對鐵依賴毒性具有保護作用。FTMT功能在以細胞鐵超載和線粒體衰退引起的鐵代謝紊亂為特征的病理中可能特別重要[13]。最近，在一些ARMD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)FTMT的基因突變，而該突變可造成FTMT功能的缺失[14]。

Stefania等[4]對一組ARMD患者的FTMT基因進行了突變掃描，以評估其可能對ARMD表型的發(fā)病機制或調(diào)節(jié)的研究貢獻。到目前為止，F(xiàn)TMT基因中的一些雜合取代物已經(jīng)在與細胞或FTMT表達或腦鐵水平改變相關(guān)的疾病患者中被發(fā)現(xiàn)[15]。他們從一個被發(fā)現(xiàn)攜帶一個之前從未報道的FTMT基因突變的老年白人女性的血液中進行FTMT基因的采集及提取，從EDTA抗凝血中提取DNA中通過變性高效液相色譜和自動測序進行分析，短擴增產(chǎn)生的缺失片段經(jīng)電泳分離后洗脫，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)程序?qū)艚游稽c進行預(yù)測，通過鐵蛋白重組、變性復(fù)性實驗以獲得共組裝的24序列堿基，通過免疫學(xué)方法將FTMT抗體孵育，進行基因結(jié)果的分析。結(jié)果顯示，50例意大利ARMD患者的FTMT基因掃描顯示，只有1例ARMD患者的FTMT2基因洗脫譜發(fā)生了改變。該突變包括一個14bp的缺失和一個2bp的插入。研究者評估了變異FTMT是否會通過干擾野生型FTMT的組裝而產(chǎn)生主導(dǎo)的負面影響。并進行了變性-再變性實驗，將恒定量的變性野生型FTMT與不同量的變性變體混合并再變性。通過蛋白質(zhì)帶密度定量分析發(fā)現(xiàn)，不斷增加的變異亞基并不影響野生型FTMT的重新折疊特性。因此，該變體的顯性負面效應(yīng)的缺失使得野生型FTMT的正確組裝成為可能。這些結(jié)果表明，突變可能導(dǎo)致FTMT的功能改變，而該功能改變可能是ARMD的病因之一。

因此，可以假設(shè)鐵蛋白基因的野生型等位基因的存在可能足以補償功能蛋白的量。然而，在視網(wǎng)膜這個特別暴露于氧化應(yīng)激的組織中，F(xiàn)TMT的減少可能增強了線粒體對鐵介導(dǎo)的氧化損傷，從長遠來看可能與ARMD病理的發(fā)展有關(guān)。因此，該患者的FTMT基因突變的發(fā)現(xiàn)，不僅為臨床治療提供新的思路，它們還為探索ARMD的發(fā)展機制提供了新的線索，并可能成為研究結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和闡明相應(yīng)蛋白中尚不明確的功能的有趣實驗試劑。

5 FTMT保護ARMD免受氧化應(yīng)激

在ARMD中，鐵可能作為自由基損傷的來源發(fā)揮作用。對于許多參與細胞代謝的許多蛋白質(zhì)和酶來說(包括氧氣運輸、呼吸鏈電子轉(zhuǎn)移、DNA合成和膜生物發(fā)生)，鐵是一種必要的輔助因子。在視網(wǎng)膜中，鐵被脂肪酸去飽和酶所利用，該酶參與膜的生物發(fā)生。RPE和神經(jīng)視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)是參與鐵運輸?shù)莫毩⒀阂暰W(wǎng)膜屏障。循環(huán)鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白復(fù)合物結(jié)合細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TFR)，鐵被吸收到細胞中，然后通過血-視網(wǎng)膜屏障轉(zhuǎn)運到視網(wǎng)膜[16-17]。在與年齡有關(guān)的眼疾研究中，一項大型的多中心，隨機對照的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，飲食中添加抗氧化劑和鋅可顯著降低進展為晚期ARMD的進程。盡管研究表明ARMD的發(fā)病機制可能與氧化應(yīng)激相關(guān)，但是自由基的來源還需進一步研究[18]。

Gao等[19]實驗證明FTMT的水平不會因外源性鐵而升高。但是當轉(zhuǎn)染增加時，F(xiàn)TMT保留了高比例的鐵，細胞顯示出缺鐵的跡象。所以研究者得出結(jié)論：鐵對FTMT的潛在易得性與對胞質(zhì)鐵蛋白的易得性相同，而對FTMT 水平的控制可能為調(diào)節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)提供了一種強有力的方法。所以FTMT被證明可以顯著調(diào)節(jié)細胞鐵代謝，進而進一步影響著ARMD的發(fā)生與發(fā)展。FTMT保護線粒體免受氧化損傷的研究已經(jīng)在其他疾病中取得了一些成就。FTMT過表達可以保護6-羥多巴胺誘導(dǎo)的多巴胺能損傷，可能在帕金森病中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。Shi等[20]發(fā)現(xiàn)了FTMT對過氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞損傷的作用，F(xiàn)TMT的過表達顯著保護了神經(jīng)母細胞瘤免受過氧化氫誘導(dǎo)的凋亡，這是由于FTMT對細胞內(nèi)ROS的增加和MMP的降低的限制作用，從而保護了細胞免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡。

對于FTMT保護線粒體免受氧化應(yīng)激與ARMD相關(guān)的研究中，我們發(fā)現(xiàn)FTMT的抗氧化應(yīng)激作用可能是由于鐵離子的調(diào)節(jié)以及通過芬頓反應(yīng)減少超氧自由基的產(chǎn)物所致，從而減少氧化應(yīng)激的損害。最近，研究了一些FTMT基因被敲除的小鼠，但是，關(guān)于視網(wǎng)膜中缺乏FTMT的影響還需進一步研究。

6小結(jié)

ARMD是一種復(fù)雜的多因素疾病，具有人口、環(huán)境和遺傳方面的危險因素;然而，即使近年來進行了大量的研究，其發(fā)病機制仍大部分未知。對于FTMT的研究，從分子生物學(xué)的角度探究FTMT在RPE細胞的蛋白質(zhì)功能，闡釋其在ARMD發(fā)病和疾病進展中的作用。借此增進對該疾病的病理生理機制的認識，以求更有效的治療ARMD的方法。FTMT作為一種儲存性鐵蛋白，目前的研究主要集中在神經(jīng)功能退行性疾病中，對于眼科相關(guān)研究處于起步階段?，F(xiàn)今以及未來的研究將從根本上回歸疾病的本質(zhì)，尋求疾病的致病原因，以期從根本上找到治療和干預(yù)ARMD發(fā)生的靶點。盡管目前對于ARMD與FTMT關(guān)系的研究較少，但是它已經(jīng)展示出了廣闊的應(yīng)用前景。我們希望未來能夠探索出更多的發(fā)展機制，為預(yù)防甚至降低ARMD的發(fā)生率做出更大的貢獻。