耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥機制及實驗室檢測研究進展

孫 艷 綜述,多麗波審校

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，黑龍江哈爾濱 150086)

腸桿菌科細菌是社區(qū)和醫(yī)院感染中的常見病原菌之一，20世紀80年代以來，碳青霉烯類抗菌藥物一直被認為是對抗產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶腸桿菌感染的最有效手段，但近年來臨床上抗菌藥物的過度使用導致耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)的產生，并在全球范圍內呈廣泛流行的趨勢。2017年中國細菌耐藥監(jiān)測數據顯示，腸桿菌科細菌對3種碳青霉烯類藥物的耐藥率已接近10.0%，而肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率已上升至20.9%和24.0%[1]?？寺鞑ゼ巴ㄟ^質粒介導的傳播使CRE感染發(fā)病率持續(xù)升高，進而使臨床上應用抗感染藥物治療的困難逐年上升。CRE耐藥機制主要包括以下幾個方面：(1)產碳青霉烯酶；(2)外膜蛋白的缺失或合并產AmpC酶或ESBLs；(3)青霉素結合蛋白對碳青霉烯類藥物親和力下降；(4)藥物外排泵高度表達。研究CRE的耐藥機制及實驗室早期檢測對臨床上治療其感染具有重要指導意義。

1 CRE定義

2015年美國疾病控制中心(CDC)對CRE定義為對任意一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，或產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。此外，對亞胺培南天然非敏感的細菌，如摩根摩根菌、變形桿菌、普羅威登斯菌，需對其他碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。

2 CRE耐藥機制

2.1產碳青霉烯酶 產碳青霉烯酶是腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥的最重要機制。根據Ambler分類，碳青霉烯酶主要分為A、B和D類。其中A類碳青霉烯酶和D類碳青霉烯酶屬絲氨酸酶，主要通過水解絲氨酸活性位點使藥物失活；B類碳青霉烯酶又叫金屬酶，其活性中心需結合金屬鋅離子才能發(fā)揮催化活性。

2.1.1A類碳青霉烯酶 至今發(fā)現腸桿菌科細菌產生的A類碳青霉烯酶包括KPC、GES、IMI、SME及SFC等，最常見的是KPC，其他酶在我國相關報道尚少，在其他國家腸桿菌科細菌中有檢出或流行。A類碳青霉烯酶可水解幾乎所有β-內酰胺類藥物，包括碳青霉烯類藥物、青霉素類藥物、氨曲南，其活性可被含酶抑制劑部分抑制，被硼酸完全抑制，不能被乙二胺四乙酸抑制。

肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPCs)是A類碳青霉烯酶中最重要的酶，由質粒編碼，既可通過克隆菌株垂直傳播，也可通過遺傳性移動元件如轉座子、質粒等水平傳播，KPCs可水解所有β-內酰胺類藥物，產KPCs型CRE僅對替加環(huán)素、多黏菌素及氨基糖苷類抗菌藥物敏感?，F已發(fā)現22種KPCs[2]，各種KPCs顯示出高度同源性，并通過非同義突變而不同，KPC-2和KPC-3在全球范圍內最常見，我國華東地區(qū)KPC-2檢出率較高，而在我國臺灣KPC-2及KPC-17檢出率較高。

含有不同質粒，但具有相同遺傳結構的不同克隆Tn4401被認為是blaKPC在世界范圍內廣泛傳播的起源。有研究發(fā)現，blaKPC-2位于Tn4401轉座子上，其上游為Tn4401-tnpR、Tn4401-tnpA、ISKpn7序列,下游為ISKpn6序列[3]。與上述研究不同，2014年，LUO等[4]通過對從北京某醫(yī)院獲得的12株CRE攜帶的blaKPC-2遺傳背景研究發(fā)現，blaKPC-2位于基于轉座子Tn3和部分Tn4401區(qū)段的整合結構上，其中ISKpn8代替了ISKpn7。

