芪薊腎康湯對轉(zhuǎn)基因免疫球蛋白A腎病小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機制研究※

張?zhí)焓?呂 靜 丁曉歡 欒 佳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2018級碩士研究生，遼寧 沈陽 110847)

免疫球蛋白A(IgA)腎病是以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為特征的免疫復(fù)合物腎小球腎炎，臨床可見肉眼血尿或鏡下血尿，可伴有不同程度蛋白尿，隨著病情的進展可出現(xiàn)腎小球硬化[1]。因此，對于IgA腎病盡早發(fā)現(xiàn)并積極治療具有重要意義。芪薊腎康湯是我們臨床治療IgA腎病的經(jīng)驗方，先前研究已經(jīng)表明芪薊腎康湯對IgA腎病模型大鼠具有確切的治療作用，并可通過抑制白細胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達抑制炎性反應(yīng),最終起到防治腎小球硬化的目的[2-3]。為進一步探討芪薊腎康湯治療IgA腎病的作用機制，我們擬通過觀察其對轉(zhuǎn)基因IgA腎病小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響進行探討，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級IgHA1-mut轉(zhuǎn)基因F1代小鼠120只，雌雄各半，12周齡，體質(zhì)量22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所制作IgHA1-mut轉(zhuǎn)基因F0親代小鼠[SCXK(京)2011-0022]，并于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心保種、繁育并鑒定為IgHA1-mut基因型陽性的F1代小鼠[4]。C57BL/6J小鼠24只，雌雄各半，12周齡，體質(zhì)量22 g，北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2013-0002。

1.2 實驗藥品 芪薊腎康湯(藥物組成：黃芪25 g，丹參20 g，牡丹皮15 g，仙鶴草15 g，重樓15 g，白花蛇舌草20 g，老頭草20g，小薊25 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科負責加工并制成湯劑。)；替米沙坦片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國藥準字J20150084)。

1.3 實驗試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 DRR047A含gDNA的定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Takara公司)；一抗：兔抗小鼠Smad2與兔抗小鼠TGF-β1(美國Cell Signaling Technology公司)、兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(英國Abcam公司)；二抗:辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3.2 主要儀器 Stratagene Mx3000P型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time PCR)檢測儀 (德國Agilent公司)；DU640型蛋白核酸分析儀(美國Backman公司)；MR1822型低溫高速離心機(法國Jouan公司)；DYY-12型多功能電泳儀、DYCP-40C型半干式碳板轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及給藥 全部小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。然后隨機取8只C57BL/6J小鼠作為空白組，再取IgHA1-mut轉(zhuǎn)基因F1代小鼠40只，分為模型組、西藥組、芪薊腎康湯低劑量組、芪薊腎康湯中劑量組及芪薊腎康湯高劑量組，每組8只?？瞻捉M及模型組按2 mL/100 g予0.9%氯化鈉注射液灌胃，西藥組按2 mg/100 g予替米沙坦藥液灌胃，芪薊腎康湯低、中、高劑量組分別按0.6、1.2、2.4 g生藥/100 g灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃28 d。

1.4.2 標本采集 各組小鼠均在灌胃14、21、28 d后隨機取2只小鼠，腹腔麻醉，迅速打開腹腔，摘取腎組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗后，部分以4%多聚甲醛固定之后保存?zhèn)溆?，剩余部分液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 腎組織Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達 采用Real-time PCR法檢測。在液氮中取50～100 mg腎組織，放入研缽反復(fù)研磨3次，加入Trizol裂解細胞，抽取腎組織細胞的總RNA。將得到的總RNA樣本根據(jù)37 ℃，15 min，85 ℃，5 s條件，使用DRR047A含gDNA的定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以得到對應(yīng)的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 4 ℃保存?zhèn)溆?。后在Real-time PCR儀上按照如下反應(yīng)條件進行擴增反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火1 min后采集熒光信號，重復(fù)40個循環(huán)。反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR預(yù)混液(10 μL)，無酶無菌水(7 μL)，對照熒光染料(0.3 μL)，上游引物(2 μL)，下游引物(2 μL)，cDNA(2 μL)，Total(23.3 μL)。使用Primer-BLAST[5]設(shè)計引物，以GAPDH作內(nèi)參照。采用2-△△CT法分析樣品mRNA的相對表達量。Smad3:上游引物序列5'-AGAAGCTCAAGAAGACGGGG-3'，下游引物序列5'-CAGTGACCTGGGGATGGTAA-3'。Smad7：上游引物序列5'-CAAACCAACTGCAGGCTGTC-3'，下游引物序列5'-CCCCAGGGGCCAGATAATTC-3'。GAPDH：上游引物序列5'-CCCTTAAGAGGGATGCTGCC-3'，下游引物序列5'-TACGGCCAAATCCGTTCACA-3'。

