細(xì)菌素療法在抗感染領(lǐng)域的研究進(jìn)展

胡杏，張紅霞，張波，王睿，王瑾，蔡蕓,*

(1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；3 中國人民解放軍空軍總醫(yī)院，北京 100853；4 中國人民解放軍總醫(yī)院藥物臨床研究中心，北京 100853)

青霉素等傳統(tǒng)抗菌藥物的應(yīng)用，一度使由細(xì)菌感染所致的疾病得到良好控制。但隨著細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，使細(xì)菌感染性疾病的治療面臨更多困難。臨床上合理應(yīng)用抗菌藥物可延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，但不能從根本上解決傳統(tǒng)抗菌藥物耐藥問題，故尋找其有效替代品有望從根本上解決問題。

細(xì)菌素是具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)，在自然界中廣泛存在，作為細(xì)菌的先天防御機(jī)制之一，大多數(shù)細(xì)菌[1]能合成至少一種細(xì)菌素。乳酸鏈球菌素(nisin)是研究得最廣、最深入的細(xì)菌素，可以抑制很多食源性致病菌和腐敗菌，已廣泛用于食品防腐，并且是唯一進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素[2]。細(xì)菌素有獨(dú)特的抗菌機(jī)制，且有低毒或無毒、無抗藥性、高效、耐酸、熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)，逐漸引起了越來越多的關(guān)注和研究。

1 細(xì)菌素的定義和特點(diǎn)

細(xì)菌素最早被發(fā)現(xiàn)于1925年。目前認(rèn)為，細(xì)菌素是指由革蘭陽性菌和革蘭陰性菌經(jīng)核糖體途徑合成的、具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)[3]。革蘭陽性菌是主要的產(chǎn)生菌，目前已知的細(xì)菌素主要由乳酸桿菌產(chǎn)生，除此之外，芽孢桿菌也是重要的生產(chǎn)菌。

細(xì)菌素的一些特點(diǎn)，決定了其有望在臨床抗感染領(lǐng)域發(fā)揮一定的作用。首先，在人體安全性方面，細(xì)菌素為多肽類或蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)可被蛋白酶分解，不易對人體產(chǎn)生毒性；細(xì)菌素具有低免疫原性，應(yīng)用于人體，免疫反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較低[4]。其次，在抗菌活性方面，某些細(xì)菌素極低濃度即可發(fā)揮抑菌作用，有效濃度可為毫微摩爾級(jí)[5]，比如一項(xiàng)研究[6]發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidoicn A對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度MIC(minimum inhibitory concentration)值僅為0.058μg/mL。而且，非常值得關(guān)注的一點(diǎn)是，細(xì)菌素很少誘發(fā)抗細(xì)菌素性菌株，這是優(yōu)于傳統(tǒng)抗菌藥物的一大優(yōu)勢。此外，某些細(xì)菌素還具有耐酸性、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌活性，如大部分乳酸菌細(xì)菌素帶正電荷，在酸性條件下較穩(wěn)定、可發(fā)揮抑菌活性；多項(xiàng)研究表明I、II類細(xì)菌素具有熱穩(wěn)定性，例如面包乳桿菌C-M2產(chǎn)生的細(xì)菌素在121℃滅菌15min后，抑菌活性仍可保留82.1%，并且該細(xì)菌素還具有廣譜抗菌活性，對革蘭陽性細(xì)菌和革蘭陰性細(xì)菌均有抑制作用[7]。

2 細(xì)菌素的分類及作用機(jī)制

隨著對細(xì)菌素研究的深入，其分類在不斷進(jìn)行修改，并且按不同的標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)行不同的分類。

較為廣泛接受的分類提出于1993年[8]，此次分類是基于分子量大小、結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性，將細(xì)菌素分為4類。I類：分子量＜5kDa的多肽，含修飾氨基酸(羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸)，具有熱穩(wěn)定性，可分為Ia、Ib兩個(gè)亞類。II類：分子量＜10kDa的多肽，具有熱穩(wěn)定性，可分為IIa、IIb、IIc三個(gè)亞類。III類：分子量＞10kDa的蛋白，對熱的穩(wěn)定性較差，通常100℃或更低溫度30s即可失活。IV類：是與碳水化合物或脂類結(jié)合的復(fù)合蛋白。在此基礎(chǔ)上，按是否含修飾氨基酸分為兩類：羊毛硫細(xì)菌素類和非羊毛硫細(xì)菌素類。羊毛硫細(xì)菌素類的產(chǎn)生需要翻譯后修飾，通常對革蘭陽性細(xì)菌具有廣譜抗菌活性；非羊毛硫細(xì)菌素類的產(chǎn)生不經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾，抗菌譜較窄。