2.1.2B類碳青霉烯酶 B類碳青霉烯酶為金屬酶，主要包括5種：VIM、IMP、NDM、GIM和SPM，最常見的是IMP、NDM、VIM。B類碳青霉烯酶能水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類藥物，不能水解氨曲南，可被乙二胺四乙酸抑制而不受含酶抑制劑的影響。

2010年，在印度發(fā)現的NDM-1引起廣泛關注，產NDM-1細菌對除替加環(huán)素與多黏菌素之外的抗菌藥物均耐藥，部分細菌甚至表現為泛耐藥。GRUBER等[5]通過建立體內感染產NDM-1黏質沙雷菌小鼠模型，證明產NDM-1菌不僅廣泛耐藥，其半數致死量比非產NDM-1菌高出許多。NDM-1主要流行于印度、巴基斯坦等南亞國家，跨境旅行是NDM-1在國際間傳播的重要原因，而國內報道的NDM-1案例多無國外旅居史，因此，我國被認為是繼印第安次大陸和巴爾干半島之后的第三大NDM傳播源。目前，已發(fā)現24種NDM，在腸桿菌科細菌中檢出21種，主要由肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌產生。與NDM-1相比，各亞型通過單個或多個氨基酸的替換而不同，進而酶穩(wěn)定性和活性也不同，NDM-4、NDM-5及NDM-7的水解活性強于NDM-1[6]。blaNDM-1位于轉座子Tn125上兩個插入序列ISAba125之間，Tn125能促進blaNDM-1表達而增強菌株對碳青霉烯類藥物的水解活性，blaNDM-1下游存在bleMBL基因，能夠穩(wěn)定NDM-1基因，其他變異型中也存在兩種序列，表明遺傳環(huán)境并未發(fā)生變化。

VIM是金屬酶中水解碳青霉烯類藥物能力最強的酶，2003年，MIRIAGOU等[7]從希臘1例患者尿液標本中分離的大腸埃希菌檢出VIM-1，隨后，VIM在意大利、法國和俄羅斯等歐洲國家均有檢出，主要由肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌產生，blaVIM常定位于Ⅰ類整合子。目前，發(fā)現至少46種VIM，VIM-2在全球最常見，2013年，我國WEI等[8]首次從蕪湖一家醫(yī)院分離的弗氏檸檬酸桿菌中檢出VIM-4。

IMP-1首次發(fā)現于日本黏質沙雷菌的整合子上，之后日本廣泛傳播產IMP-1型CRE。目前至少檢出52種IMP，主要分布在日本、巴西等國家，國內IMP-4和IMP-8較常見，且相繼在上海、湖北、廣東和臺灣等地有檢出。

2.1.3D類碳青霉烯酶 D類碳青霉烯酶又稱苯唑西林酶(OXA)，對青霉素類藥物水解作用強而水解碳青霉烯類藥物弱，不能水解超廣譜頭孢菌素類藥物，不被克拉維酸和乙二胺四乙酸抑制，常合并其他耐藥機制而增強菌株耐藥性：如合并其他產碳青霉烯酶表達，外膜蛋白改變，由作為啟動子的IS元件介導的轉錄增加，基因拷貝數增加，以及外排泵作用。

目前，發(fā)現D類碳青霉烯酶400余種，腸桿菌科細菌最常見為OXA-48及亞型。OXA-48最初于2004年在土耳其分離的CRKP中被報道[9]，隨后在包括黎巴嫩、突尼斯、埃及及摩洛哥等許多環(huán)地中海國家相繼被分離并報道。2013年美國首次報道了兩株攜帶OXA-48的CRKP之后，在美國OXA-48檢出率逐年上升[10]。國內產OXA-48腸桿菌科細菌的傳播和暴發(fā)報道較少，目前，在我國臺灣、北京及浙江等地有報道，2015年，MA等[11]首次報道了分離自我國臺灣地區(qū)的4株攜帶OXA-48的CRKP。2016年，GUO等[12]報道了產OXA-48肺炎克雷伯菌在北京一家醫(yī)院呼吸科的暴發(fā)。