1.5.2 腎組織TGF-β1及Smad 2蛋白表達 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測。將剩余腎組織采用剪碎法制作腎組織勻漿[6]，先測各個細胞樣本蛋白含量(用考馬斯亮藍法[7])，再進行分離、凝固、加樣、蛋白電泳轉(zhuǎn)移、一抗及二抗反應(yīng)、透膜、曝光、洗片，最后采用Scion Image軟件分析相對灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達水平比較 見表1。

由表1可見，與空白組灌胃后同期比較，模型組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05)，Smad7 mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)。與模型組灌胃后同期比較，西藥組及芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)，Smad7 mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05)，芪薊腎康湯低劑量組僅灌胃28 d后Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達水平與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。芪薊腎康湯各劑量組組間比較，芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表達水平均明顯低于芪薊腎康湯低劑量組(P<0.05)，Smad7 mRNA表達水平均高于芪薊腎康湯低劑量組(P<0.05)，且芪薊腎康湯高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達水平改善優(yōu)于芪薊腎康湯中劑量組同期(P<0.05)。

表1 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達水平比較

2.2 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織TGF-β1及Smad2蛋白表達比較 見表2、圖1。

表2 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織TGF-β1及Smad2蛋白表達比較

由表2可見，與空白組灌胃后同期比較，模型組灌胃14、21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組灌胃后同期比較，西藥組及芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，芪薊腎康湯低劑量組僅灌胃21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表達水平明顯低于模型組(P<0.05)。芪薊腎康湯各劑量組組間灌胃后同期比較，芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后TGF-β1蛋白表達水平均明顯低于芪薊腎康湯低劑量組(P<0.05)，且芪薊腎康湯高劑量組灌胃28 d后TGF-β1蛋白表達水平均明顯低于芪薊腎康湯中劑量組(P<0.05)。

3 討 論

IgA腎病是臨床上一種常見的原發(fā)性腎小球疾病，可發(fā)生于任何年齡段人群，但以青壯年患者為主，有30%～40%的患者病情可進行性惡化，導(dǎo)致終末期腎衰竭的發(fā)生，給患者的生命健康造成嚴重威脅，生活質(zhì)量造成嚴重影響[8-9]。TGF-β1主要來源于上皮細胞、巨噬細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞，是一種多功能的細胞因子，對細胞的生長、分化及免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，IgA腎病患者中TGF-β1的高表達可以促進腎小球系膜細胞大量增殖，促進成纖維細胞的生長，加速細胞的纖維化與硬化，對患者腎功能造成嚴重損傷[10]。Smads家族是將TGF-β1信號從細胞表面受體傳導(dǎo)至細胞核的一組關(guān)鍵性蛋白，根據(jù)其在傳導(dǎo)通路中作用的不同可分為受體激活型Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8,共同介導(dǎo)型Smad4,抑制型Smad6、Smad7[11]?；罨腡GF-β1可激活Smad2、Smad3，使其與Smad4結(jié)合，進入細胞核內(nèi)激活相應(yīng)啟動子的活性，激活細胞因子受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，促進細胞因子表達，介導(dǎo)腎纖維化的過程[12-14]。有研究也證實，TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度興奮被認為是導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積的主要原因之一，其高表達還能夠上調(diào)纖維連接及層粘連蛋白合成量[15-16]。Smad7則是TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負調(diào)節(jié)蛋白，可阻止Smad2、Smad3的磷酸化，阻止TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制TGF-β1介導(dǎo)的腎小球硬化，減輕腎臟功能損害，研究表明Smad7水平升高可以明顯延緩腎小球硬化的進展[17]。本研究結(jié)果也顯示，模型組小鼠與空白組灌胃后同期比較，腎組織中Smad3 mRNA及TGF-β1、Smad2蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，Smad7 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，表明模型組小鼠出現(xiàn)了腎纖維化的變化。