此外，還有一些其他的分類方法，如按產(chǎn)生菌革蘭染色[10]分類，分為 革蘭陽性菌細(xì)菌素和革蘭陰性菌細(xì)菌素。前者主要由乳酸菌分泌，目前已發(fā)現(xiàn)≥8個(gè)不同種屬的乳酸菌能分泌細(xì)菌素，按產(chǎn)生菌的不同種屬可以更加細(xì)化地進(jìn)行命名和分類：如乳桿菌屬細(xì)菌素、乳球菌屬細(xì)菌素、明串珠菌屬細(xì)菌素、腸球菌屬細(xì)菌素、鏈球菌屬細(xì)菌素、片球菌屬細(xì)菌素、肉食桿菌屬細(xì)菌素、雙歧桿菌等細(xì)菌素；后者主要由大腸埃希菌產(chǎn)生。

目前，對于I類、II類細(xì)菌素的作用機(jī)制研究得相對清楚，III類、IV類細(xì)菌素的作用機(jī)制研究還不深入。關(guān)于細(xì)菌素的作用機(jī)制，主要有三種觀點(diǎn)：在靶細(xì)胞膜形成孔道、干擾靶細(xì)菌細(xì)胞壁的合成以及抑制ATP、蛋白質(zhì)、DNA、RNA等靶細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)的合成。

通常認(rèn)為細(xì)胞膜形成孔道、胞內(nèi)物質(zhì)外泄是主要抗菌機(jī)制。I類細(xì)菌素通過靜電作用吸附至靶細(xì)胞膜，與靶細(xì)胞細(xì)胞壁上lipid II(類脂II)結(jié)合形成復(fù)合物插入靶細(xì)胞膜，形成親水孔道，胞內(nèi)K+外泄，細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致ATP、蛋白質(zhì)、DNA、RNA等合成障礙，胞外液體進(jìn)入胞內(nèi)，最終使靶細(xì)胞 裂解死亡。II類細(xì)菌素形成親水孔道由靶細(xì)胞膜上的受體蛋白介導(dǎo)，其N端β折疊區(qū)域通過識(shí)別靶細(xì)胞膜上甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(MPTs)N端的胞外環(huán)，片段PA-1與靶細(xì)胞相互作用，通過靜電吸引，N-末端保守結(jié)構(gòu)域與MPTs相結(jié)合，疏水性C-末端結(jié)構(gòu)域插入靶細(xì)胞膜形成親水孔道[11]。

但目前 隨著對細(xì)菌素研究的深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素的抑菌作用，可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果[12]。比如，Nisin是典型的羊毛硫細(xì)菌素，研究發(fā)現(xiàn)其通過雙重機(jī)制發(fā)揮作用：在靶細(xì)胞膜表面形成孔道，并通過結(jié)合細(xì)胞壁合成的前體物質(zhì)lipid II抑制細(xì)胞壁的合成導(dǎo)致靶細(xì)胞分裂，這使得Nisin在納摩爾濃度即可發(fā)揮良好的抗菌活性。對于細(xì)菌素的作用機(jī)制，目前多是假說，詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

3 細(xì)菌素在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 細(xì)菌素在口腔疾病中的應(yīng)用

口腔細(xì)菌常以生物膜方式存在而致病，牙菌斑是牙周病和齲病的始動(dòng)因素，具有典型的生物被膜結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)[14]植物乳桿菌NC8產(chǎn)生的細(xì)菌素PLNC8αβ，能使牙齦卟啉單胞菌菌膜裂解、內(nèi)容物外泄，抑制牙齦卟啉單胞菌的定植和致病性。多項(xiàng)研究[15-16]表明Nisin與傳統(tǒng)抗菌藥物有協(xié)同作用，具有抑制生物被膜的特性[17]：Nisin聯(lián)合氯霉素對假中間型葡萄球菌DSM21284生物被膜有協(xié)同作用，而Nisin14V聯(lián)合青霉素主要對DSM21284浮游菌有效；1/4MICNisin+1/2 MIC多黏菌素或1/5MIC黏菌素均能抑制銅綠假單胞菌PA-01生物被膜的形成。