blaOXA-48攜帶于60×103大小的InCl/M型接合質粒(JN626286)的Tn1999復合轉座子上兩個插入序列IS1999之間，其下游是可編碼調節(jié)蛋白的lysR基因。意大利學者GIANI等[13]通過對大腸埃希菌攜帶的blaOXA-48基因結構分析，發(fā)現轉座子Tn1999的變異亞型Tn1999.2(JN714122)于blaOXA-48上游插入了IS1R元件，而Tn1999.3(HE617182)則在blaOXA-48上下游均有IS1R元件插入，IS1R可充分激活blaOXA-48，使blaOXA-48過度表達。

除OXA-48還發(fā)現多種亞型，最常見的是OXA-181，其次包括OXA-162、-204、-232、-244、-245、-370、-436、-438和-484，以及不水解或弱水解碳青霉烯類藥物的OXA-163、-247和-405。

2.2外膜蛋白的缺失或合并產AmpC酶或ESBLs 細菌耐藥機制之一是產生外膜屏障，即通過改變膜孔蛋白結構使其與抗菌藥物的結合降低。2012年，FINDLAY等[14]對1株產CTX-M-15肺炎克雷伯菌進行研究，通過十二烷基硫酸鈉-脈沖場凝膠電泳(SDS-PFGE)發(fā)現該菌缺乏OmpK35及OmpK36，且顯示對美羅培南耐藥，最小抑菌濃度(MIC)值為8 μmol/L。2013年，我國學者SHI等[15]報道了產DHA-1型AmpC酶合并OmpK36蛋白缺失的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥，但該菌不產碳青霉烯酶。以上研究表明，外膜蛋白缺失或合并產AmpC酶或ESBLs可介導腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物的耐藥。

2.3青霉素結合蛋白(PBP)對碳青霉烯類藥物親和力下降 碳青霉烯類藥物可與細菌內膜表面的PBP結合，如PBP2和PBP3，破壞細胞壁合成，使細菌溶解。2013年，有學者通過將大腸埃希菌的MutS及toiC基因敲除，構建了1株PBP2高突變率，且無外排泵活性的大腸埃希菌(ΔmutSΔtolC)，發(fā)現PBP2不同位置的突變可導致菌株對不同類型的碳青霉烯類藥物耐藥[16]。另有研究發(fā)現，編碼PBP2和PBP3的基因mrdA和基因fstⅠ的突變可分別導致PBP2和PBP3對美羅培南和厄他培南的親和力下降，進而增強菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥性[17]。

2.4藥物外排泵的高度表達 外排泵過度表達與CRE的產生密切相關。我國臺灣YANG等[18]曾報道，通過抑制外排泵AcrAB-TolC的活性，可使陰溝腸桿菌對厄他培南敏感性增加。巴西ROSA等[19]從耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌中檢出AcrAR基因，而在耐碳青霉烯類產氣腸桿菌未檢出該基因，但通過加入泵抑制劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)，證明外排泵活性存在，表明存在其他未知的外排泵。

3 CRE的實驗室檢測

由CRE引起的感染流行是全球健康問題，早期檢測CRE對指導臨床抗菌治療及控制感染具有重要意義。目前，可用于碳青霉烯酶的檢測方法主要包括表型檢測、分子技術及免疫層析法。

3.1表型檢測方法

3.1.1改良霍奇試驗(MHT)及相關試驗 將指示菌與待測菌共同孵育，結果指示菌在待測菌接種線與抑菌環(huán)相交處出現增強生長，即判斷為MHT陽性。MHT檢測A類碳青霉烯酶和D類碳青霉烯類酶的靈敏度及特異度均超過90%，但檢測NDM的靈敏度低于50%。2016年PASTERAN等[20]在此基礎上進行改良，通過加入非離子表面活性劑Triton X-100(可釋放固定于膜上的脂蛋白-NDM)，對145株產酶株和40株非產酶株進行研究，檢測NDM的靈敏度高達90%。但若存在其他耐藥機制(如產ESBLs或產AmpC酶聯(lián)合膜孔蛋白缺失)，MHT會出現假陽性，TAKAYAMA等[21]發(fā)現通過加入氯唑西林可消除假陽性。MHT所用試劑價格便宜，操作簡便，2010年美國和臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦MHT為CRE的表型確證試驗，但其耗時長，難以解釋某些結果，不能區(qū)分酶類型，2018年已從CLSI M100-S28文件中刪除。