1 空白組；2 模型組；3 西藥組；4 芪薊腎康湯低劑量組；5 芪薊腎康湯中劑量組；6 芪薊腎康湯高劑量組

IgA腎病屬中醫(yī)學(xué)水腫、尿血、腎風(fēng)、虛勞等范疇，病位在腎絡(luò)，屬本虛標實之證，以腎絡(luò)虧虛為本，以邪壅腎絡(luò)為標，其發(fā)病與腎絡(luò)虛滯、腎絡(luò)瘀阻有關(guān)。絡(luò)脈是氣血會聚之處，其生理功能不外聚、流、通、化，即可以貫通營衛(wèi)，滲透氣血，互化津血，是內(nèi)外溝通的橋梁，故絡(luò)脈氣血暢通，則周身四肢、五臟六腑得以滋潤而健康如常；絡(luò)脈不通，氣血不充，則五臟失和，七竅不通，留而為瘀毒導(dǎo)致絡(luò)病[18]。腎作為絡(luò)脈聚集之所，腎絡(luò)既是聯(lián)系腎臟內(nèi)外之間的橋梁，同時也是留邪的場所，腎絡(luò)氣血暢達，則腎臟氣化有序，能升能降，能開能闔，能出能入，能收能放，使氣血津液得以施布于五臟六腑、四肢百骸，以保證機體的各種生理活動[19]。腎虛絡(luò)損，瘀毒互結(jié)，氣化失職，封藏失司，導(dǎo)致腎主藏精、主水、主氣化等一系列功能失調(diào)，而引發(fā)腎臟諸病[20]。芪薊腎康湯是我們臨床常用的經(jīng)驗方，方中黃芪補氣榮絡(luò)，既能大補元氣，健脾補腎，又能利水消腫；小薊涼血止血，散瘀解毒消癰；重樓、白花蛇舌草清熱解毒，消腫止痛，利濕通淋；牡丹皮、丹參活血化瘀，舒筋通絡(luò)；老頭草清熱涼血，收斂止血止痢。諸藥合用，共奏補氣榮絡(luò)、清熱解毒、消瘀通絡(luò)的功效。

本實驗所用替米沙坦除有降低血壓的作用外，還有減少蛋白尿和延緩腎功能惡化的腎臟保護作用，其通過對腎小球血流動力學(xué)的特殊調(diào)節(jié)作用，降低腎小球內(nèi)高血壓、高灌注及高濾過，起到緩解腎小球硬化進展的作用[21]。本研究結(jié)果顯示，西藥組及芪薊腎康湯低、中、高劑量組灌胃28 d后與模型組同期比較對小鼠腎組織Smad3 mRNA、Smad7 mRNA及TGF-β1、Smad2蛋白表達均有明顯改善(P<0.05)，且芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA、Smad7 mRNA及TGF-β1蛋白表達改善均優(yōu)于芪薊腎康湯低劑量組同期(P<0.05)，芪薊腎康湯高劑量組灌胃14、21、28 d后對Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達水平改善優(yōu)于芪薊腎康湯中劑量組同期(P<0.05)，灌胃28 d后TGF-β1蛋白表達水平低于芪薊腎康湯中劑量組同期(P<0.05)。提示芪薊腎康湯對轉(zhuǎn)基因IgA腎病小鼠治療作用確切，其可能是通過多個靶點調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成，預(yù)防腎纖維化，延緩腎小球硬化進展，增加劑量或延長療程均可明顯提高療效。