血鏈球菌是口腔中的益生菌，研究[18]發(fā)現(xiàn)血鏈球菌細(xì)菌素對浮游狀態(tài)下和生物膜中的牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌生長均有顯著的抑制作用。進(jìn)一步的研究[19]表明血鏈球菌細(xì)菌素作用于牙齦卟單胞菌后，可引起牙齦卟啉單胞菌形貌學(xué)性質(zhì)改變(菌體直徑減小、平均粗糙度增加、平均峰高度增加)和力學(xué)性質(zhì)改變(黏附力下降、楊氏模量降低)。

細(xì)菌素對于牙周病、齲病等的防治作用目前雖處于探索階段，但多方面的研究已提示細(xì)菌素在未來口腔疾病的治療方面有一定的應(yīng)用前景。

3.2 細(xì)菌素 在胃腸道疾病中的應(yīng)用

胃腸道微生物群落在機(jī)體藥物代謝、維生素合成、免疫調(diào)節(jié)及病原抑制等方面發(fā)揮著重要的作用，研究證明，胃腸道微生物的生態(tài)位競爭與定植菌所產(chǎn)細(xì)菌素有關(guān)[20]。例如，糞腸球菌產(chǎn)生的Bactofencin A(桿菌肽A)或Bacteriocin 21(細(xì)菌素21)能殺滅多重耐藥菌[20]，并能調(diào)節(jié)腸道菌群間的生態(tài)位競爭。

幽門螺桿菌感染可引起胃炎、胃潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤及胃癌等多種疾病的產(chǎn)生。乳酸菌可以產(chǎn)生抑制幽門螺桿菌的多肽類物質(zhì)。Sujitra Techo等[21]從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵米粉“Khanom-jeen”中分離到32株乳酸菌，15株菌株對臨床分離的幽門螺桿菌有抑菌活性，耐膽汁酸的發(fā)酵乳桿菌P43-01對幽門螺桿菌MS83和BK364菌株有廣泛的抗菌活性。這些拮抗效果與對α-糜蛋白酶和胃蛋白酶敏感的蛋白質(zhì)化合物相關(guān)。這為臨床治療頑固性的幽門螺旋桿菌感染提供了新的思路。

此外，乳酸菌細(xì)菌素對萬古霉素耐藥腸球菌[20]、腸道沙門菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌[22]也有一定的抑制作用。這也一定程度上為臨床治療相關(guān)感染性的疾病提供了新的方向。但需注意的是，由于細(xì)菌素為多肽、蛋白類大分子物質(zhì)，其能多大程度穿過腸-血液屏障到達(dá)特定部位發(fā)揮生物活性[23]，是阻礙其應(yīng)用的一大問題。

3.3 細(xì)菌素在其他疾病中的應(yīng)用

Nisin作 為研究得最深入的細(xì)菌素，已成功用于牛乳腺炎的治療，其在人體的應(yīng)用目前已引起關(guān)注。一項(xiàng)為期兩周的研究[25]證明了其用于女性乳腺炎治療的潛力：8位葡萄球菌乳腺炎患者(已接受2～4周抗生素治療，但病情未改善)隨機(jī)分為兩組，一組 接受Nisin溶液治療，另一組接受不含Nisin的溶液治療。實(shí)驗(yàn)第一日，兩組患者葡萄球菌菌落計(jì)數(shù)相似；但是到實(shí)驗(yàn)d14，接受Nisin治療組的平均菌落計(jì)數(shù)明顯低于不接受Nisin治療組。Nisin在治療人乳腺炎的初步成功預(yù)示細(xì)菌素用于人乳腺炎等皮膚軟組織感染治療有一定的可能性。

此外，F(xiàn)u等[26]應(yīng)用下頜骨骨折術(shù)后感染動(dòng)物模型表明，從植物乳桿菌分離的細(xì)菌素，能顯著減少生物被膜菌的數(shù)量和減少炎癥因子的產(chǎn)生。一定程度上證明細(xì)菌素有可能是在控制術(shù)后感染方面發(fā)揮作用。