3.1.2Carba NP(CNP)試驗及相關試驗 CNP試驗原理是碳青霉烯酶水解β-內酰胺酶，使pH下降，指示劑酚紅由紅色變?yōu)辄S色。其對A類碳青霉烯酶及B類碳青霉烯酶檢測的靈敏度及特異度高達100.0%和94.4%，但對OXA-48的檢測靈敏度低于75.0%。隨后，研究者對CNP試驗進行系列改進，聯(lián)合他唑巴坦及乙二胺四乙酸開發(fā)的CNP Ⅱ試驗可區(qū)分產碳青霉烯酶類型，且靈敏度及特異度均為100.0%[22]。改良的BYG Carba試驗通過檢測電化學信號判斷結果，使結果更具有客觀性，且檢測OXA-48的靈敏度高達93.2%[23]。CNP試驗快速、準確，2015年CLSI M100-S25文件推薦其為檢測CRE的表型確證試驗，用于流行病學和醫(yī)院感染的監(jiān)控。但CNP試驗操作繁雜，需特殊試劑，不適合在常規(guī)實驗室開展。

3.1.3碳青霉烯滅活試驗(CIM)及相關試驗 CIM首次由VAN DER ZWALUW等[24]報道，其原理是將浸泡過待測菌液的美羅培南紙片與標準菌共同培養(yǎng)，通過抑菌環(huán)大小來判定產酶與否，且該研究報道檢測CRE的結果與PCR一致。隨后,改良碳青霉烯類失活法(mCIM)試驗出現，用營養(yǎng)肉湯代替水制備菌懸液，并延長孵育時間，檢測CRE靈敏度更高。eCIM加入金屬酶抑制劑乙二胺四乙酸，其與mCIM聯(lián)合應用可初步區(qū)分絲氨酸酶與金屬酶，2018年CLSI推薦二者聯(lián)合使用作為鑒定產金屬β-內酰胺酶(MBL)腸桿菌科細菌的方法。CIM操作簡單，價格低廉，試劑易獲得，目前已在微生物實驗室開展應用。

3.1.4流式細胞術(FC) FC是一種快速、準確分析細胞結構及其功能參數的高通量技術，近年來，FC被應用于CRE的檢測。FC原理是藥物作用于細菌，細胞膜通透性改變，利用熒光染料染色，通過FC測得熒光強度的變化而反映藥物的抗菌活性。2016年，SILVA等[25]通過加入一種細胞膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料DiBAC4(3)，并結合不同產碳青霉烯酶抑制劑，建立了一種基于FC可區(qū)分不同類型產碳青霉烯酶的表型檢測方法，其檢測CRE靈敏度及特異度均為100.0%。FC具有可定量分析、簡便、耗時短等優(yōu)點，但其所需設備昂貴，未在常規(guī)實驗室開展。

3.1.5基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS) 近年來，MALDI-TOF-MS廣泛應用于檢測細菌耐藥性，其原理是將待檢菌與抗菌藥物共同孵育，通過MALDI-TOF-MS檢測抗菌藥物水解或脫羧產物相對于其原始相對分子質量的變化，判斷是否產生水解該抗菌藥物的酶。2015年，LASSERRE等[26]以亞胺培南作為反應底物，以亞胺培南與其產物峰面積的比值定義產酶株，檢測結果靈敏度為99.0%，特異度為100.0%。由于OXA類酶水解活性弱，采用MALDI-TOF-MS檢測OXA類酶的靈敏度僅為76.0%，PAPAGIANNITSIS等[27]加入NH4HCO3，將反應液pH調至7.0，使MALDI-TOF-MS檢測OXA-48的靈敏度達98.0%。MALDI-TOF-MS是一種快速、低成本、高通量的CRE檢測方法，但其只能檢測產酶CRE，且質譜儀價格昂貴，方法尚未標準化。

3.2分子檢測方法 上述表型檢測方法均不能確定CHLBs基因型，結果仍需分子檢測技術確證基因型。傳統(tǒng)PCR實驗耗時長、效率低，且產物易污染，基于PCR，臨床上開發(fā)了更為快速、高效、準確的分子檢測方法。

3.2.1環(huán)介導等溫擴增法(LAMP) LAMP檢測原理為針對靶基因上的6個區(qū)域設計4條引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下擴增，通過觀察白色沉淀判斷靶基因的存在。CHENG等[28]利用Bst聚合酶擴增基因，以SYBR為指示劑檢測CHLBs基因(NDM、KPC、IMP及VIM)，結果與傳統(tǒng)PCR完全一致?；贚AMP的試劑盒也相繼開發(fā)，eazyplexw?SuperBug CRE系統(tǒng)有很高的通用性和準確性，可快速檢測含有各種CHLBs耐藥決定簇的菌株，該系統(tǒng)可檢測的基因型包括VIM(1-37)、NDM(1-7)、KPC(2-15)、OXA-48家族(OXA-48、-162、-204和-244)、CTX-M-1及CTX-M-9 ESBL家族[29]。

3.2.2二代測序(NGS) NGS即高通量測序，是一種全基因組測序，具有高輸出量和高解析度的特性，可提供豐富的遺傳學信息，KHONG等[30]利用NGS對33株CRE測序，發(fā)現一種新型NDM質粒-pSg1-NDM，表明NGS可檢出突變或新型基因型。NGS還可檢測整合子和轉座子等，發(fā)現其他耐藥機制如外膜蛋白缺失，外排泵過度表達等。NGS可同時完成菌株流行病學和耐藥機制的研究，對院內感染控制提供指導，但NGS成本高，需專業(yè)技術及設備，未能得到廣泛應用。

3.3免疫學方法 最近發(fā)展起來的一種抗體介導的檢測產碳青霉烯酶的免疫分析方法，利用CHLBs免疫小鼠獲得單克隆抗體，進而通過抗原抗體特異反應檢測待測菌，基于此原理開發(fā)的試劑盒Carba5可同時檢測5種產碳青霉烯酶，包括：NDM-1(-4、-5、-6、-7、-9)、KPC-2(-3)、IMP-1(-8、-11)、OXA-48(-162、-181、-204、-232、-244、-517、-519、-535)及VIM-1(-2、-4、-19)，特異度和靈敏度均為100.0%[31]。Carba5可直接檢測單個菌落、尿液標本或血培養(yǎng)標本，檢測下限為106CFU/mL，快速(15 min)，易于實施，可在常規(guī)實驗室中進行，但此方法只能檢測產酶CRE。

4 結 語

近幾十年來，CRE在世界范圍內廣泛傳播，對人類健康構成巨大威脅。質粒介導的碳青霉烯酶基因的水平傳播是CRE流行激增的主要原因，目前常見的產碳青霉烯酶為KPC、VIM、NDM、IMP和OXA家族，國內以KPC、NDM及IMP為主，OXA-48報道尚少，但也有零星報道及暴發(fā)流行[11-12]，應引起重視。另外，產酶菌株已從產單一碳青霉烯酶發(fā)展到產多種碳青霉烯酶，研究發(fā)現同時產多種產碳青霉烯酶會增加菌株耐藥性，進而增加臨床用藥難度。面對CRE的快速傳播，實驗室應根據本地區(qū)CRE流行特點，選擇高靈敏度及高特異度的檢測方法對CRE早期檢測，以期在一定程度上控制CRE的感染和流行，同時，對CRE耐藥機制的深入研究將有助于指導臨床合理用藥及新型藥物的研發(fā)。