4 細(xì)菌素的應(yīng)用限制及解決方法

大部分細(xì)菌素抗菌譜僅限于與產(chǎn)生菌親緣關(guān)系較近的病原菌，抗菌譜較窄，這是限制細(xì)菌素運(yùn)用的主要不利因素之一。通過不斷地努力，目前也發(fā)現(xiàn)不少具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌素，不僅能抑制革蘭陽性細(xì)菌，對革蘭陰性細(xì)菌也有抑制作用。如植物乳桿菌CMCC-P0002產(chǎn)生的細(xì)菌素[27]對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性細(xì)菌和銅綠假單胞菌等革蘭陰性細(xì)菌均有抑制活性。部分細(xì)菌素甚至能抑制原生動(dòng)物、真菌、病毒等細(xì)菌外微生物[28]。有研究者嘗試通過與其他抗菌藥物聯(lián)用、與螯合劑聯(lián)合等方式擴(kuò)大細(xì)菌素的抗菌譜。由于不同的抗菌機(jī)制，Nisin與某些抗生素聯(lián)用有協(xié)同作用[3]，抗菌譜擴(kuò)大到革蘭陰性菌[29]；Durancin 61A(杜蘭辛61A)與萬古霉素的混合物對MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，ATCC 700699)有協(xié)同作用，F(xiàn)IC(Fractional inhibitory concentration，部分抑 菌濃度指數(shù))值為0.3[30]。

細(xì)菌素目前分離純化困難，限制了其產(chǎn)量。細(xì)菌素的產(chǎn)生由相關(guān)基因控制，其中結(jié)構(gòu)基因可能位于質(zhì)?；蛉旧w上，也可能并存于質(zhì)粒和染色體。其產(chǎn)量除了受遺傳控制外，還與溫度、pH、培養(yǎng)基組成等環(huán)境因素有關(guān)[31-32]。乳酸菌生長的營養(yǎng)環(huán)境成分復(fù)雜，不僅增加了分離純化的難度，也增加 了生產(chǎn)成本。根據(jù)細(xì)菌素的理化性質(zhì)進(jìn)行分離純化，大致分三步[33]：第一步粗分離，初步除雜；第二步中度純化，大量除雜；第三部精制，一般采用反相高效液相色譜法。這一系列純化過程復(fù)雜，而且細(xì)菌素回收率很低、純度不高，即使是Nisin也難買到其高純度產(chǎn)品。在單菌種發(fā)酵中細(xì)菌素的產(chǎn)量一般較低，但通過與其他菌種共培養(yǎng)可以提高產(chǎn)量[34]，如有研究表明戊糖片 球菌與植物乳桿菌共培養(yǎng)的細(xì)菌素產(chǎn)量高于戊糖片球菌單菌種培養(yǎng)的細(xì)菌素產(chǎn)量。對細(xì)菌素的發(fā)酵條件、純化過程進(jìn)行優(yōu)化，提高細(xì)菌素產(chǎn)量和回收率、降低生產(chǎn)成本，使其適于工業(yè)化生產(chǎn)是科研者一直在探究的問題。也有研究者嘗試通過構(gòu)建基因工程菌來增加細(xì)菌素產(chǎn)量，通過酵母表達(dá)系統(tǒng)、乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)等實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌素的異源表達(dá)。

5 結(jié)語

全球細(xì)菌耐藥形勢愈發(fā)嚴(yán)峻，尋找新的抗感染思路具有重要意義。細(xì)菌素具有對人體無毒、低免疫原性及不易產(chǎn)生抗藥性的特點(diǎn)，部分細(xì)菌素還具有耐酸、耐高溫、抗菌譜廣等特點(diǎn)，存在成為抗菌藥物替代品的潛力。雖然目前Nisin是世界上唯一商品化的細(xì)菌素產(chǎn)品，主要用于食品防腐，但目前細(xì)菌素的研究和應(yīng)用正在向醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域擴(kuò)展[35]。在口腔感染性疾病如牙周病、齲齒，胃腸道感染性疾病如幽門螺旋桿菌感染所導(dǎo)致的胃炎、胃潰瘍等疾病，以及乳腺炎、骨折術(shù)后感染等方面，相繼有研究證明細(xì)菌素的有效性，這些研究為細(xì)菌素的抗感染治療可能性提供了依據(jù)。但因細(xì)菌素自身的局限性，如分離提純困難、產(chǎn)量低，大部分細(xì)菌素抗菌譜較窄，且細(xì)菌素為大分子物質(zhì)可能不易透過各種人體屏障發(fā)揮作用，導(dǎo)致要讓細(xì)菌素在臨床感染方面發(fā)揮較大的作用，還有相當(dāng)遙遠(yuǎn)的路程。未來尚需更多、更深入的研究。